استخدام SC1 (Pluripotin) لدعم MESC التجديد الذاتي في غياب LIF

Summary

وظائف عن طريق تثبيط SC1 المزدوج للرأس وجاب ERK1. نحن اختبار وظيفة SC1 في دعم خلية فأر ES التجديد الذاتي في غياب LIF وأظهرت أن SC1 غير قادرة على الحفاظ على الذات تجديد الخلايا ES الثقافات الماوس.

Abstract

تستزرع تقليديا الماوس الجذعية الجنينية (ES) مع خلايا اللوكيميا عامل المثبط (LIF) للحفاظ على الذات التجديد.

Protocol

1. إعداد لوحات التغذية MEF

1. قبل يوم واحد الخلايا ES زراعة ، أذاب one قنينة من E14.5 المشع CF - 1 الخلايا المغذية MEF (انظر إجراءاتنا بشأن كيفية أذاب خلايا ES).
2. لوحة MEF المغذية للخلايا في مناطق ذات كثافة من 10000 خلية / كذلك في لوحة 12 أيضا. احتضان الخلايا ليلا 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2. MEF الخلية وسائل الإعلام : DMEM تستكمل مع 10 ٪ ES - برنامج تلفزيوني ، والجلوتامين 1X 1X غير الأحماض الأمينية الأساسية.

2. الحفاظ على التجديد الذاتي للخلايا ES ماوس

1. فصل الخلايا ES باستخدام التربسين. بذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 50000 خلية / كذلك على لوحات معدة مسبقا MEF تغذية النمو في وسائل الإعلام (MEM خروج المغلوب تستكمل مع KSR 15 ٪ ، 4 مم الجلوتامين L - ، 0.1 ملم غير الاساسيين من الأحماض الأمينية وBME 1X) تستكمل مع SC1 على التركيز المطلوب (100 نانومتر كنا ، NM 300 ، وميكرومتر 1). علينا أيضا أن أضيف مراقبة إيجابية جيدا أن استكمل مع 1000 μ / مل من LIF. احتضان الخلايا ليلا 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.
2. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ لمدة 3-4 أيام في كل عبور. تحديث وسائل الإعلام كل 48 ساعة.
3. خلايا مرور 1:10 حتي 1:15 التربسين مع الحفاظ على كثافة مماثلة لكثافة الغرس الأولي. بعد 5 فقرات ، يمكن فحص الخلايا للتعبير عن علامات تعدد القدرات باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية نموذجية.

3. Immunocytochemical فحص علامات تعدد القدرات

1. غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
2. تحديد الخلايا مع 500 ميكرولتر من مثبت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
4. كتلة غير محددة وملزمة مع العازلة ميكرولتر 500 حظر لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. احتضان الخلايا مع 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية محددة (كنا Nanog ، Sox2 ، SSEA1 وOct4 في التخفيفات التالية : 1:500 ، 1:2000 ، 1:500 ، و1:500)
6. غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
7. احتضان الخلايا مع 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، والابتعاد عن الضوء (استخدمنا الحمير لمكافحة فأر مترافق مع فلور اليكسا ® 555 في 1:2000 والحمار المضادة للأرنب مترافق مع فلور اليكسا ® 488 في 1 : 2000).
8. غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
9. إضافة دابي (تركيز النهائي 1 ميكروغرام / مل) لغسل الماضي ، واحتضان 5 دقائق لتصور النوى.
10. تحليل الخلايا تحت المجهر الفلورسنت.

4. ممثل النتائج :

1. مورفولوجيا النتائج :

ونمت الخلايا الماوس ES (ESC R1) على الخلايا المغذية MEF في وجود إما LIF SC1 أو للحفاظ على الذات في تجديد حالة غير متمايزة. بعد مرور الثانية ، يمكن ملاحظة التمايز في الخلايا دون LIF أو SC1 (السيطرة السلبية) ، وبعد 5 الممرات وقد لوحظت في الأساس ليست مستعمرات غير متمايزة. بقي LIF (مراقبة إيجابية) مستعمرات تعامل في حالة غير متمايزة في جميع أنحاء الممرات الخلية 5. خلايا تعامل مع SC1 بتركيزات من 300 نيوتن متر أو 100 نانومتر كما بقيت غير متمايزة بعد 5 الممرات ، ومع ذلك ، فإن الخلايا المعالجة مع 1 ميكرومتر SC1 شهدت موت الخلية بعد مرور الرابع. (أنظر الشكل 2 من مذكرة التطبيق) ويلخص الجدول 1 الملاحظات الشكلية.

2. التعبير عن علامات تعدد القدرات

تم إصلاح خلايا الفأر ES المحافظة لمدة 5 الممرات وفحصها للكيمياء سيتولوجية مناعية SSEA1 ، Nanog ، وOct4 Sox2. وكان التعبير علامة مشابهة للخلايا في الحفاظ LIF. (أنظر الشكل 3 و 4 من مذكرة التطبيق)

الشكل 1 : مقارنة مورفولوجيا الخلايا أو الاحتفاظ بها في LIF SC1. لم يلاحظ أي اختلاف في التشكل.

الشكل 2 والشكل 3 : Nanog ، SSEA1 ، Sox2 ، وتلطيخ Oct4 الخلايا الحفاظ على وفاق مع SC1 أو LIF (التين 4 من مذكرة التطبيق). في الحفاظ على خلايا مماثلة التعبير SC1 تظهر علامة على الخلايا الحفاظ على تعدد القدرات في LIF.

الجدول 1

	التحكم السلبي	LIF التحكم ايجابي	SC1 1uM	SC1 300 نانومتر	SC1 100 نانومتر
1 الممر	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES
2 الممر	بعض مورفولوجيا متباينة	البريد العاديS خلية مورفولوجيا	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES
3 ممر	الغالبية العظمى من الخلايا المتمايزة	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES
4 ممر	لا مستعمرات ESC	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	لوحظ موت الخلية	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES
5 الممر	متمايزة	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	لوحظ موت الخلية	مورفولوجيا الخلايا العادية ES	مورفولوجيا الخلايا العادية ES

Discussion

يمكن استخدام SC1 جزيء صغير للحفاظ على الذات التجديد مع دولة غير متمايزة في الخلايا ES الماوس. قبل استخدام على خط الخلية التي لم تختبر ، ومع ذلك ، ينبغي معاير لتحديد تركيز الأمثل. على سبيل المثال ، نحن اختبار ثلاثة تركيزات على الخلية ES الماوس R1 ESC الخط. 100 نانومتر و 300 نانومتر التركيزات كانت قادرة على الحفاظ على خلايا ES الماوس ، ومع ذلك ، كان التركيز فيها 1 ميكرومتر السامة.

ويمكن أيضا أن تستخدم تحت SC1 تغذية خالية من الشروط.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279