قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية

Summary

نحن تصف كيفية قياس بالقرب من الغشاء والعالمية ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا النجمية في تربيتها باستخدام الانعكاس الداخلي الكامل وepifluorescence المجهري.

Abstract

يحتوي على خلايا الدماغ الدبقية. منذ فترة طويلة النجمية ، وهو نوع من الخلايا الدبقية ، والمعروفة لتوفير دور سلبي داعمة لخلايا عصبية. ومع ذلك ، أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا النجمية ويمكن أيضا المشاركة بنشاط في وظائف المخ من خلال التفاعل مع الخلايا العصبية الوظيفية. ومع ذلك ، العديد من الجوانب الأساسية لعلم الأحياء نجمية تظل مثيرة للجدل ، غير واضحة و / أو غير مستكشفة تجريبيا. مسألة واحدة مهمة هي ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا العابرين في الخلايا النجمية. هذا هو ذات الصلة لأن راسخة الكالسيوم ورسوله في المركز الثاني والمهم أنه تم اقترح أن ترتفع نجمية الكالسيوم يمكن أن تؤدي إلى الإفراج عن الإرسال من الخلايا النجمية. ومع ذلك ، لم يكن هناك أي وصف تفصيلي أو مرضية من الكالسيوم غشاء البلازما بالقرب من الإشارات في الخلايا النجمية. مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهر هو أداة قوية لتحليل الأحداث ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية يشير ضمن حوالي 100 نانومتر للغشاء البلازما للخلايا الحية. هنا ، فإننا نستخدم TIRF المجهري ويصف كيفية مراقبة بالقرب من غشاء البلازما والعالمية ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا في وقت واحد تقريبا. لمزيد من الصقل والتطبيق المنهجي لهذا النهج لديه القدرة على إبلاغ عن التفاصيل الدقيقة للإشارات الكالسيوم نجمية. قد يكون فهم مفصل لديناميات نجمية الكالسيوم توفر أساسا لفهم إذا ، كيف ومتى ولماذا النجمية والخلايا العصبية التي تعتمد على الكالسيوم الخضوع تفاعلات وظيفية.

Protocol

إجراءات تجريبية

الإجراء التجريبي تتألف من اثنين من الأجزاء الرئيسية التي تم وصفها بطريقة خطوة حكيمة أدناه.

الجزء 1 : تحضير الثقافات نجمية الحصين

لفترة وجيزة ، تم إعداد مختلطة الحصين نجمية ، عصبون الثقافات باستخدام بروتوكول راسخة ^1،2،3. نحن الإجراء الأمثل لانتاج الخلايا النجمية مثقف صحي. وينبغي تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة أدناه في بيئة معقمة مثل غطاء تدفق الصفحي.

إعداد coverslips

• coverslips 22 ملم (VWR ، 48380-068)
• بولي - D - يسين (PDL ، سيغما P0899) ، aliquots (1 ملغ / مل)
• Laminin aliquots (20 ميكروغرام / مل) : إضافة 49 مل من الماء المعقم إلى 1 ملغ / مل حل laminin (سيغما L2020) ، وجعل 1.2 مل aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية

1. PDL تذوب في الماء المعقم (50 ميكروغرام / مل)
2. الأوتوكلاف في coverslips ، التشطيف مع الماء المعقم ومكان في PDL (20 مل لمدة 100 coverslips). ترك في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
3. استبدال PDL مع الماء المعقم (3 يغسل واسعة النطاق). ثم الجافة وتخزين coverslips في 4 درجات مئوية.
4. قبل يوم من الطلاء على الخلايا النجمية coverslips مكان ، في بئر فردية عقيمة على طبق من 6 جيدا (Multiwell لوحات مسطحة القاع مع أغطية العقيمة من العلوم البيولوجية دينار بحريني). طرح 400 ميكرولتر من laminin على كل ساترة واحتضان بين عشية وضحاها ، في الحاضنة لتجنب التبخر.

تشريح

تشريح وسائل الإعلام :

• 500 مل محلول ملح ايرل المتوازن (EBSS) (1X) ، السائل (Invitrogen ، 14155-063)
• 5 مل HEPES الحل (سيغما ، H0887)

الحصين وسائل الإعلام :

• 412.5 مل متوسطة الأساسية الدنيا (MEM) (1X) ، السائل يحتوي على أملاح ايرل ، ولكن ليس الأحمر أو الجلوتامين L - الفينول (Invitrogen ، 51200-038)
• 10 مل من الجلوكوز (سيغما ، D - (+) الغلوكوز مائي SIGMA ULTRA G7528) 1 م في MEM
• 5 مل البنسلين ، الستربتوميسين (Invitrogen ، 15140-122)
• 5 مل البيروفات الصوديوم الحل (سيغما ، S8636)
• 12.5 حل HEPES 1 مل M (سيغما ، H0887)
• 5 مل N - 2 الملحق (100X) ، السائل (Invitrogen ، 17502-048)
• 50 مل مصل الخيل ، الحرارة المعطل (Invitrogen ، 26050-088)

غراء الحل :

• إضافة 5 مل من وسائل الإعلام في تشريح فيال غراء - 022 رثينجتون (LK003178 ؛ التركيز النهائي ، و 20 يو / مل) ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

1. قطع رأس الجراء الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين P1 (عادة 2 الجراء) بعد فحصها والمبادئ التوجيهية التي وافقت عليها اللوائح الوطنية والمحلية الخاصة بك رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
2. إزالة الجلد والجمجمة والدماغ مكان في صحن بيتري امتلأت وسائل الاعلام تشريح الباردة.
3. إزالة السحايا ، تشريح نصفي الكرة الأرضية وتشريح الحصين.
4. يقطع الحصين إلى ~ قطعة 1X1 ملم وهضم في محلول غراء عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة 11-13.
5. مرة واحدة على قطعة من النسيج واستقر ، وإزالة غراء بعناية وإضافة 5 مل من المتوسط ​​الحصين لإزالة كل آثار الإنزيم. كرر هذه الخطوة والمتوسطة resuspend في قرن آمون (2 مل).
6. متمزج الخلايا ~ 5 مرات حتى لا توجد كتل اليسار ، مع ماصات اللهب مصقول ثلاثة من المملون أصغر تدريجيا (1000 ميكرون ، ~ 500 ~ 300 ميكرون وميكرون).
7. مسحوق مرة واحدة ، لتمرير الخلايا من خلال مصفاة الخلية (حجم المسام ، و 70 ميكرون ، العلوم البيولوجية دينار بحريني). عدد الخلايا في 10 ميكرولتر من الايقاف. ضبط حجم الحصين المتوسطة من أجل الحصول على 400000 خلية / مل.
8. نضح في laminin قبالة coverslips ، وقبل أن يغطي الجافة ، لوحة 200 ميكرولتر من تعليق خلية في ساترة.
9. تركها لمدة 60 دقيقة نعلق في الحاضنة ، ثم قم بإضافة 2 مل من المتوسط ​​الحصين لكل بئر.
10. في اليوم التالي ، نضح الحصين المتوسطة من العمر لإزالة الخلايا الميتة والفضلات وإضافة 2 مل من المتوسط ​​قبل تحسنت الحصين الطازجة.

صيانة

Neurobasal وسائل الإعلام :

• 500 مل neurobasal (Invitrogen ، 12348-017)
• 10 مل مصل B27 تكملة الحرة (Invitrogen ، 17504-044)
• 5 مل البنسلين ، الستربتوميسين (Invitrogen ، 15140-122)
• 1.25 مل L - الجلوتامين (Invitrogen ، 25030-149)

تغذية الثقافات نجمية ، عصبون مرتين في الأسبوع مع neurobasal المتوسطة ، بعد أربعة أيام من بدء الطلاء. يحضن مسبقا وسائل الإعلام عن 30 دقيقة في الحاضنة في قارورة التهوية لكي تتوازن درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون _2.

الجزء 2 : IMAGING الكالسيوم

الحصين تسجيل العازلة : 110 مم كلوريد الصوديوم و 5.4 مليبوكل ، 1.8 ملي CaCl ₂ ، 0.8 مم MgCl ₂ ، D - 10 ملي الجلوكوز ، 10 HEPES ملم (جميع المواد الكيميائية من سيجما) 7.4 درجة الحموضة (المعدلة مع هيدروكسيد الصوديوم).

تحميل الكالسيوم صبغ المؤشر إلى الخلايا النجمية

1. وضع الثقافة في بئر على طبق من 6 جيدا مليئة 2 مل تسجيل العازلة التي تحتوي على 2.5 ميكرومتر الحصين Fluo - 4 ، ص (Invitrogen ، F - 14217) و 0.05 ٪ Pluronic ® حل F - 127 بنسبة 20 ٪ في DMSO (Invitrogen ، ف 3000MP) ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-30 دقيقة.
2. إزالة Fluo - 4 ، ويغسل حل coverslips 3 مرات مع العازلة تسجيل الحصين ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
3. ضع ساترة على الغرفة ، وتنظيف الجانب الآخر من ساترة بسائل تنظيف العدسة.
4. وضع قطرة واحدة صغيرة من زيت الغمر (الغمر مدافع TYPE النفط من Cargille) على الهدف وضعت غرفة (الغرفة مفتوح لمدة 25 ملم ساترة الجولة من الآلات وارنر) على مرحلة من مراحل المجهر (أوليمبوس IX71).
5. نظرة على الخلايا باستخدام ضوء انتقال لنرى كيف تبدو الخلايا ، وحملهم إلى التركيز. ثم تضيء الخلايا مع 488 نانومتر من مستوحد اللون (V فازة من الرؤية حتى عام) وتحديد ما إذا كان من إشارة مضان Fluo - 4 موحدة والتي يمكن اكتشافها في النجمية.
6. برنامج التحصين الموسع واستخدام الإضاءة TIRF لقياس الكالسيوم في الخلايا النجمية.

TIRF المجهري

لفترة وجيزة ، ونحن استخدام IX71 أوليمبوس المجهر مزودة كاميرا IXON Andor EMCCD DV887DCS. ويتم تحقيق السيطرة على الإثارة والحصول على الصور باستخدام TILLVision البرمجيات. يتم الجمع بين الحزم من الأرجون نانومتر 454/488/515 (100 ميغاواط) ونانومتر 442 الحالة الصلبة (45 ميغاواط) وأشعة الليزر وتسيطر حتى عام الخطوط المتعددة مع الليزر الموحد ، TIRF المكثف المنفذ المزدوج وتصفية tuneable acoustoptical وتحكم (AOTF ، وكل من حتى عام الضوئيات) وتغذى من الألياف واسعة النطاق Kineflex لدخول مكثف TIRF. نستخدم عدسة أوليمبوس 60X NA 1.45 لتحقيق TIRF. يتم ضبط الكاميرا لكسب كل خلية نجمية لتقديم أفضل إشارة إلى صور الضوضاء. وقد تم على خلفية ومبادئ المجهري TIRF استعرضت مؤخرا ^{4 ، 5.} وقد تم شراء معظم المكونات البصرية التي نستخدمها من TILL الضوئيات ، والتي هي الآن جزء من اجيلنت تكنولوجيز (http://www.till-photonics.com/). ويمكن حساب عمق الاختراق TIR من المعادلات أدناه.

د = عمق الاختراق

N1 = معامل الانكسار للزجاج

N2 = معامل الانكسار من الخلايا

= زاوية من الإصابة

ناي = الفتحة العددية الإصابة

من أجل ضمان محاذاة الليزر الأمثل لTIRF نجد أنه من المفيد أن نلاحظ 100 نانومتر الفلورسنت حبة (Invitrogen ، F8803). ونحن لا تزال موجودة وإطارات وأشرطة الفيديو من الخرز مع برنامج التحصين الموسع وTIRF المجهري. في حين TIRF ، يلاحظ المرء زيادة كبيرة في إشارة إلى الضوضاء والخرز عرض البراونية نشرها. نجد أنه من المفيد لمراقبة سلوك من الخرز مع 100 نانومتر المجهري TIRF على أساس منتظم (~ مرة في الأسبوع) للتأكد من أن يحدث TIRF الأمثل ، بدلا من الإضاءة والمائل للخطر من شأنه أن يحدث إذا كانت الزاوية الحرجة لا يساوي α (انظر الشكل 1).

تطبيق مجموعة مستقبلات البروتين يقترن

النجمية عن مجموعة متنوعة من مستقبلات (جي كيو) ، إلى جانب ^{6 و 7} بما في ذلك مستقبلات الغلوتامات metabotropic ومستقبلات P2Y (ناهض ، ATP ، ADP). تنشيط هذه المستقبلات يؤدي إلى زيادة كبيرة في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا النجمية. على سبيل المثال ، يمكن للمرء أن يلاحظ بسهولة الكالسيوم داخل الخلايا ترتفع خلال تطبيق ATP (30 ميكرون) من ^8-10 النجمية. نستخدم حل سريع التحويل من الآلات وارنر تسمى VC - 77SP نظام الإرواء السريع الخطوة (http://www.warneronline.com/index.cfm). ويمكن أن يطبق مع حلول هذا الأسلوب في أقل من 10 مللي ثانية ~.

ضبط الشكل 1. كارتون وصور فوتوغرافية من تصوير تصل. A. يظهر صورة للمجهر شنت على airtable ، في حين أن (ب) يظهر صورة للجمعية الليزر ، وأجهزة التحكم وصناديق شعاع. جيم يعرض صورة فوتوغرافية للمرحلة المجهر مع الغرفة منصة للتصوير. على اليسار يمكن أن ينظر إلى جهاز نضح سريع (جنبا إلى جنب مع السيارات السائر وأنابيب ثيتا). على اليمين هو ينظر إلى headstage من مكبر للصوت Axopatch 200A. الرسوم المتحركة schematizes مسار الضوء في إعداد وكيفية Tويتم تحقيق الحرية الدينية الدولية. وتركز أشعة الليزر على طائرة الوصل الخلفي للعدسة 60X 1،45 NA الهدف وموقعها قبالة مركز يتم ضبط بحيث يظهر في النفط الغمر في α الزاوية الحرجة. عند هذه النقطة شعاع يعاني من التأمل الداخلي الإجمالي ، ويضمحل مع λ المسافة (انظر المعادلة في النص الرئيسي) في المتوسط ​​أقل من مؤشر الانكسار. في هذه الحالة وهذا هو تسجيل العازلة المحيطة النجمية والخلايا النجمية أنفسهم. والنتيجة هي الإثارة البصرية (وبالتالي التصوير) من الجزيئات داخل نانومتر 100 ~ للغشاء البلازما. في الرسوم المتحركة للخلية يظهر ذلك بأنه "متحمس" الخضراء مستقبلات الغشاء ، في حين أن تلك داخل الخلية أو على السطح العلوي للخلية ليسوا سعداء. وقد تم توفير كامل الاعتبار عن طريق الفحص المجهري TIRF Steyer وAlmers ^4.

الشكل 2. صور من الخرز 100 نانومتر الفلورسنت المكتسبة مع برنامج التحصين الموسع وTIRF المجهري. A. عروض الصور برنامج التحصين الموسع من مجال الرؤية مع عدة عشرات من الخرز 100 نانومتر الفلورسنت. نقطة السهام الحمراء لالخرز التي قد استقروا على الزجاج وساترة ، في حين أن رؤوس السهام الزرقاء أشر إلى الخرز التي نشرها في الماء. باء يظهر صورة TIRF الحقل نفسه من عرض كما هو مبين في ألف في هذا الرأي سوى حبات ملتصقة أبداه السهام الحمراء مرئية. هذا لأن هذه قد استقروا على أن coverlsip الزجاج وبالتالي كانت داخل الحقل 100 نانومتر ~ زائل. حبات يظهر في الأسهم الزرقاء التي ليست ضمن هذه المنطقة وبالتالي هي غير مرئية في الصور TIRF. انخفاض مساحات المعرض تقديم 3D من الصور. فمن الواضح أن زيادة كبيرة في إشارة إلى الضوضاء يحدث لحبات ضمن الحقل زائل وعندما لاحظ من خلال المجهر TIRF. في الواقع لهذه الصور وهذه هي الإشارة إلى الضوضاء لبرنامج التحصين الموسع 7.1 ± 0.6 ، في حين كان لTIRF 20 ± 0.7.

الشكل 3. النجمية صور محملة Fluo - 4 الكالسيوم صبغ المؤشر المكتسبة مع برنامج التحصين الموسع وTIRF المجهري. ألف EPI صورا لمجال الرؤية مع خمسة النجمية. باء صورة TIRF من نفس الحقل نظر هو موضح في ملاحظة باء أن الصور في ألف وباء تختلف بشكل ملحوظ. هذا هو لأنه مع إنارة TIRF يتم تصوير سوى غشاء البلازما في مناطق قريبة من مقاربة ساترة الزجاج. لوحات تظهر انخفاض ATP - أثار العابرين الكالسيوم داخل الخلايا المصورة مع برنامج التحصين الموسع وTIRF المجهري.

Discussion

هو راسخ بأن النجمية عرض ترتفع الكالسيوم داخل الخلايا. ويمكن أن تظهر هذه تحدث بشكل عفوي ، من خلال نشاط الخلايا العصبية أو عن طريق تطبيق منبهات لتنشيط المستقبلات على سطح خلية نجمية ^11. مسألة واحدة مهمة ومثيرة للجدل هو ما إذا كانت الخلايا نجمية ترتفع الكالسيوم يمكن أن تؤدي إلى ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1	Tool	VWR international	48380-068
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P0899
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Reagent	Sigma-Aldrich	L2020
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid	Reagent	Invitrogen	14155-063
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red	Reagent	Invitrogen	51200-038
Penicillin-Streptomycin liquid	Reagent	Invitrogen	15140-122
Sodium pyruvate solution	Reagent	Sigma-Aldrich	S8636
HEPES solution 1 M	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
N-2 Supplement (100X), liquid	Reagent	Invitrogen	17502-048
Horse Serum, Heat-Inactivated	Reagent	Invitrogen	26050-088
PAPAIN-022	Reagent	Worthington Biochemical	LK003178
Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red	Reagent	Invitrogen	12348-017
B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid	Reagent	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid	Reagent	Invitrogen	25030-149
Cell Strainers	Tool	BD Biosciences	352350
BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile	Tool	BD Biosciences	353046
NaCl	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	Reagent	Sigma-Aldrich	P3911
CaCl2 hexahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	21108
MgCl2 hexahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M2670
HEPES free acid	Reagent	Sigma-Aldrich	H3375
D-(+)-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO	Reagent	Invitrogen	F-14217
Pluronic® F-127 20% solution in DMSO	Reagent	Invitrogen	P-3000MP
Immersion Oil TYPE DF	Microscope	Cargill Labs	16242
Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume	Tool	Warner Instruments	64-0362 (RC-21BDW)
P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater	Tool	Warner Instruments	64-0278 (P-2)
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids	Reagent	Invitrogen	F8803