في الجسم الحي مثل الفئران عضوي النمط الثقافة Wholemount الشبكية

Summary

هذه المقالة يوضح الفيديو إنشاء الثقافات عضوي النمط wholemount شبكية العين وإجراء cytospin لتحليل الآثار الناجمة خارجيا. عضوي النمط الثقافات wholemount الشبكية تقليد في الجسم الحي الوضع بشكل كبير وتسهيل إمكانية الوصول إلى شبكية العين الفئران عن التلاعب التجريبية الوقت الذي يحاصر فيه عيوب الكلاسيكية الفئران النماذج الحيوانية.

Abstract

ablations استهداف الجينات وتحليل النماذج الحيوانية هي استراتيجية محددة للالتحاق الكلاسيكية وظائف الجينات الشبكية. ومع ذلك ، وراثيا ، شبكية محددة أو مشروطة عرض نماذج الماوس خروج المغلوب غالبا الفتك المبكر أو شديدة يعانون من تشوهات ، ومنع تحليل يتجاوز المراحل الجنينية أو بعد الولادة المبكرة.

زراعة الخلايا الأولية هي بديل للتحقيق في آثار العوامل خارجيا المؤتلف التطبيقية ، overexpression من الجينات أو ضربة قاضية سيرنا بوساطة الجينات في بيئة تسيطر عليها. فصل الثقافة الخلية لديه ميزة أن يتم تخفيض الإشارات الذاتية الوصول إلى الخلايا المستهدفة ، مما يسهل التعرف على الآثار الناجمة خارجيا بعد التلاعب الدوائية. ومع ذلك ، يتم تدمير الخلية في البداية مهمة خلية التفاعلات الأنزيمية التي هضم أو ميكانيكية التفكك ، حتى إذا تم استخدام إعادة تجميعها الثقافات retinospheroid ^1.

على النقيض من ذلك ، عضوي النمط الثقافات wholemount الشبكية توفير نظام قريب من الفسيولوجية في الجسم الحي مع الحالة العصبية والتفاعلات اتصالات ^2-5 لا تزال محفوظة.

في هذه المقالة الفيديو نقدم خطوة خطوة من خلال مظاهرة للمؤسسة (1) من الجسم الحي في مثل الثقافات عضوي النمط wholemount الشبكية بما فيها خصوصيات تشريح الفئران الجنينية العينين ، والكبار وبعدها (2) إجراء تفارق وcytospin لتحليل الخلايا العصبية موت الخلايا المبرمج وتكاثر الخلايا في شبكية العين wholemounts عضوي النمط ، على سبيل المثال بعد الثقافة في وجود عوامل خارجيا المؤتلف التطبيقية.

Protocol

جميع المعدات والكواشف يتعين شراؤها معقمة أو يحتاج إلى الحرارة أو البخار أو تعقيمها تعقيم مع ETOH 70 ٪.

الدولة من الكتاب والتي أجريت على حيوانات التجارب وفقا للمجتمعات الأوروبية توجيه المجلس (86/609/EEC) ، في أعقاب المبادئ التوجيهية لمعاهد الصحة القومية بشأن رعاية واستخدام الحيوانات لإجراءات تجريبية والانظمة التي وضعتها المؤسسات الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة (IACUC) في جامعة دويسبورغ إيسن (ألمانيا).

الجزء 1 : سمل عيون الفئران من المراحل التنموية المختلفة

قلع العيون الجنينية

1. يتم تعيين وقت التزاوج والحمل حتى تم تعيينه في صباح اليوم الذي تم الكشف عن المكونات المهبلي في الحمل 0 التزاوج الإناث اليوم.
2. والتضحية من قبل الإناث الحوامل خلع عنق الرحم عند وضع الأجنة قد وصل إلى مرحلة المطلوب (هنا : يوم الجنينية (E) 15) ، والثابتة على متن ⁶ الشمع.
3. هو مبلل جدار البطن مع ETOH 70 ٪ ، وقطع على طول خط الوسط ويتم إصلاح اللوحات أفقيا الجلد بواسطة المسامير ^6.
4. تتم إزالة uterusses من البطن ، وفصل ونقل إلى دورق مع PBS الباردة ^6.
5. يتم فصل الأجنة ، ونقل إلى طبق بتري وجدار الرحم والأغشية الجنينية يتم إزالتها بعناية من خلال استخدام الملقط ^6.
6. وقتل الأجنة بواسطة قطع الرأس.
7. وتكون منزوعة النواة عيون استخدام الملقط ، ودفع غرامة المنحني "تقشير" عيون من تجويف العين.

قلع العيون بعد الولادة وتعليم الكبار

1. وقتل الشباب الصغار من قبل الجراء ، وكبار السن والبالغين بواسطة قطع الرأس خلع عنق الرحم.
2. يصل إلى مرحلة ما بعد الولادة P15 ، نقطة عند الساعة الفئران فتح عيونهم ، والشقوق العين يجب أن تكون فتحت ميكانيكيا من خلال استخدام الملقط وتوسيعها من قبل اثنين من التخفيضات عرضية من الجفون مع مقص الربيع.
3. ومنزوعة النواة العينين بمساعدة ملقط المنحني ، وتطبيق الضغط على المدار.

ملاحظة : كما في يوم ما بعد الولادة 2 ، عظام المدارية لا تزال الغضروفية ، فمن المهم عدم تطبيق الكثير من الضغط بينما كانوا يحاولون إزالة العينين.
على النقيض من ذلك ، في فئران بالغة ، والعظام هي شركة المدار. وبالتالي ، من أجل استأصل العينين فإنه يكفي لممارسة الضغط على المدار دون توسيع الشقوق العين مقدما.

الجزء 2 : تشريح الفئران الجنينية لشبكية العين ، ما بعد الولادة وتعليم الكبار

تشريح شبكية العين

1. توضع في صحن عيون بيتري صغيرة مع برنامج تلفزيوني العقيمة وتتم إزالة طبقات العين المحيطة تشريح تحت المجهر.
2. لإزالة طبقات العين الخارجي ، في مراحل ما بعد الولادة والعيون الكبار في العصب البصري يجب أن يكون قطع من جانب مساعدة من مقص الربيع أو بواسطة ملقط مقروص قبالة أقرب إلى أساس وقت ممكن.
3. بدوره العين ، بحيث الجانب الخلفي مع ثقب في العصب البصري حيث يقيمون أصلا باتجاهك. دخول الفضاء تحت الشبكية بين شبكية العين وظهارة الصباغ مع اثنين من نصائح ملقط دقيق جدا من حيث الموقع في العصب البصري اخترقت طبقات العين.
   
   ملاحظة : عادة ، يمكن أن تكون الظهارة الصبغية التعرف عليها بسهولة من خلال لونه الداكن. في بعض سلالات متحولة ماوس -- خاصة في الحيوانات البيضاء -- وهذا قد طبقة الصباغ ومع ذلك ، لا تكون ملونة ، وبالتالي قد لا تكون جاهزة للكشف.
4. إزالة الصبغة مع ظهارة الغشاء المشيمية المرفقة والصلبة التي تمزق بعناية إما إلى جنب مع كل من الملقط.
5. تقشر طبقات يصل إلى مستوى القرنية ، ثم اتجه الكأس إلى جانب العين وإزالة عدسة القرنية مع ظهارة الصباغ ، والأغشية المشيمية والصلبة ، في حين يمسك الكأس المتبقية الشبكية بواسطة الملقط الأخرى.
6. فهم الزجاجي مع عدسة صغيرة وحين تمزق بالملقط ، والحفاظ على wholemount الشبكية في مكان مع ملقط الثانية.
   
   ملاحظة : عند تشريح العين الجنينية ، تأكد تماما لإزالة الثلاثي ، وخيمة مثل الضفيرة الشعرية تحت الجسم الزجاجي مع الزجاجي.
   
   في العين البالغين ، ويجب أن يكون زجاجي على الجانبين اغتنامها والرعاية يجب أن يؤخذ على عدم الزجاجي للاختراق مع نصائح من الملقط ومضمونه هو لزج والعصي على ملقط ، مما يعوق زواله.
7. للثقافة wholemount عضوي النمط يتم جمعها من أكواب شبكية العين في لوحة 96 - جيدا تحتوي على 200 ميكرولتر Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(أنظر أدناه).

ملاحظة : بين تشريح شبكية العين الفردية ، والحفاظ يتم تشغيل لوحة جمع 96 - جيدا يحتوي على مستنبت في الحاضنة والرقم الهيدروجيني للمستنبت بواسطة CO ₂ عبر نظام الكربونات.

الجزء 3 : الفئران wholemount الشبكية عضوي النمطثقافة

1. تحضير 500 مل من قبل الثقافة المتوسطة الترجيح 7.8g Dulbecco لتعديل النسر / خليط المغذيات F - 12 HAM (DMEM) و ₃ و 0.6g NAHCO حل سواء في المياه MiIliQ. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.15. إضافة 50mg الاشتقاق transferin ، 50μl putrescin (المخزون : 60mg/ml) ، 50μl زيلونيت الصوديوم (المخزون : 52μg/ml) والبروجسترون (المخزون : 60μg/ml) ، و 2.5 مل gentamicine (200 ملم) تحت غطاء محرك السيارة. مزيج من خلال تصفية وتصفية زجاجة أعلى. مباشرة قبل الاستخدام إضافة 10μl الجلوتامين (200 ملم) في مستنبت مل.
   
   ملاحظة : يمكن تخزين هذا المصل المتوسطة والانسولين الحرة في 4 درجة مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع ، وتستخدم لاستقراء تجارب الخلايا الانسولين كما لا يصد الآثار. إذا كان المطلوب من الحضانة لمدة أطول من wholemounts 24H ، وسوف يتم تقييم معدلات الوفيات تكون الخلية ، مصل الانسولين (مثل الجنين مصل العجل ؛ FCS) وينبغي أن يضاف أو المكملات الغذائية لتحسين معدلات البقاء على قيد الحياة.
2. قبل البدء في الثقافة ، هي wholemounts الشبكية قبل المحتضنة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 200 ميكرولتر الدافئة DMEM الرقم الهيدروجيني المتوازن ، الذي يتضمن هيالورونيداز 0.5mg/ml إلى ما قبل هضم هيالورونيداز التي تحتوي على الغشاء الداخلي والخارجي يحد من الدبقية ller M الخلايا ، واختراق لتيسير خارجيا المواد التطبيقية.
3. يتم نقلها إلى لوحة شبكية العين 24 هيالورونيداز بشكل جيد مع وأقل عدد ممكن ، ومثقف عضوي النمط wholemounts كما في تعريف 2ml كيميائيا والمتوسطة Dulbecco النسر تعديلها.
   
   ملاحظة : للحصول على نقل شبكية العين ، واستخدام ماصة 1ml وقطع رأس ماصة بضعة ملليمترات الى توسيع الفتحة. للعينين الجنينية ، وهي غيض 200 ميكرولتر ماصة كافية. وينبغي مملس حواف القطع الإدراج والتواء من طرف ماصة الثانية.
   لثقافات 24-48 ساعة على المدى القصير ، يمكن تنفيذ كافة الخطوات على مقاعد البدلاء ، ولكن إذا كان التلوث من الثقافات إذا ما تبين أن هناك مشكلة واحدة يجب أن تعمل تحت غطاء محرك السيارة.
4. تتم المحافظة على الثقافات عن 24-48 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو من 5 ٪ CO ₂ وعلى سبيل المثال تعرض لمعاملة الدوائية مع العوامل المترابطة.

الجزء 4 : تفكك الشبكية wholemounts مثقف

1. بعد وقت الثقافة المطلوبة ، يتم جمع شبكية العين في أنابيب أسفل إيبندورف 2ml مع الجولة التي تحتوي على 850 برنامج تلفزيوني و 50 ميكرولتر ميكرولتر المصل البقري albumine (BSA و 30 ملغ / مل).
2. مكان أنابيب إيبندورف في شبكية العين مع كتلة التدفئة ، واشتدت في 37 درجة مئوية.
3. إضافة 25 كولاجيناز ميكرولتر (200 U / مل) و 25 ميكرولتر هيالورونيداز (20mg/ml) لكل أنبوب إيبندورف وتبدأ شبكية العين في عدم الربط بين تعليق خلية واحدة بنسبة 3 يمر من خلال ماصة باستير siliconized.
4. أضف 10 ميكرولتر التربسين (1mg/ml) ، وانتظر لمدة 3-5 دقيقة ، ثم 3-5 مرات ماصة ببطء صعودا ونزولا مع siliconized ماصة باستير أن تنأى ميكانيكيا الأنسجة.
5. أضف 10 ميكرولتر الدناز الأول (5mg/ml) ، والانتظار مرة أخرى لمدة 3-5 دقيقة ، ثم 3-5 مرات ماصة ببطء صعودا ونزولا مع siliconized باستور ماصة.
   
   ملاحظة : فترة حضانة لتفارق الأنزيمية يختلف ويتوقف على حجم العينين والمرحلة التنموية ، على التوالي. الاختيار مرحلة الهضم الأنزيمي من الأنسجة التي pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
6. إذا كان التعليق الخلية ليست متجانسة من قبل الآن ، ولكن لا يزال يحتوي على المجاميع الخلية الرئيسية ، إضافة إضافية التربسين 10 و 10 ميكرولتر ميكرولتر أولا الدناز
7. عندما يتم إصلاح نظام التعليق الخلية متجانسة ، توقفت عملية الهضم من الأنسجة بإضافة من 10 ميكرولتر EDTA (0.5 م) ، تتم إزالة أنابيب إيبندورف من المدفأة وتعليق الخلية التي 1H إضافة 1ml الطازجة والباردة الجليد بارافورمالدهيد 8 ٪ (منهاج العمل) في درجة حرارة الغرفة على شاكر التناوب.

الجزء 5 : الغسل من الايقاف الخلية ينفصل

1. يتم طرد تعليق خلية لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية و 0،2 في إطار التعاون الإقليمي في أجهزة الطرد المركزي التبريد.
2. يتم تجاهل وطاف بيليه هو إعادة معلقة في برنامج تلفزيوني يتضمن 1ml BSA 3mg/ml.
3. بعد تكرار هذه الخطوات الغسيل مرتين ، وأخيرا إعادة علق بيليه في 500 ميكرولتر PBS BSA 3mg/ml يتضمن ، EDTA 5mM و 0.1 ٪ أزيد الصوديوم.

ملاحظة : إضافة حمض الصوديوم تتيح تخزين تعليق خلية لعدة أيام في 4 درجات مئوية. ومع ذلك ، إذا كان تلطيخ immunocytochemical ستتبع ، لا تقم بإضافة حمض الصوديوم إلى المخزن المؤقت إعادة تعليق ، لأن هذا يؤدي إلى فقدان جودة التلوين.

الجزء 6 : Cytospin من الايقاف لموت الخلايا المبرمج خلية التحليل الكمي والانتشار

1. يتم إدراج شريحة المجهر بلوري نهاية ، وهو مرشح cytospin مع واحد أو اثنين من الثقوب ، وقمع cytospin في مقطع الشريحة cytospin. إغلاق مقطع شرائح وتوضع في الدوار cytospin.
2. غير المتجانس تعليق الخلية التي نأت pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
   
   ملاحظة : اعتمادا على مرحلة تنموية من شبكية العين ، قد توقف خلية من التفكك الداخلي ضرورةأن تضعف مع برنامج تلفزيوني للحصول على عدد معدود من الخلايا.
3. يتم تطبيق قسامة (100 ميكرولتر) من خلية إلى وقف قمع cytospin.
   
   ملاحظة : عندما pipetting تعليق الخلية إلى القمع ، غيض من ماصة ينبغي أن تصل إلى جميع الطريق وصولا الى الجزء السفلي من القمع. فمن المهم عدم دفع من خلال الضغط على نقطة الثانية من ماصة وهذا يخلق فقاعات الهواء ، والتي سوف تكون مرئية في بقعة الخلية بعد cytospin ويعوق عدد الخلايا.
4. ورصدت الخلية تعليق على شريحة عند 700 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق.
5. ويمكن لتحديد تأثير العوامل خارجيا تطبق على مستويات الخلايا تكون ملطخة الخلايا مع 4 '،6 - Diamidino - 2 - phenylindole (دابي ؛ 2μg/ml) ، مزودة الفلورسنت المتوسطة المتزايدة. ويمكن تحديد التغييرات في الخلايا خلية العد ما لا يقل عن 1000 الخلايا (التي تضم ما لا يقل عن 10 pycnotic النوى) في الخلية بقع cytospin ويتم احتساب معدل موت الخلايا كنسبة مئوية من مجموع تعداد الخلايا ^3،4.
   
   ملاحظة : بدلا من ذلك ، يمكن تقييم توزيع نوى أفكارك في flatmounts ³ أو ناظم البرد sections4 من wholemounts الشبكية بواسطة مثقف TDT بوساطة dUTP وسم نهاية نك (النفق).
6. للكشف عن انتشار الخلايا ، يمكن إضافة BrDU (5 ميكرون) 6H قبل نهاية للثقافة ودمج BrdU تصور cytospins من الخليط في خلية تلوين immunocytochemical ان استخدام أجسام مضادة لمكافحة BrDU (مثل البنك التنموي الدراسات ورم هجين ، أيوا ، الولايات المتحدة).
7. يمكن لتأثير العلاج على مختلف أنواع الخلايا الشبكية يمكن تصور في cytospins بواسطة أضداد معينة مثل الخلايا العصبية Brn3a (العقدة علامة الخلية) أو opsin (مبصرة علامة) وcounterstaining مع دابي.

الجزء 7 : النتائج الممثل

الشكل 1 : خطوات في إعداد wholemounts الفئران الشبكية عضوي النمط
ورئيس الفأر مع كلتا العينين. باء العين الفئران مع الجانب العدسة ، تكون كل طبقات لا تزال في مكانها. C العين الفئران من المؤخر مع العصب البصري لا تزال تعلق. مد العين والصلبة مع الفئران الظهارة الصبغية إزالتها جزئيا. E الشبكية مع الفئران القرنية ، والصلبة الصباغ الظهارة إزالتها تماما ، ولكن العدسة والجسم الزجاجي لا تزال في مكانها. إزالة F الفئران كوب wholemount الشبكية مع العدسة والجسم الزجاجي. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

الشكل 2 : تحليل الثقافات عضوي النمط wholemount الشبكية بواسطة cytospin والمقاطع
لتحليل الخلايا ، هي ملطخة cytospins من الايقاف الخلية فصلها بواسطة دابي ويمكن تمييزها عن طريق تجزئة النوى pycnotic النووية أو التكثيف لونين (النصال في A). أو يمكن أن يتعرضوا flatmount الشبكية (F) إلى النفق وcounterstained مقايسة مع دابي (E) ، بدلا من ذلك ، المقاطع wholemount (الفئران اليوم شبكية العين بعد الولادة (P) 2 م). يمكن لتأثير العلاج على مختلف أنواع الخلايا الشبكية يمكن تصور في cytospins بواسطة أضداد معينة مثل الخلايا العصبية للخلية العقدة علامة Brn3a (الأسهم في B) GCL ، طبقة الخلايا العقدية ؛. INL ، المحتملين الطبقة النووية الداخلية. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.

Discussion

ميزة عضوي النمط شبكية الفئران ^2-5 الثقافات wholemount أكثر من التفكك ، أحادي الطبقة ، أو إعادة تجميعها retinospheroid - 3D الثقافات كروي ¹ يكمن في الحفاظ على التفاعلات العصبية واتصالات ، محاكاة الوضع في الجسم الحي. بالمقارنة مع التقارير السابقة ² ، مقالتنا الف...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Animal	Charles River Laboratories
Dissection microscope	Tool	Carl Zeiss, Inc.
PBS	Reagent	Sigma-Aldrich		PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham	Reagent	Sigma-Aldrich	D 8900	DMEM / F-12
Apo-transferin	Reagent	Sigma-Aldrich	T 1147
Putrescin	Reagent	Sigma-Aldrich	P 5780
Sodium selenite	Reagent	Sigma-Aldrich	S 9133
Progesterone	Reagent	Sigma-Aldrich	P 6149
Gentamicine	Reagent	Invitrogen
L-Glutamine	Reagent	Invitrogen	25030-024	200 mM (100X), liquid
Bovine serum albumine (BSA)	Reagent	Carl Roth Gmbh	8076.3	30 mg/ml
Collagenase	Reagent	Sigma-Aldrich	C 0773	200 U/ml
Trypsin	Reagent	Sigma-Aldrich	T4799	From porcine pancreas; 1 mg/ml
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H 3884	200 mg/ml
DNase I	Reagent	Roche Group	1 284 932	10 mg/ml
EDTA	Reagent	Sigma-Aldrich	E 6511
Silicone solution	Reagent	SERVA Electrophoresis	35130
Paraformaldehyde (PFA)	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).
4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Reagent	Sigma-Aldrich	D 0542	DAPI
Fluorescent Mounting Medium	Reagent	Dako	S3023
BrDU	Reagent	Sigma-Aldrich	B 9285
96-well plates	Tool	Falcon BD	3072
24-well plates	Tool	Falcon BD	3047
Pasteur pipettes	Tool	Brand GmbH	747720
Forceps DUMONT #5	Tool	Fine Science Tools	11252-30	bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7	Tool	Fine Science Tools	11271-30	curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors,straight, 8cm	Tool	Fine Science Tools	15000-00	fine, small straight blades
Standard scissors, straight, sharp/blunt	Tool	Fine Science Tools	14007-14	Use for decapitation or cervical dislocation
Eppendorf tubes	Tool	Eppendorf		2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin
Cooling centrifuge	Tool	Eppendorf
Rotation shaker	Tool	CAT
Cytospin	Tool	Thermo Fisher Scientific, Inc.