إعداد Aplysia الحسية والحركية الثقافات الخلية متعلق بالخلايا العصبية

Summary

الابتدائي ثقافات Aplysia الحسية والحركية العصبية توفير إعداد نموذج لدراسة تشكيل المشبك واللدونة متشابك في المختبر. هذا الفيديو يوضح تحديد وmicrodissection من الخلايا العصبية الحسية والحركية من Aplysia العقد فضلا عن أساليب لإنشاء وصيانة الخلايا العصبية الحسية والحركية في الثقافة.

Abstract

الجهاز العصبي للcalifornica الرخوي البحري Aplysia بسيط نسبيا ، ويتألف من حوالي 20،000 الخلايا العصبية. الخلايا العصبية هي كبيرة (تصل إلى 1 مم في القطر) ومحددة ، ذات أحجام مختلفة ، والأشكال والمواقف وتصبغات ، وتتعرض خارجيا الهيئات خلية في العقد المقترنة five موزعة في جميع أنحاء الجسم من الحيوان. وقد سمحت هذه الخصائص المحققين لتحديد الدوائر الكامنة وراء السلوكيات محددة في هذا الحيوان ^1. الاتصال الأحادي المشبك بين الخلايا العصبية الحسية والحركية هي المكون المركزي للمنعكس الخيشومية الانسحاب في الحيوان ، ومنعكس بسيطة الدفاعية التي انسحبت الحيوان الخيشومية في تحفيز استجابة لمسية للسيفون. هذا المنعكس يخضع لأشكال التعلم غير النقابي والجمعياتي ، بما في ذلك التوعية والتعود وتكييف الكلاسيكية. من فائدة خاصة لدراسة اللدونة متشابك ، ويمكن إعادة تشكيل المشبك الحسية والحركية في الثقافة ، حيث تتميز جيدا المحفزات انتزاع أشكال اللدونة التي يرتبط مباشرة في سلوك الحيوان ^2،3. على وجه التحديد ، وتطبيق السيروتونين تنتج تعزيز متشابك ذلك ، اعتمادا على بروتوكول التطبيق ، ويستمر لمدة دقيقة (على المدى القصير التيسير) ، وساعات (متوسطة الأجل التيسير) أو أيام (على المدى الطويل التيسير). في المقابل ، تطبيق FMRFamide الارسال الببتيد تنتج ضعف أو الاكتئاب التي متشابك ، اعتمادا على بروتوكول التطبيق ، ويمكن أن تستمر من دقائق إلى أيام (على المدى الطويل والاكتئاب). حجم كبير من الخلايا العصبية يسمح للتسجيل الكهربائي المتكرر للقوة متشابك حادة على مدى فترات من الأيام مع microinjection ناقلات التعبير ، siRNAs ومركبات أخرى لهدف محدد يشير الى شلالات والجزيئات وبالتالي تحديد الخطوات الجزيئية والخلايا البيولوجية التي تكمن وراء التغيرات في فعالية متشابك.

ميزة إضافية للنظام الثقافة Aplysia يأتي من حقيقة أن الخلايا العصبية المشبك ، شرح خصوصية ^4،5 في الثقافة. وهكذا ، الخلايا العصبية الحسية لا تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع أنفسهم (autapses) أو مع غيرها من الخلايا العصبية الحسية ، كما أنها لا تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع غير المستهدفة الخلايا العصبية الحركية التي تم تحديدها في الثقافة. ودوالي ، ومواقع للاتصال متشابك بين الخلايا العصبية الحسية والحركية ، وكبيرة بما فيه الكفاية (2-7 ميكرون في القطر) للسماح درس تشكيل المشبك (فضلا عن التغييرات في مورفولوجية متشابك) مع الخلايا العصبية الحركية الهدف على المستوى المجهري الخفيفة.

في هذا الفيديو ، ونظهر كل خطوة من إعداد الثقافات الخلايا العصبية الحسية والحركية ، بما في ذلك الكبار والتخدير Aplysia الأحداث ، وتشريح العقد بهم ، والهضم البروتيني من العقد ، وإزالة النسيج الضام التي microdissection ، وتحديد كل من الخلايا العصبية الحسية والحركية ، وإزالة لكل نوع من الخلايا التي microdissection ، والطلاء من الخلايا العصبية الحركية ، بالإضافة إلى ذلك من الخلايا العصبية الحسية والتلاعب neurite الحسية إلى شكل من أشكال الاتصال مع الخلايا العصبية الحركية مثقف.

Protocol

إعداد (انظر القسم الحلول في نهاية بروتوكول لتكوين حلول)

1. إعداد أطباق الثقافة. الزجاج معطف جيدا طبق ماتيك ثقافة أسفل الزجاج مع بولي - L - يسين (صنع في بورات الصوديوم). إضافة كافية تماما لتغطية الزجاج جيدا ويترك ل> 1hr (يمكن ترك بين عشية وضحاها). إزالة شاملة للبولي - L - يسين قبل الشطف في مياه البحر الاصطناعي (ASW) مرات 4-5. بعد إزالة شطف الماضي ، إضافة 2 ملل من 50 ٪ L15 (تستكمل مع الأملاح والتي تحتوي على الجلوتامين L - بتركيز نهائي 2mm و) / الدملمف 50 ٪. هذه الوسيلة يجب أن تكون الثقافة في طبق لمدة ساعة على الأقل قبل خلايا الطلاء بحيث المعاطف الدملمف الطبق.
2. تنظيف الأدوات والأطباق Sylgard مع الإيثانول ، شطف لهم جيدا مع DDH ₂ 0 ثم ضع عليها لساعة 1> تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء الثقافة.
3. إعداد الأقطاب حادة لmicrodissection من الخلايا العصبية. باستخدام مجتذب microelectrode (مثل سوتر يلهب براون P - 97) ، وسحب أقطاب ماصة الزجاج مع قطر 1.5 مم الخارجي ، 0،86-1،12 مم الداخلية و 100 ملم طول (على سبيل المثال AM كتالوج النظام # 628000 ؛ الآلات الدقيقة العالم TW150 - 4 ، 1.55 / 1.12). استخدام المعلمات التي تنتج إلكترود مع تلميح غرامة طويل وناعم من مقاومة عالية مثل عدم وجود كمية من السوائل الشعرية عند وضعها في الحل. وجود هلالة السائل يعني أن الطرف الكهربائي والأضرار الخلايا العصبية أثناء العزلة. كتاب الطبخ الكهربائي سوتر يقدم مبادئ توجيهية ممتازة لوضع برامج الكهربائي. نستخدم خيوط مربع ، والانسحاب من خطوة واحدة لتوليد كهربائية الثقافة.
4. إعداد مخدر الحل (0.35M MgCl2) ومتوسطة الثقافة (L15 تستكمل مع الأملاح والدملمف) ، والحل البروتيني (1 ٪ البروتيني نوع التاسع ، سيغما ، 1 وحدة / ملغ ، إلى التركيز النهائي من 10 وحدة / مل).
5. الحيوانات : استخدام البالغين 8-10 ز Aplysia لعزل الخلايا العصبية الحسية والخلايا العصبية الحركية LFS. استخدام الأحداث 1-4 ز Aplysia لعزل الخلايا العصبية الحركية L7. إزالة الحيوانات برفق من خزانات مياه البحر ، والمحافظة في مياه البحر (في دلو ، والدورق أو كيس من البلاستيك) لمدة لا تتجاوز 30 دقيقة قبل بداية التخدير وإجراء الثقافة.

ثقافة الداخلي

ألف التثقيف العصبونات الحسية الجنبي من Aplysia ز 8-10

1. تخدير الحيوانات لإزالة العقد : حقن 0.35 م ₂ في MgCl Aplysia الكبار (8-10 ز) باستخدام حقنة 60 مل مع إبرة قياس 18 بوصة 1.5. أدخل سفح الحيوانية بزاوية حوالي 35 درجة ، وعدم دخول عميق جدا. والهدف هو ضخ في hemocoel الحيوان دون اختراق الأجهزة الداخلية. وينبغي أن تصبح منتفخة الحيوان جدا ومريحة.
2. تشريح العقد : دبوس تخدير الحيوان على طبق تشريح ، مع دبوس (18 عيار الإبر تعمل بشكل جيد للحيوانات ز 8-10) في الرأس والذيل ، وسفح مواجهة. عقد القدم مع ملقط مسنن وقطع من خلال الجلد والنسيج الضام الكامنة وراء طول كامل للقدم (من الرأس الى الذيل) مع مقص جراحي. دبوس الجانبين باستمرار. باستخدام ملقط ومقص ، وقطع المريء والجذب الى جانب لفضح العقد. باستخدام ملقط ومقص غرامة غرامة ، وتخلص من العقد دواسة الجنبي (الخلايا العصبية الحسية هي في العقد الجنبي). يترك قدرا كبيرا من العصبية لأن هذا يسهل وضع أيديهم على العقد بعد العلاج البروتيني.
3. الهضم البروتيني من العقد : ضع في حل العقد البروتيني (10 ملغ / مل من الوحدة 1 / ملغ في L15) في مجموعة في الحاضنة 34.5 درجة مئوية (34-35 درجة مئوية على ما يرام) لمدة 2 ساعة و15min. استخدام غيض غرامة ملقط لنقل ويغسل في العقد ASW ثلاث مرات. الحفاظ على العقد في L15. علما ان فترة حضانة البروتيني يمكن أن تختلف. والغرض هو السماح لتكون النسيج الضام إزالتها بسهولة. إذا كان من الصعب جدا على desheath العقد دون الإضرار الخلايا العصبية ، وزيادة فترة حضانة البروتيني. إذا كان من السهل للغاية لdesheath في العقد ، والخلايا العصبية هي "الناعمة" ، تقليل فترة حضانة البروتيني.
4. Desheathing في العقد : نقل البروتيني - هضمها العقد إلى 60 ملم أو التي تحتوي على طبق 35mm sylgard وL15. عرض تحت المجهر ستيريو (مع إضاءة الهالوجين الخارجية) ، وإزالة العقد ودواسة دبوس باستمرار العقد الجنبي في صحن Sylgard في الاتجاه الصحيح باستخدام دبابيس الحشرات وملقط الغرامة. مع ملقط ومقص غرامة فانا الجراحية ، ورفع بعناية النسيج الضام ، وقطع عليه لكشف الكتلة الحسية. يجب الحرص على عدم لمس أي وقت مضى أو تلف الخلايا العصبية somata. إزالة أي نوع من الأنسجة الضامة الزائدة من الطبق وإضافة المزيد من المتوسط ​​، مع التأكد من عدم تعرض العقدة desheathed للهواء. الكتلة الحسية وتتألف من حوالي 200 خلية عصبية عنقودية قطرها ميكرون 40-50. تعيين طرف لتقديم "آخر" على مسافة قصيرة من ganglايون (ضمن مجال الرؤية).
5. عزل الخلايا العصبية : طريق طويل ، والثقافة ، الزجاج الكهربائي الحاد ، سحب الخلايا العصبية التي تم تحديدها واحدا تلو الآخر عن طريق لمس جسم الخلية قبالة مركز (لا أسعد) وسحب ببطء وعلى نحو مطرد سوما الخلية ، جنبا إلى جنب مع المحور ، بعيدا عن العقدة. اضغط برفق على طرف لإزاحة الخلايا العصبية من القطب.
6. طلاء الخلايا العصبية : استخدام pipetman (P10) لنقل الخلايا العصبية الفردية من طبق إلى طبق Sylgard الثقافة. قبل نقل الخلايا العصبية الثقافة الماصة والمتوسطة في تلميح بحيث يتم المغلفة غيض من البلاستيك مع الدملمف (وهذا يمنع الخلايا العصبية من الالتصاق إلى البلاستيك). نولي اهتماما كبيرا لتفادي تعريض الخلايا العصبية إلى أي فقاعات الهواء أو لأية قوات متطرفة (أي بلطف جدا يستغرق وإزالة الخلايا العصبية من pipetteman). توزيع الخلايا العصبية بشكل متساو في جميع أنحاء الطبق. استخدام القطب حاد بلطف على التوالي العمليات والاستفادة منها وصولا الى القاع.
7. الحضانة : اترك الأطباق على خشبة المسرح المجهر في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 3 ساعات. نترك لهم بشكل روتيني بين عشية وضحاها. تأكد من أن رابط الجأش المرحلة المجهر خلال هذه الفترة. تغطي المرحلة برقائق الألومنيوم لحماية بعيدا عن الضوء. نقل بلطف لهم حاضنة 18 درجة مئوية.
8. وينبغي التقيد الثقافات داخل الطبق حوالي 3 ساعات والنمو الجديدة يجب أن تكون مرئية neurite داخل 6-12 ساعة تقريبا. نمو الخلايا العصبية الحسية المعزولة التي تصل إلى الهضبة DIV 3 أو 4. لاحظ أن الخلايا العصبية الحسية المعزولة ظبية لا autapses شكل أو المشابك الكيميائية مع بعضها البعض ، على الرغم من أنها لا تشكل تقاطعات الفجوة الكهربائية.

باء إعداد cocultures الحسية العصبية الخلايا العصبية الحركية

الخلايا العصبية الحسية شكل مشبك مع الخلايا العصبية الحركية في الثقافة الهدف. الخلايا العصبية الحركية الأكثر استخداما هي الخلايا العصبية الحركية LFS والخلايا العصبية الحركية L7 ، من عقدة البطن. يتم عزل الخلايا العصبية الحركية LFS من البالغين (8-10 ز) Aplysia ، وهناك ما يقرب من 20 في الخلايا العصبية الحركية LFS العقدة في البطن. هو عزل L7 العصبون الحركي من الحيوانات (1-4 ز) الأحداث ، وهناك واحد فقط في العقد L7 البطن. LFS الخلايا العصبية الحركية هي 40-50 ميكرون في القطر ، وتتناثر بين الخلايا العصبية الحسية جنيه على مقربة من جذر العصب سيفون على السطح البطني من العقد في البطن ، وتتميز بقعة داكنة الصباغ خفية في كل سوما. وL7 العصبون الحركي هو 100-150 ميكرون في القطر ، وموجود على السطح الظهري من العقدة ، على حافة وسط الجانب الأيسر من العقدة. في حين أنه من أكثر اقتصادا لاستخدام LFS الخلايا العصبية الحركية ، وحجم كبير من الخلايا العصبية الحركية L7 هو مفيد لبعض التجارب. المحرك L11 الخلايا العصبية ، وكذلك على السطح الظهري اليسار من العقدة في البطن ، والذيلية لL7 ، هي الخلايا العصبية الحركية غير المستهدفة ، ويمكن استخدامها بشكل فعال كعنصر تحكم مع الخلايا العصبية الحسية التي fasciculates لكن لا تشكل نقاط الاشتباك العصبي الكيميائي.

1. تخدير الحيوانات لإزالة العقد. عن الخلايا العصبية الحركية LFS ، لا كما هو موضح في الخلايا العصبية الحسية الجنبي. عن الخلايا العصبية الحركية L7 ، وضخ 0.35 م ₂ في MgCl Aplysia الأحداث (1-4 ز) باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة قياس 21.
2. تشريح البطن العقد : دبوس تخدير الحيوان على طبق تشريح كما هو موضح أعلاه (باستخدام إبر عيار 21 للحيوانات الأحداث). باستخدام ملقط ومقص غرامة غرامة ، وخفض مهلة العقد في البطن.
3. الهضم البروتيني من العقد : ويتم ذلك كما هو موضح في الخلايا العصبية الحسية الجنبي ، عدا أنه يتم تقليل الوقت لهضم 1 ساعة و 45 دقيقة عن العقد من الأحداث (1-4 ز) الحيوانات.
4. Desheathing في العقد : نقل البروتيني - هضمها العقد على طبق 35 ملم أو 60 والتي تحتوي على sylgard L15. عرض تحت المجهر ستيريو (مع إضاءة الهالوجين الخارجية) ، في العقد عليها في صحن Sylgard في الاتجاه الصحيح باستخدام دبابيس الحشرات وملقط الغرامة. مع ملقط ومقص غرامة فانا الجراحية ، ورفع بعناية النسيج الضام ، وقطع عليه للكشف عن أجسام الخلايا العصبية. لعزل الخلايا العصبية الحركية LFS ، دبوس العقدة بحيث السطح البطني هو مواجهة ، مع وجود ملقط سحب غمد النسيج الضام العودة الى كشف كامل النصف من العقدة التي تحتوي على الخلايا العصبية الحركية LFS (إلى اليمين الخاص بك) ، وdesheath الأجزاء المتبقية من العقدة ، وإزالة أي نوع من الأنسجة الضامة من الطبق وإضافة المزيد من L15. لعزل أو L7 L11 العصبون الحركي ، دبوس العقدة بحيث السطح الظهري هو مواجهة ، مع وجود ملقط سحب غمد النسيج الضام يعود لفضح نصف العقدة التي تحتوي على حد سواء وL7 L11 (إلى يسارك). يجب الحرص على عدم لمس أي وقت مضى أو تلف الخلايا العصبية somata. مكان دبوس لتقديم "آخر" على مسافة قصيرة من العقدة (ضمن مجال الرؤية).
5. عزل الخلايا العصبية : إزالة الخلايا العصبية مع القطب حاد كما هو موضح في الخلايا العصبية الحسية. الخلايا العصبية هي فرق LFSerentiated من الخلايا العصبية الحسية جنيه المجاورة على أساس من بقعة صغيرة في الظلام الصباغ somata بهم. ويمكن التفريق بين الخلايا العصبية من الخلايا العصبية L7 L11 L11 أولا لأن هو الذيلية لL7 ، لأن خلايا الجسم هو أكثر L11 مستطيل الشكل في حين أن خلايا الجسم L7 هو مستدير ، ولأن محور عصبي L11 يميل إلى فرع داخل اثنان بالقرب من الخلية الجسم.
6. طلاء الخلايا العصبية : استخدام pipetman (P10) لنقل الخلايا العصبية الفردية من طبق إلى طبق Sylgard الثقافة كما هو موضح في الخلايا العصبية الحسية.
7. الإقران مع الخلايا العصبية الحسية : اسمحوا الخلايا العصبية الحركية الالتزام الطبق الثقافة على الأقل 1 ساعة. ثم إضافة الخلايا العصبية الحسية المعزولة مع pipetman ، وتقديم كل عصبون حسي مجاور لمطلي الخلايا العصبية الحركية. استخدام الزجاج الكهربائي تصويب حادة بعناية المحوار العصبية الحسية ، واقناع جسم الخلية الحسية إلى موضع بجوار الخلايا العصبية الحركية ، على مسافة مساوية أو أقل قليلا من طول محور عصبي خلية حسية. استخدام الزجاج الكهربائي ، اقناع محور عصبي حسي لتتلامس مع الخلايا العصبية الحركية ، بلطف شديد باستخدام جانب من القطب مدبب أخيرا أن يكون محور عصبي حسي الاتصال جسديا محوار من الخلايا العصبية الحركية. لا يرفع الطبق الثقافة ، ولكن بلطف بدلا زحلقة الطبق على طول المرحلة المجهر.
8. ترك الأطباق على خشبة المسرح المجهر في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 3 ساعات ونقل إلى حاضنة 18 درجة مئوية كما هو موضح في الخلايا العصبية الحسية.
9. وينبغي التقيد الثقافات داخل الطبق حوالي 3 ساعات والنمو الجديدة يجب أن تكون مرئية neurite داخل 6-12 ساعة تقريبا. الخلايا العصبية الحسية شكل نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic مع الخلايا العصبية الحركية بسرعة جدا -- حالما الخلية هي ملتصقة بما فيه الكفاية لتنفيذ حاد تسجيل الكهربائي (3-5 ساعات) ، ويمكن سجلت مثير آخر متشابك المحتملة. اتصال متشابك في تزايد مستمر حتى DIV 3 ، وبعد ذلك مستقرة حتى DIV7. وينبغي وضع الخلايا العصبية تظهر ثمرة neurite خلال الأيام 1-3 الأولى في الثقافة.

جيم إعداد الدملمف

يستخدم الدملمف كعامل نمو في الثقافة Aplysia (مشابهة لاستخدام مصل العجل الجنين في الثقافة خلايا الثدييات). يتم جمعها من الحيوانات (500 G - 1 كلغ) واسع ، وأفضل وقت لجمع الدملمف (دواير) هو خلال فصل الربيع (منتصف شهر مارس حتى يونيو). قماط الحيوان في underpad المتاح بحيث يتعرض سوى جزء صغير من الحيوان ، وتنظيف هذا الجزء من الجلد مع الايثانول ، ثم اضغط عليه بينما شخص آخر يستخدم شفرة حلاقة معقمة لإجراء شق في منطقة مكشوفة. ضغط على الحيوان بحيث الدملمف النافورات في دورق نظيفة ، والتأكد من أنها لا تتصل الجلد قذرة من الحيوان. والدملمف يملأ hemocoel الحيوان (أي حيوان هو في الأساس من الكيس الدملمف). Rewrap الحيوان مرة أو مرتين ، وجعل شق الجديدة والضغط من الصعب جمع الدملمف أكبر قدر ممكن من (جمع في كوب الجديد بحيث إذا أصبحت ملوثة ، وجمع الأولى هي لا تزال صالحة للاستعمال). يجب أن تبقى الدملمف من كل حيوان على حدة (أي ، لا الدملمف تجمع من الحيوانات المختلفة). تدور الدملمف في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة خلايا الدم. قسامة وطاف في aliquots 10 مل ، والتسمية من قبل الحيوانات وتخزينها في -80 درجة مئوية. علما بأن الدملمف المخزنة في -20 درجة مئوية يشكل يعجل في المتوسط. يجب استخدام قسامة جديدة من الدملمف مستعدة كل مستنبت الوقت ، وينبغي على إذابة قسامة قبيل إعداد المتوسط. لا اعادة تجميد بعد الذوبان.

Discussion

الإعداد الناجح للثقافات الحسية والحركية وAplysia منحنى التعلم بطيئة نوعا ما ، لأنه ينطوي على تنمية المهارات الحركية الدقيقة المرتبطة microdissection والتلاعب في الخلايا العصبية الفردية ينظر من خلال المجهر ستيريو. في تجربتنا ، فإنه يأخذ 1-3 أسابيع تقريبا من الممارسة للحصو?...

Materials