البروتيوميات من التعرف على البروتينات التفاعل مع P2X2 قنوات الكاتيون يجند بوابات

Summary

وصفنا بروتوكول بسيطة لتحديد البروتينات التي تربط الدماغ إلى نهاية طول C الكامل لمستقبلات P2X2 ATP بوابات. ومن المتوقع التمديد والتطبيق المنهجي لهذه الطريقة لجميع المستقبلات P2X أن تؤدي إلى فهم أفضل للإشارات مستقبلات P2X.

Abstract

القنوات الأيونية يجند بوابات الاتصالات متشابك تكمن في الجهاز العصبي ^1. في الثدييات وجود ثلاث عائلات من يجند بوابات قنوات : حلقة السيستئين ، والغلوتامات بوابات ومستقبلات القنوات P2X ^2. في كل حالة من الارسال ملزم يؤدي إلى فتح المسام التي من خلالها تتدفق أيونات لها الكهروكيميائية التدرجات. كثير من يجند بوابات قنوات هي أيضا نفاذا إلى أيونات الكالسيوم ^{3 ، 4} ، مما يشير الى المصب الأدوار ⁵ (على سبيل المثال تنظيم الجينات) التي قد تتجاوز مدة فتح القناة. وبالتالي يمكن أن يجند بوابات قنوات الإشارات عبر جداول زمنية واسعة النطاق من الألف إلى بضعة أيام. قد تعطى هذه الأدوار الهامة التي لا بد أن نفهم كيف يجند بوابات قنوات ايون تنظم نفسها من البروتينات ، وكيف أن هذه البروتينات توليف الإشارة. الدراسات الحديثة تشير إلى أن الكثير ، إن لم يكن كلها ، القنوات قد تكون جزءا من مجمعات البروتين يشير ^6. في هذه المقالة نوضح كيفية التعرف على البروتينات التي ترتبط الجوانب C - محطة المجال مستقبلات P2X2 عصاري خلوي.

مستقبلات P2X قنوات الكاتيون ATP - بوابات وتتألف من سبع مفارز (P2X1 - P2X7). وأعرب على نطاق واسع مستقبلات P2X في الدماغ ، حيث توسط انتقال متشابك مثير وتيسير الإفراج قبل المشبكي العصبي ^7. تم العثور على المستقبلات في الخلايا P2X منفعل وغير منفعل ، والتوسط في أدوار رئيسية في إشارات العصبية ، والتهاب القلب والأوعية الدموية ووظيفتها ^8. P2X2 المستقبلات وفيرة في النظام العصبي ⁹ و هي محور هذه الدراسة. ويعتقد أن كل الوحيدات P2X لامتلاك شرائح غشاء two الممتدة (TM1 وTM2) مفصولة المنطقة خارج الخلية ⁽⁷⁾ وبين الخلايا وC N مصطلحات (الشكل 1A) ^7. مفارز P2X ¹⁰ (P2X1 - P2X7) إظهار تسلسل تناظر ما بين 30-50 ٪ على مستوى الحمض الأميني ^11. مستقبلات P2X تحتوي سوى ثلاث مفارز ، الذي هو أبسط رياضيات الكيمياء بين المستقبلات ionotropic. وP2X2 C - يتكون من 120 محطة الأحماض الأمينية (الشكل 1B) ويحتوي على عدة مواقع لرسو السفن الآراء البروتين ، ودعم الفرضية القائلة بأن P2X2 مستقبلات قد تكون جزءا من مجمعات الإشارة. لكن ، على الرغم من ونسبت عدة وظائف للمحطة - C من المستقبلات P2X2 ⁹ وقد وصفت أية دراسة الشركاء الجزيئية التي الزوجان إلى الجانب هذا البروتين داخل الخلية عبر كامل طول C - محطة. في هذه الورقة أساليب وصفنا نهج البروتين لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع كامل طول C - محطة P2X2 من المستقبلات.

Protocol

إجراءات تجريبية

الإجراء التجريبي (الشكل 2) ويتكون من أربعة أجزاء التي تم وصفها على نحو تدريجي أدناه.

الجزء 1 : Subcloning والتعبير من محطة سي P2X2 من المستقبلات.

لقد أعربنا عن طول كامل من محطة C - P2X2 المستقبلات في البكتيريا لتحديد بروتينات الدماغ الذي يربط.

1. وكان تضخيم C - محطة (مخلفات 353-472) من مستقبلات P2X2 (الشكل رقم 1) بواسطة PCR ، المستنسخة في 4NT1 pGEX (GE علوم الحياة) والتحقق منها مع التسلسل.
2. تحولت البلازميد المؤتلف في E. القولونية (BL21) للتعبير عن البروتينات المؤتلف.
3. وكانت أسهم كشط الجلسرين للبكتيريا (E. القولونية BL21) يحتوي على P2X2 CT - GST البلازميد مع طرف ماصة معقمة وتلقيح في 5 مل من لوريا ، Bertani (LB) مع وسائل الإعلام علامة انتقائية مناسبة (50 جم / الأمبيسيلين مل) ، و حضنت بين عشية وضحاها في شاكر المداري في 37C.
4. وقد طعمت الثقافات نمت بين عشية وضحاها الى 250 مل من وسائل الإعلام LB مع المضادات الحيوية المناسبة (50 ميكروغرام / مل الأمبيسيلين) وحضنت في شاكر المداري في 250 دورة في الدقيقة لمدة 2-3 ساعات في 37C حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر وصلت ~ 0،6-0،7.
5. وكان المستحث الثقافة مع IPTG 1 ملم وحضنت أخرى في 37C لمدة 3 ساعات للتعبير البروتين.
6. وكان شباك ثم في الثقافة ز 5000 لمدة 15 دقيقة في 4C (تم حفظ 1ml الثقافة لتحليل مستوى التعبير وصفت بانها "الناجم عن"). تم تجاهل طاف وكان بيليه معلق في 20 مل من المؤسسة العامة لتحلية تريس - EDTA (STE) العازلة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، 150 مم كلوريد الصوديوم (1) ، درجة الحموضة 8.0 ملي EDTA).
7. وكان التعليق في شباك ز 5000 لمدة 15 دقيقة في أنبوب 50 مل الصقر. وقد تجاهل طاف وكان بيليه تجميد شبه الجافة المعرضة لل70C بين عشية وضحاها.
8. وكان معلق و- 70C بيليه في 40 مل من الجليد العازلة تحلل الباردة (2 ٪ (W / V) sarkosyl ، 15 ملغ الليزوزيم ، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي تريس pH7.5 ، 5 ملم وDTT مثبط البروتياز حبة كاملة) وكان المحتضنة تعليق على الجليد لمدة 30 دقيقة. خلال هذه الحضانة ، وجرفت 3 مل اكسيداز - 4B Sepharose الخرز مع 20 مل من الفوسفات مخزن المالحة (PBS) ، و 20 مل T - PBS (0.1 ٪ (V / V) tritonX - 100 في برنامج تلفزيوني) ، يليه برنامج تلفزيوني. وكان معلق في برنامج تلفزيوني حبات 1 مل.
9. وكان تعليق البكتيرية تجميد إذابة 3 مرات في النيتروجين السائل وsonicated (1S / قبالة ، 30 ميكرون لمدة 3 دقائق على الجليد) والمحتضنة لمزيد من 30 دقيقة مع 4 ٪ (V / V) تريتون X - 100 ، 10 ملي MgSO ₄ و 2 مم ATP على الجليد.
10. وقد نسج على lysate ز 20000 لمدة 15 دقيقة في 4C وبيليه تم تجاهل (عينة من بيليه و 1 مل من طاف تم حفظها لصفحة SDS لاختبار كميات من البروتينات الموجودة في العصارة الخلوية والأغشية). والمحتضنة لطاف مع حبات لمدة 1 ساعة (أو بين عشية وضحاها) في 4C.
11. وقد نسج الخرز في 500 غ لمدة 5 دقائق ، وكان تجاهل طاف (تم حفظ العينة لجزء غير منضم). وكانت تغسل حبات مع خمس مرات T - PBS (تم حفظها لعناصر يغسل غسل).
12. وكان معلق ثم حبات في برنامج تلفزيوني لإعطاء 50 ٪ (W / V) الطين وتخزينها في البراد حتى 4C في الاستخدام. ويقدر تركيز البروتين مقايسة برادفورد (لكل تعليمات الشركة الصانعة).

الجزء 2 : إعداد lysates الدماغ كله

ومن المعروف أن مستقبلات P2X2 أعرب بوفرة في الدماغ ^8. في التحليلات الحالية ، سعينا إلى تحديد البروتينات التي تتفاعل مع مستقبلات P2X2 من الفئران lysates الدماغ كله (الشكل 3).

1. وكان حصاد الكبار الدماغ الفئران (تم التضحية الحيوانات وفقا لبروتوكول IAACUC التي وافقت عليها جامعة كاليفورنيا وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية) وتشطف فورا الجليد الباردة PBS (3X).
2. لليز الخلايا 10 مل (~ 5 مرات في الوزن الرطب للدماغ حصاد) من العازلة التي تحتوي على الجليد الباردة تحلل 150 مم كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 و 10 ملي EDTA ، 1 ملم EGTA ، ناف 1 ملم ، 1 ملم غ ₃ VO ₄ ، 1 ملم PMSF ، 5 ميكروغرام / مل من leupeptin ، تم إضافة 1 ٪ (V / V) NP - 40 ، والكوكتيل مثبط البروتياز قرص إلى الدماغ المقطوع.
3. وكان متجانس أنسجة المخ على الجليد مع كوب الخالط Dounce حتى تم التوصل إلى خليط متجانس من الاتساق.
4. وكان شباك lysate الخلية في 2000 ز لمدة 5 دقائق لإزالة الخلايا غير منقطعة. جمعت طاف ومرة ​​أخرى في شباك 29000 ز لمدة 60 دقيقة لإزالة الركام وعضيات سليمة الغشاء.
5. مباشرة بعد الطرد المركزي تم نقل طاف لأنبوب نظيفة. وقد تم قياس تركيز البروتين في الدماغ كله lysate بواسطة مقايسة برادفورد (عادة ~ 15 ملغ / مل).
6. وكان aliquoted lysate وتخزينها في دورتها الحادية و70C.

الجزء 3 : عزل البروتينات المرتبطة P2X2 C - الذيل

لتحديد الشركاء ملزمة P2X2 CT - GST lysates من الدماغ كله ، تم إجراء فحص المنسدلة باستخدام CT - GST ثبتوا على حبات الجلوتاثيون 4B sepharose كطعم. عن الضوابط ، وكان يستخدم وحده GST منضمة إلى الخرز.

1. وكان precleared الدماغ lysate مع حبات GST : 1 ساعة على 4C. وقد تجاهل بيليه واستخدمت طاف لإجراء المزيد من التحليلات.
2. وحضنت كميات متساوية من ضريبة المبيعات وضريبة المبيعات P2X2 CT - (10 ميكروغرام) منضمة إلى sepharose الجلوتاثيون باء 4 حبات بين عشية وضحاها مع 100 غراما من البروتينات precleared solubilised من الفئران lysate الدماغ كله ، مع تناوب على 4C في المنطقة العازلة تحلل.
3. وقد نسج الخرز في 1000 ز لمدة 5 دقائق ، وكان تجاهل طاف.
4. وكانت تغسل حبات مرة واحدة مع العازلة تحلل ومغلي في تعديل Laemli العازلة [4 ٪ (W / V) SDS ، 10 ٪ (V / V) 2 - المركابتويثانول ، 2 ٪ (V / V) الجلسرين ، 0.004 ٪ (ث / ت) وزرقة البروموفينول 0.125 M TrisCl الرقم الهيدروجيني 6،8] لمدة 5 دقائق.
5. وكانت العينات في شباك ز 5000 لمدة 5 دقائق وطاف فصل بنسبة 10 ٪ SDS - PAGE (الشكل رقم 4). وكانت ملطخة المواد الهلامية مع هلام SYPRO البروتين روبي وصمة عار (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) وتصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. وتمت مقارنة P2X2 CT - البروتينات المرتبطة مع تلك استرداد ضريبة السلع والخدمات باستخدام خالية كطعم. أربعة البيولوجية يتطابق أجريت (أي أربعة وأربعة أدمغة هبوطا سحب مستقل).

الجزء 4 : تحديد البروتينات.

ويستأصل البروتينات مفصولة الكهربائي للهلام من الجل والتي حددها مطياف الكتلة ¹² ملاحظة : عدم وجود الغبار في جميع مراحل العملية أمر بالغ الأهمية للحد من التلوث الكيراتين. ينبغي المجرب ارتداء قناع الوجه ، الشعر الصافي والقفازات في كل الأوقات وأبدا لمس المنطقة جل الاهتمام من دون استخدام قفازات.

1. ويستأصل جميع نطاقات البروتين مرئية تعافى من سحب P2X2 أسفل بشفرة حلاقة نظيفة ومقطعة (الشكل رقم 4). وقد رفعه أيضا المناطق المقابلة من هلام في ضريبة السلع والخدمات خالية هدم حارة بنفس الطريقة دون اعتبار لتلطيخ الفرقة (تم رفعه أيضا نطاقات محددة لضريبة السلع والخدمات خالية الطعم والمحددة) ، والتأكد من وجود البروتينات دون مستوى لم غاب حساسية تلطيخ.
2. وحضنت القطع هلام مع 200 ميكرولتر من 50 ملي بيكربونات الأمونيوم في 50 ٪ (V / V) أسيتونتريل (ACN) وأنابيب vortexed لمدة 15 دقيقة في RT. كرر هذه الخطوة غسل.
3. وكانت القطع هلام المجففة بإضافة 200 أسيتونتريل ميكرولتر (قطعة هلام ينبغي تقليص وتصبح غير شفافة في اللون).
4. تمت إزالة Acetontrile وقطع هلام المجففة في speedvac عن 10 دقيقة ~.
5. وحضنت ثم قطع هلام مع 30 ميكرولتر من الطازجة 10 ملي ملي DTT/10 تريس (2 - كربوكسي إيثيل) الفوسفين هيدروكلوريد (TCEP) من حجم كاف لغمر القطع. وقد ترك هذا لمدة 30 دقيقة في حمام ماء 56C.
6. القادم استعيض عن حل DTT مع 100 ميكرولتر 500 ملم بيكربونات الأمونيوم في محلول أسيتونتريل 50 ٪ وشرائح هلام غسلها مع بيكربونات ammounium.
7. كان يستنشق الحل الغسيل و 200 ميكرولتر من أسيتونتريل إضافة إلى يذوى المواد الهلامية.
8. ثم أزيل أسيتونتريل وأضيف 100 ميكرولتر الطازجة iodoacetamide 100 ملم حل ليؤلكل sulfhydryls الحرة. وشرعت هذه الخطوة لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
9. تمت إزالة حل Iodoacetamide وجرفت القطع هلام مع 200 ميكرولتر من 50 ملي بيكربونات الأمونيوم في acetontrile 50 ٪ (8.0 درجة الحموضة) لمدة 2 دقيقة بينما vortexing. وتكررت هذه الخطوة غسل.
10. بعد إزالة الحل يغسل ، وحضنت القطع هلام مع 200 ميكرولتر أسيتونتريل التي تم إزالتها ثم speedvac ل~ 10min.
11. في هذه الخطوة القطع الجل على استعداد للهضم التربسين. وحضنت في 30 القطع جل حل التربسين ميكرولتر (20 نانوغرام / ميكرولتر تركيز العمل) ووضعها على الثلج لمدة 10 دقيقة عن المواد الهلامية لتكون منتفخة بشكل جيد. تمت إزالة الزائدة والتربسين ممهى الجسيمات هلام مضافين مع 30 ميكرولتر مع 50 ملي بيكربونات الأمونيوم للاحتفاظ بها في جميع أنحاء مغمورة الهضم الذي سمح له بالاستمرار لمدة 12 إلى 16 ساعة في 37C.
12. يضاف خمسة ميكرولتر من 5 ٪ (V / V) حمض الفورميك لتنشيط الهضم التربسين والاعتقال.
13. وvortexed أنابيب دقيقة 15 ~ وطرد لفترة وجيزة لتحقيق السائل إلى أسفل الأنبوب الذي تم نقله بعد ذلك إلى قارورة نظيفة وصفت مل 0.5.
14. وأضاف المقبل 30 ميكرولتر من 0.1 ٪ (V / V) حمض الفورميك في أسيتونتريل 50 ٪ لقطع هلام ذلك كانت مجرد تغطيتها تليها vortexing مرتين لمدة 10-15 دقيقة ، مفصولة الطرد المركزي وجيزة. وتكرر هذه الخطوة مرة واحدة ، لتحل محل حمض الفورميك ، أسيتونتريل بين الخطوات.
15. تمت إزالة السائل النهائي وكلها مجتمعة الحل استخراج في قارورة واحدة. وانخفض هذا الحجم الى 30 ~ UL في speedvac. كان نموذج جاهز لعكس الكروماتوغرافيا السائلة نانو المرحلة وتحديد البروتين بواسطة مطياف الكتلة. في هذا المثال محددة ، ويتم هذا الخروج على مطياف Orbi شرك الشامل جنبا إلى جنب من ThermoFisher (الذي تم اختياره لدقتها الشامل عالية ، ودورة سريعة للكشف عن البروتين واجب وقوية عموما ميزات التشغيل) ، ويمكن بسهولة على الرغم من النماذج الأخرى والصكوك الصانعين أن يقترن مع النهج الذي وصف لهذه النقطة.
16. هي الآن في التفاصيل والمعايير لتحاليل الطيفي الشامل عرضت لفترة وجيزة. تم فصل كل الببتيدات بواسطة عكس المرحلة نانو LC (Eksigent) وكانت محملة الببتيدات على عمود عكس المرحلة C18 بمعدل تدفق ميكرولتر 3 / دقيقة. وكانت المرحلة المحمول حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ و 2 ٪ في ACN المياه ؛ النقالة المرحلة ب وحامض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ و 20 ٪ ماء في ACN. وeluted الببتيدات من العمود بمعدل تدفق 220 NL / دقيقة باستخدام الانحدار الخطي B من 5 ٪ إلى 50 ٪ مقارنة ب 90 دقيقة ، ثم إلى 95 ٪ مقارنة ب 5 دقائق ، وأخيرا الحفاظ على ثابت ب 95 ٪ لمدة 5 دقائق . تم الحصول عليها الأطياف في البيانات التي تعتمد على النمط مع فخ Orbi تستخدم لاجراء الفحوصات وMS LTQ ل MS / MS بالاشعة. وقد تم تحديد الببتيدات من خلال البحث في أطياف ضد الجرذان IPI v.3.53 قاعدة بيانات باستخدام الخوارزمية SEQUEST دمجها في حزمة البرامج Bioworks. كل الببتيد استيفاء المعايير التالية : XCorr ≥ 2 (+1) ، ≥ 3 (+2) ، ≥ 4 (+3) ، وDeltaCN> 0.1. تم تفتيش جميع أطياف يدويا تستخدم لتحديد البروتين والبروتينات لا تقبل عندما تم التعرف أقل من عقدين من الببتيدات. واعتبرت البروتينات موجودة فقط في أعقاب كل من الهبوط سحب four P2X2 والتغيب عن سحب هبوطا GST خالية لمزيد من التحليلات.

الشكل 1. التمثيل التخطيطي لمستقبلات P2X2 الوحيدات. أ الكرتون يوضح طوبولوجيا من مستقبلات P2X2 الوحيدات. المجال عصاري خلوي يتكون من مصطلحات C N و. استخدمت محطة C - P2X2 من مستقبلات (الحمراء) كطعم لهدم مقايسة. باء تسلسل الأحماض الأمينية للمستقبلات P2X2 محطة C - المستخدمة في هذه الدراسة.

الشكل 2. الرسم البياني والجدول الزمني للبروتوكول المستخدمة في التعبير ، والتنقية ، وهدم وتحديد البروتينات. نعرض الخطوط العريضة للبروتوكول مع خط الزمن. وقد أعد lysate الكبار الدماغ الفئران الطازجة مباشرة قبل استخدامها لهدم المقايسات.

الشكل 3. التمثيل التخطيطي لتحليل البروتين ثنائي لشبكة سي محطة P2X2 في الدماغ الفئران. واستخدمت محطة C - P2X2 من مستقبلات البروتين تنصهر مع ضريبة السلع والخدمات GST منضمة إلى حبات لهدم المقايسات. وقد أعد الدماغ lysate وحضنت مع البروتينات البروتينات المؤتلف وظائفها. وجرفت جزءا غير منضم مع تحلل العازلة. وقد تم تحديد البروتينات التي مطياف الكتلة.

الشكل 4. تحديد الشركاء ملزمة للمحطة سي P2X2 من المستقبلات. Sypro الجل الملون تظهر طائفة من المفترض البروتينات التي تتفاعل مع محطة سي من المستقبلات تنصهر مع ضريبة السلع والخدمات (المربع الأزرق). وترد أيضا ضوابط للحارات وحده ضريبة السلع والخدمات (المربع الأصفر) والخرز الجلوتاثيون sepharose وحدها. الأسهم تشير إلى أمثلة من العصابات التي كانت فريدة من نوعها رفعه لمزيد من التحليل الطيفي بواسطة الشامل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

القنوات الأيونية هي فئة كبيرة من البروتينات الغشاء لا يتجزأ منها. أنها تحتوي على المياه تملأ المسام التي تسمح بشكل انتقائي حركة الأيونات أسفل التدرجات الكهروكيميائية بهم عبر غشاء البلازما. أيون قنوات مفتوحة بين البوابة ودول مغلقة. يتم تشغيل الخطوة المعزولة بواسطة أ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Reagent	JT Baker	9829-02
Acrylamide	Reagent	Bio-Rad	161-0156
Ampicillin	Reagent	VWR international	VW1507-01
Ammonium Bicarbonate	Reagent	Fluka	09830
Ammonium Persulphate (APS)	Reagent	Sigma-Aldrich	A3678
Adenosine Triphosphate (ATP)	Reagent	Sigma-Aldrich	A7699
Bradford reagent	Reagent	Bio-Rad	500-0006
Bromophenol blue	Reagent	Fisher Scientific	B-392
Commassie blue R-250	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-24972
Dithiotritol (DTT)	Reagent	EMD Millipore	3860
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Reagent	VWR international	VW1474-01
Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA)	Reagent	Sigma-Aldrich	E8145
Formic acid	Reagent	EMD Millipore	11670-1
Glutathione Sepharose 4B beads	Reagent	GE Healthcare	17-5132-01
Hydrochloric acid (HCl)	Reagent	Sigma-Aldrich	H1758
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Reagent	Sigma-Aldrich	15502
Iodoacetamide	Reagent	Sigma-Aldrich	I1149
Luria-Bertani (LB) Media	Reagent	EMD Millipore	1.00547.5007
Leupeptin	Reagent	Sigma-Aldrich	L8511
Lysozyme	Reagent	Sigma-Aldrich	62971
Magnesium Sulphate (MgSO4)	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Chloride (NaCl)	Reagent	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium Flouride (NaF)	Reagent	Sigma-Aldrich	S7920
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Reagent	Sigma-Aldrich	S6508
Nonidet P40	Reagent	Fluka	74385
Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF)	Reagent	Sigma-Aldrich	P7626
Protease inhibitor tablet	Reagent	Sigma-Aldrich	S8820
Protein standard	Reagent	Bio-Rad	161-0305
Sarkosyl	Reagent	Acros Organics	61207
Screw top vial	Tool	Agilent Technologies	5182-0866
Sodium dodecyl sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	L4509
SYPRO® Ruby protein gel stain	Reagent	Bio-Rad	170-3125
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Reagent	Sigma-Aldrich	T9281
Tris base	Reagent	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T9284
Trypsin	Reagent	Promega Corp.	V5111
Tween 20	Reagent	Sigma-Aldrich	P5927
Water	Reagent	Burdick & Jackson	365-4
LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer	Tool	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Nano Liquid Chromatography System	Tool	Eksigent
B-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	M6250
Glycerol		EMD Millipore	GX0185-6