فأري النموذجي لمرض باركنسون : من آفة الدوبامين 6 - OH إلى اختبار السلوكية

Summary

ويتسبب مرض باركنسون بفقدان تعصيب الدوبامين في المخطط ، والذي يمكن أن يتسبب تجريبيا بواسطة 6 - OH الدوبامين. نحن تصف كيفية تنفيذ الآفة التجسيمي ورصد آبومورفين بفعل السلوك التناوب في الفئران. هذا النموذج هو مفيدة وموثوقة لاختبار علاجات جديدة لمرض باركنسون.

Abstract

مرض باركنسون (PD) يؤثر على ما لا يقل عن 6.5 مليون شخص في جميع أنحاء العالم ، بغض النظر عن الجنس ، والحدود الاجتماعية والعرقية والاقتصادية ، أو جغرافية. الأعراض الرئيسية ، مثل الصلابة ، ورعاش وbradikinesia ، تتطور عندما يتم فقدان حوالي 3 / 4 من خلايا الدوبامين في المادة السوداء ، وتفشل في توفير التنظيم والتنسيق السلس للدوائر مخططي السيارات. الاكتئاب والهلوسة شائعة ، والخرف في نهاية المطاف يحدث في 20 ٪ من المرضى. في هذا الوقت ، لا يوجد علاج لتأخير أو وقف تطور PD. بل إن الهدف الأدوية المتوفرة حاليا أكثر من أجل التخفيف من هذه الأعراض. قد استراتيجيات جراحية جديدة التبديل عكسية على الدوائر العصبية المتضررة وظيفيا من خلال التحفيز الكهربائي للهياكل العميق للمخ ، ولكن على الرغم من أن للمخ يمثل تقدما كبيرا ، فإنه ليست مناسبة لجميع المرضى. ولذلك يبقى من الضروري اختبار نهج جديدة في علاج الخلايا نماذج قبل سريرية.

يمكن استنساخها اضطراب أعصاب الانتقائي للمسارات الدوبامين عن طريق الحقن من hydroxydopamine - 6 (6 - OHDA) أو MPTP (1 ميثيل فينيل - 4 - 1 - ،2،3،6 tertahydropyridine) في حين أوزون المخدرات والمواد الكيميائية المؤكسدة الضارة قد تتكاثر أيضا ميزات محددة من المشتريات في القوارض. خلافا MPTP ، 6 - OHDA الآفات العصبية تسبب في خسارة عدد هائل لا رجعة فيه ، ويمكن أحادي أو ثنائي. نموذج الآفة 6 OHDA غير موثوق بها ، ويؤدي إلى عجز المحرك القوي ، وهو الأكثر استخداما على نطاق واسع بعد 40 عاما من البحث في rats1. كما يمكن الآن التفاعلات بين الخلايا المطعمة والمضيف أن تدرس بدقة أكثر في الفئران وليس في الفئران ، فقد تم نقلها إلى نموذج ^2،3 الفئران ، حيث تم مؤخرا أنها تتميز ^4.

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية آفة اليسار nigro - مخططي مسار تخدير الفئران عن طريق تقديم ببطء 2.0 ميكرولتر من OHDA - 6 من خلال إبرة حقنة صغيرة إدراج stereotaxically. فقدان الإدخال الدوبامين يحدث في غضون أيام ، ويمكن رصد أكثر من اعاقات وظيفية بعد الجراحة الأسابيع والأشهر التي تناوب تصنيف الحيوانات التي تحدثها عوامل الدوبامين ^5. هنا ، ونعرض كامل الجسم تناوب المقابل تحدث بعد 10 دقائق من ادارة واحدة تحت الجلد من آبومورفين ، وتقاس بعد شهر واحد الآفة. وتناقش النتائج والسلبيات أدناه.

Protocol

وكانت جميع المواد الكيميائية المخزنة المخفف في شكل صلب ، مثل OHDA - 6 و آبومورفين ، في الماء وتصفيته حقن معقمة داخل غطاء تدفق الصفحي ، لتجنب التلوث. بالإضافة إلى ذلك ، تم تخزين المواد سامة للأعصاب وneuroactive ، أعدت ومعالجتها والتخلص منها وفق الضوابط التي تحددها المبادئ التوجيهية الدولية ⁽⁶⁾ واللجنة المحلية للسلامة الأحيائية.

1 -- التخدير والجراحة

وpremedicated الكبار الفئران السويسرية الذكور (25 30G) مع الأتروبين (0.2 ملغ / كلغ ، SC) للحد من لهجة المبهمي وتخدير ثم مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (90-120 ملغ / كلغ) ، وزيلازين (10 ملغ / كلغ) . يتم وضع الحيوان على وسادة التدفئة التي تسيطر عليها الكترونيا (إنسايت) لضمان الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ، وتحريض التخدير يأخذ بعض دقائق. يتم فحص مستوى التخدير في جميع أنحاء الداخلي عن طريق اختبار غياب المنعكس الانسحاب. وينبغي أن جرعة مخدر ajusted لكل سلالة / مستعمرة. اعتمادا على الحيوان ومدة العملية الجراحية ، قد جرعات إضافية من الكيتامين يكون ضروريا. بعد ذلك ، يتم تطبيق ملحي (كلوريد الصوديوم 0،9 ٪) في كلتا العينين لحماية القرنيات من الجفاف واختبار غياب المنعكس طرفة في هذا اللحظة الأولى. غير حليق والفراء على رأسه بأكمله مع الانتهازي لضمان الحد الأدنى من الاتصال مع المناطق غير معقمة. يتم تطبيق مخدر موضعي (Xylocaine) إلى أشرطة الأذن لمنع عدم الراحة. مرة واحدة فقط الانسحاب وميض منعكس قد تلاشت ، مما يدل على مستوى التخدير عميقة بما فيه الكفاية لعملية جراحية (المرحلة 3) ، ويتم وضع الحيوان على الإطار التجسيمي باستخدام قطعة الفم والأذن القضبان مصممة خصيصا لهذه الأنواع (إنسايت). يتم تطبيق positionated مرة واحدة ، مرهم العيون (ماركا) لحماية العينين الحيوان في جميع الجراحة. إلا بعد أن تتأكد من أن محمية بشكل صحيح العينين ، وإجراء متابعة تطهير الجلد في المنطقة من خلال تكرار العمليات الجراحية ثلاثة طلبات من اليود البوفيدون تليها الايثانول 70 ٪ ، وذلك باستخدام القطن مسحات معقمة وبعد والتنسيب المناسب من أشرطة الأذن هي كفل من خلال اختبار للحركات جانبية للرأس (يجب أن لا يتحرك الرأس لضمان أن يتم إصلاح آمن القضبان). وسيتم التحقق من الميل ظهري بطني السليم للرئيس في وقت لاحق عندما يتم الكشف عن معالم الجمجمة. يتم إجراء شق السهمي (1.5 سم) مع مشرط معقم (شفرة # 15). يتم كشط بلطف السمحاق فوق منطقة ذات الاهتمام بعيدا مع شفرة جديدة ، ومحو نظيفة العظام مع النظرة العقيمة ومسحات القطن ، للكشف عن معالم الجمجمة : يعرف bregma كنقطة تقاطع الخيوط السهمي والاكليلية ، في حين امدا هي نقطة تقاطع الدرز السهمي وأفضل خط يمر عبر احتواء الأجزاء الأيسر والأيمن من الدرز اللامي. وركزت أولا غيض من إبرة المرجعية محاذاة عموديا في bregma ، قيد البحث والدراسة من خلال الميكروسكوب الجراحي ، وانتقلت بعد ذلك إلى تلمس نقطة لامدا. إذا تم وضع الرأس بشكل صحيح ، يجب أن يكون لامدا على المستوى ظهراني بطني نفس bregma ، وكلاهما من معالم ينبغي أن تكون بعيدة بمقدار 4.2 ملم على طول محور rostro - الذيلية. إذا لم يكن كذلك ، ينبغي أن الآذان والحانات الأنفية يمكن تخفيف وإمالة الرأس بدقة حول محور interaural ، من أجل تحقيق الموضع المطلوب ، والذي يحدد "مسطح الجمجمة" مرجعية للتدابير stereotaxical. ثم يتم وضع طرف الإبرة المرجعية في الإحداثيات المطلوب : الأمامي الخلفي (ا ف ب +0.5 ملم) والأفقي (L -2.0 ملم ، واليسار). ويتميز الموقع على الجمجمة وفتح الصغيرة (1.2 مم) مع فتحة مثقاب معقمة ، وذلك باستخدام العمل المتقطع لمنع الحرارة في المنطقة. تتم إزالة شظايا العظم بعناية مع مكشطة الأسنان وغسلها مع كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ الدافئة المعقمة. غير محملة الحل 6 OHDA (أو مركبة للحيوانات السيطرة) ومحاذاة عموديا في الجهاز التجسيمي ؛ ال 5 ميكرولتر تعقيم المحاقن هاميلتون (0.47 مم الخارجي 26s مقياس). ثم يتم إدخال رأس الإبرة (النوع 2 أو 12 درجة شطبة) في الحفرة المفتوحة ، حتى تلمس سطح حنوني ، والحاسم على نقطة مرجعية للتنسيق ظهراني البطني. الحاسم مرة واحدة هذا التنسيق ، يتم تخفيض ببطء الإبرة للوصول إلى إحداثيات المخطط (ا ف ب : +0.5 ؛ L : -2.0 وDV : -3.0 مم ، تحت سطح حنوني ^7). ثم يتم حقن محلول 6 OHDA (10 ميكروغرام في 6 OHDA كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ مع حمض الاسكوربيك 0.02 ٪) ، الذي تم إعداده وتصفيتها داخل غطاء تدفق الصفحي ، ويجب أن تكون محمية من الضوء من رقائق الألومنيوم في جميع أنحاء الداخلي ، في معدل تدفق 0.1μL/min. للحيوانات السيطرة ، يتم حقن حجم مساو من السيارة (0.02 ٪ حمض الأسكوربيك بنسبة 0.9 ٪ وكلوريد الصوديوم في الماء المعقم). بمجرد حقن ميكرولتر 2.0 بأكمله ، يتم الاحتفاظ بها في مكان الحقنة لمدة 5 دقائق قبل ان يتراجع ببطء جدا من الدماغ ، في ما لا يقل عن 5 في دقائق. يتم تنظيف الجمجمة ويتم إغلاق الجرح باستخدام خياطة # 6-0 النايلون (Shalon). لاتخاذ اضافيةالرعاية ضد العدوى ، قد يكون تطبيق مرهم مضاد حيوي المحلية ، مثل النيوميسين ، لخياطة الجلد. تتم إزالة الحيوانات من الإطار ، ونظرا 0.5 مل من المياه المالحة (sc.) لمنع الجفاف ، وأبقى الدافئة وتحت مراقبة وثيقة حتى الشفاء التام. ثم انهم يسكنون مع الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. يضاف مسكن للشرب زجاجة مياه لاول يومين بعد الجراحة (نظرا بمتوسط ​​استهلاك المياه يوميا من 5.5 لتر ، والجرعة الموصى بها من ايبوبروفين 0.03 ملغ / غرام من وزن الجسم / يوم ، ويضاف 0،82 مليلتر من 20 ملغ / مل ايبوبروفين - ابوت التعليق الى 100 مل مياه الشرب). الفئران وعادة ما يشفى بسرعة من هذا الإجراء ، والوصول للتجول كريات الغذاء والماء بسهولة. في أي حالة من الانزعاج واضح ، أو أي علامة على الإصابة ، يجب أن يتم التخلص الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية.

2 -- اختبار السلوكية

ويمكن ملاحظة على الرغم من الإعاقات الحركية بعد أسبوع ، ما سمح لفترة ما بعد الآفة من قبل شهر واحد تقدير موثوق بها مع اختبار التناوب. الحيوان يتلقى الحقن تحت الجلد من آبومورفين ناهض DA (0.5 ملغ / كلغ) ، ويتم وضعها في اسطوانة مبهمة بقطر 30 سم ، 45 سم وضعها تحت كاميرا التسجيل. ومن المهم لإزالة أي رواسب والروائح من الحيوانات المختبرة سابقا قبل كل اختبار. بعد فترة التعود 5 دقائق ، يتم تسجيل الحركات على مدى زمني 5 دقائق. وتقاس كلا مضاد والمماثل لكامل الجسم والتناوب مقارنة مع مجموعة التحكم (حقن السيارة). إذا أجريت بشكل صحيح الداخلي ، وسوف الحيوانات السيطرة لا يحمل أي التناوب ، في حين أن 6 OHDA الحيوانات lesioned ستبدأ تحول إلى الجانب المقابل ، ومنذ ناهض ينشط بالدرجة الاولى المخطط مفرط الحساسية مزالة العصب على الجانب lesioned. وتعتبر الحيوانات يحرز أكثر من 7 في الدقيقة (عرض لا يقل عن 7 لكامل الجسم المقابل تناوب في الدقيقة) كما lesioned بنجاح. ويمكن للحيوان وعاد بسلام إلى 30 دقيقة من السكن بعد الاختبار ، والتي يمكن ان تتكرر أسبوعيا. في أيدينا ، وعرضها أقل من 5 ٪ من الفئران lesioned معدلات الدوران دون المستوى الأمثل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لا يمكن أن يتحقق من جانب واحد آفة واسعة من المسار nigro - مخططي موثوق في الفئران عن طريق الحقن واحد من التجسيمي OHDA - 6 في المخطط. يمكن التحقق من مدى الآفة بعد الوفاة من قبل المناعية للهيدروكسيلاز التيروزين (الذي يحفز معدل الحد من مرحلة تجميع DA ، أي تحويل التيروسين - L لdihydroxyph...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine hydrochloride	König		90-120 mg/Kg
Xylazine hydrochloride	König		10 mg/Kg
Atropine Sulfate	Isofarma		Isofarma
6 – Hydroxydopamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich		5 μg/μL
L - Ascorbic Acid	USB Corp., Affymetrix		0.2%
Xylocaine (Lidocaine Chloridrate)	AstraZeneca		5% 50 mg
Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin)	Altana Pharma		5 mg/g + 250 Ul/g
R-(-)-Apomorphine hydrochloride	Sigma-Aldrich		0.5 mg/Kg
GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose	Novartis AG		0.33%
Ibuprofen	Abbott Laboratories		4 mg/ 100 ml drinking water
Povidine	Johnson Diversey
R-(-)-Apomorphine hydrochloride	Sigma-Aldrich		0.5 mg/Kg