في تقطير التحت خلوية الموقع من خلايا الثدييات وغير ملتصقة منتسب -

Summary

في الوضع الطبيعي للتجزيء التحت خلوية خلايا الثدييات على coverslips المجهر يسمح التصور من توطين البروتين.

Abstract

ويقترن ثيقا لتوطين وظيفة البروتين البروتين. على الرغم من تقييد بعض البروتينات لموقع معين أو مقصورة التحت خلوية ، العديد من البروتينات موجودة في عدد السكان نشرها بحرية في التبادل الحر مع مجموعة من السكان دون أن يرتبط بشكل وثيق مع ملك التحت خلوية معينة أو هيكل في تجزيء التحت خلوية الموقع يسمح التصور من ويمكن تقسيم البروتين تكشف أيضا البروتين الفرعي لتوطين السكان الذين هياكل محددة. على سبيل المثال ، يمكن إزالة بروتينات هيولي قابلة للذوبان والبروتينات النووية التي عقدت رابطة فضفاضة تكشف مستقرة لبعض عوامل النسخ مع لونين. يمكن هضم لاحقة من الحمض النووي في بعض الحالات تكشف بالتعاون مع شبكة من البروتينات والرناوات التي تسمى مجتمعة سقالة النووية أو مصفوفة النووية.

نحن هنا وصف الخطوات المطلوبة خلال تجزيء في الوضع الطبيعي للخلايا الثدييات وغير ملتصقة ملتصقة على اساس coverslips المجهر. ويمكن تحقيق التصور البروتين باستخدام أجسام مضادة معينة أو البروتينات الفلورية والانصهار المجهري مضان. الأضداد و / أو الأصباغ الفلورية والتي تكون بمثابة علامات للمقصورات محددة أو هياكل تسمح ليتم تعيينها توطين البروتين بالتفصيل. تجزيء في الموقع ويمكن أيضا أن يقترن الغربية النشاف لمقارنة كميات من البروتين موجودة في كل جزء. ويمكن هذا النهج بسيطة تكشف البيوكيميائية الجمعيات التي لم يتم كشفها إلا ستبقى.

Protocol

أولا التحضير للتجزيء

هذا المقطع يصف إعداد بولي - L - يسين coverslips المجهر المغلفة والمرفق من الخلايا قبل التجزئة. يمكن إذا اقتضى الأمر أن تكون الخلايا transfected عابر مع ناقلات بروتين تعبير إما قبل أو بعد المرفق.

A. إعداد بولي - L - يسين coverslips المغلفة

1. يعد حل 1mg/ml بولي - L - يسين في الماء المقطر.
2. coverslips معطف نظيفة مع بولي يسين - L التي تفرخ لهم في حل ما لا يقل عن 1 ساعة على منصة هزاز عند 22 درجة مئوية.
3. غسل coverslips المغلفة مع الماء المقطر المعقم مرتين واتبع مع غسل واحد مع الايثانول 96 ٪.
4. الهواء الجاف coverslips المغلفة على قطعة من ورق الترشيح والاحتفاظ بها في وعاء جاف لاستخدامها في المستقبل (الجاف مرة واحدة يمكن أن تكون مكدسة منها).

باء الخلايا المرتبطة coverslips

غير ملتصقة الخلايا (وهنا نستخدم خلايا K562)

1. مكان ساترة بولي - L - يسين المغلفة في بئر في لوحة 6 - جيدا مع السطح المطلي مواجهة.
2. K562 البذور في مناطق ذات كثافة الخلايا من الخلايا 7x10 ⁵ / Dulbecco جيدا في متوسطة والنسور التعديل (DMEM) تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ (FBS) ، و PS (البنسلين 100units/ml ، 100mg/ml الستربتوميسين). ويمكن في حالة الخلايا K562 أن يؤديها ترنسفكأيشن عابرة باستخدام electroporation (cuvettes electroporation 0.4cm مع 1x10 ⁷ 200μl الخلايا في وسائل الإعلام في 250V / 975μF) قبل البذر الخلايا.
3. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO _2.
4. مخزنة من أجل المتوسط ​​وقبالة غسل الخلايا مرتين مع الفوسفات الجليد الباردة المالحة (PBS).
5. اتبع مع بروتوكول تجزيء التحت خلوية.

ملتصق الخلايا (وهنا نستخدم خلايا كوس - 7)

1. وضع علامة ساترة غير المصقول في بئر في لوحة 6 - جيدا.
2. prewarmed يغسل مرتين في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية.
3. فصل الخلايا عن طريق هضم مع التربسين (0.03 ٪ EDTA ، 0.25 ٪ التربسين) في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية لمدة 2 إلى 5 دقائق. فمن المهم عدم الإفراط في هضم الخلايا ووقف عملية الهضم بمجرد الخلايا الفردية عائمة في الغالب موجودة.
4. توقف عملية الهضم من خلال زرع خلايا في مناطق ذات كثافة الخلايا 3x10 ⁵ / جيد في لوحة 6 - جيدا في DMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ وباريس سان جيرمان (البنسلين 100 وحدة / مل ، والستربتوميسين 100ug/ml 292ug/ml L - الجلوتامين) يوم coverslips العادي. الخلايا الملتصقة بشكل جيد عموما نعلق على coverslips المجهر العادي ، ومع ذلك ، يمكن استخدام بولي - L - يسين coverslips المغلفة إذا لزم الأمر.
5. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2. ويمكن في حالة كوس - 7 خلايا يتم تنفيذ ترنسفكأيشن عابرة باستخدام Fugene 6 (روش) إذا لزم الأمر وترك الخلايا لاستعادة لمدة 24 ساعة أخرى في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.
6. تخلصي من المتوسط ​​وغسل خلايا مرتين مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني.
7. اتبع مع بروتوكول تجزيء التحت خلوية.

II. التحت خلوية تجزيء

كسر في الموقع يتم تنفيذ وفقا لالتخطيطي هو مبين في الشكل (1) ويستند على الطريقة الموصوفة سابقا ⁵ مع التعديلات المذكورة سابقا في ⁷ و بروتوكول المفصلة أدناه. فمن المستحسن لنقل coverslips إلى لوحة 6 - جيدا بعد كل خطوة جديدة تجزيء إزالة ساترة قبل إزالة السائل. على الرغم من أن هناك حاجة سوى أربعة coverslips التصوير ، وهناك حاجة إضافية لإنتاج coverslips كله استخراج الخلايا والكسور مصفوفة النووية للغرب النشاف إذا كان هذا هو المراد تنفيذها بالتوازي.

1. إعداد وتصفية العازلة الهيكل الخلوي (CSK) : PIPES 10MM ، السكروز 300mM ، كلوريد الصوديوم 100mM ، MgCl 3mM ₂ ، 1MM EGTA. وينبغي CSK العازلة الطازجة يوم تجزئة.
2. يمكن إذا لزم الأمر يمكن استخدام خلايا من ساترة لإعداد كامل لاستخراج الخلايا الغربية التنشيف برفق عن طريق وضع 200ul TES العازلة (1 ٪ SDS ، 2mm وEDTA ، 20mM تريس حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4) مباشرة على ساترة واحتضان ل1 أو 2 دقيقة في 22 درجة مئوية. يمكن ثم استخراج الخلايا كلها تتم إزالة البروتينات وعجلت بإضافة 250ul من 1M (NH ^{4) 2} SO ⁴ وتفرخ على الجليد حتى عينات أخرى غربية جاهزة.
3. غسل coverslips المتبقية مع 1ml الجليد الباردة PBS مرتين حتى 22 درجة مئوية بحلول إمالة لوحة 6 جيدا مرتين أو ثلاث مرات.
4. إزالة الخلايا ساترة تمثل كلها ونقلها إلى لوحة 6 - جيدا الطازجة. اتبع مع تثبيت الخلية المناعية والبروتوكول مضان.
5. إزالة بلطف PBS من الآبار المتبقية.
6. استخراج البروتينات السيتوبلازمية النووية ، وعقد فضفاضة عن طريق وضع بلطف 200ul CSK عازلة + 0.1 ٪ (V / V) تريتون X - 100 مباشرة على كل ساترة المتبقية وعلى احتضانالثلج لمدة 1 دقيقة.
7. إزالة استخراج حشوية ، وعقد فضفاضة النووية ويعجل كما هو موضح في الخطوة 2.
8. غسل coverslips مع الثلج الباردة 1ml PBS مرتين من قبل في 22 إمالة 6 جيدا وحة درجة مئوية.
9. إزالة ساترة تمثل المواد النووية التي عقدت بإحكام ومتابعة مع تثبيت الخلية المناعية والبروتوكول مضان.
10. إزالة بلطف PBS من الآبار المتبقية ثم استخراج البروتينات التي عقدت بإحكام عن طريق وضع بلطف 200ul CSK عازلة + 0.5 ٪ (V / V) تريتون X - 100 مباشرة على كل ساترة المتبقية وتفرخ على الجليد لمدة 20 دقيقة.
11. إزالة استخراج عقد بإحكام ويعجل كما هو موضح في الخطوة 2.
12. غسل coverslips مع الثلج الباردة 1ml PBS مرتين من قبل في 22 إمالة 6 جيدا وحة درجة مئوية.
13. إزالة ساترة تمثل جزءا لونين والمتابعة مع تثبيت الخلايا المناعية والبروتوكول مضان.
14. إزالة بلطف PBS من الآبار المتبقية ثم ضع 200ul CSK عازلة + 100ug/ml من الدناز وأنا على coverslips المتبقية واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
15. إزالة انتزاع لونين ويعجل كما هو موضح في الخطوة 2.
16. غسل coverslips مع الثلج الباردة PBS مرتين في 22 درجة مئوية بحلول إمالة 6 جيدا للصفيحة.
17. إزالة ساترة تمثل جزءا مصفوفة النووية ومتابعة مع تثبيت الخلية المناعية والبروتوكول مضان.
18. يمكن إذا لزم الأمر يمكن إزالة البروتينات المصفوفة من مصفوفة ساترة إضافية للغرب النشاف باستخدام 200ul TES العازلة كما هو موضح في الخطوة 2.
19. يجب طرد عينات لطخة غربية في 13000 دورة في الدقيقة في المقعد العلوي في microcentrifuge 4 درجات مئوية ، والكريات معلق في تحميل 40ul العازلة SDS (62.5mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 ، 2 ٪ SDS (ث / ت) ، 50 ملي DTT ، 10 ٪ الجلسرين ، 0.01 ٪ زرقة البروموفينول (ث / ت)) قبل تحليل SDS - PAGE.
    
    الشكل 1. تمثيل تخطيطي للتجزيء التحت خلوية في الموقع. الهيكل الخلوي العازلة (CSK) ويتكون من أنابيب 10MM ، السكروز 300mM ، كلوريد الصوديوم 100mM ، MgCl 3mM ₂ ، 1MM EGTA. TES العازلة يتكون من 1 ٪ SDS ، 2mm وEDTA ، 20mM تريس - 7.4 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك.

III. تثبيت الخلية والومضان المناعي

1. إضافة بلطف 1ml من 4 ٪ الفورمالديهايد / PBS إلى كل ساترة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية.
3. إضافة 400ul X-100/PBS تريتون من 0.1 ٪ إلى احتضان كل ساترة وعلى 22 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
4. يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية.
5. إضافة 400ul من الأبقار مصل الزلال 3 ٪ PBS / (BSA) ، واحتضان على 22 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للحد من احتمال تلوين الخلفية.
6. يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية.
7. 100ul بدلا من الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني مباشر على احتضان وساترة في 22 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. وينبغي أن تضعف الأضداد الابتدائية والثانوية في برنامج تلفزيوني على التركيز المطلوب. هذا قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل جسم المستخدم.
8. يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية.
9. 200ul مكان الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني واحتضان عند 22 درجة مئوية بعيدا عن الضوء لمدة 1 ساعة.
10. يغسل كل ساترة بلطف 2-3 مرات مع 1ml من برنامج تلفزيوني في 22 درجة مئوية.
11. كل جبل ساترة (خلايا لأسفل) على شريحة ميكروسكوب زجاجية باستخدام Vectashield المتوسطة المتزايدة التي تحتوي على دابي (4 '،6 - diamidino - 2 - phenylindole هيدروكلوريد).
12. يمسح الزائدة المتوسطة المتزايدة من مختلف أنحاء ساترة باستخدام منشفة ورقية ، واحتضان الشريحة على 22 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة بعيدا عن الضوء.
13. إصلاح ساترة إلى الشريحة الزجاجية باستخدام طلاء الأظافر واضحة الاكريليك.
14. يبقي بعيدا عن الضوء الشرائح قبل التصور بواسطة المجهر مضان.

رابعا. ممثل النتائج

الشكل 2. تم إصلاح تجزئة التحت خلوية من الخلايا COS - 7 غير transfected. مجزأ كوس - 7 مع الخلايا باستخدام الفورمالدهيد وimmunostained α - تويولين ، H1 - α هيستون أو α امين - A / C الأضداد مترافق لTRITC تلتها المعاملة مع تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي . تم الحصول على الصور مع عدسة العين عدسة 63x 10x والهدف باستخدام المجهر مبائر ايكا. وكانت نواة الخلية تصور باستخدام مجموعة تصفية دابي بينما في نفس المجال الخلايا ملطخة الأضداد علامة وتصور باستخدام مجموعة TRITC التصفية.

الشكل 3. ويرتبط البروتين GFP - 6E2 الانصهار مع مصفوفة النووية. التحت خلوية من الخلايا تجزيء - 7 كوس تعبر عن انصهار بروتين تتكون من بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تنصهر لفيروس الورم الحليمي البشري (HPV) نوع 6E2 البروتين (GFP - 6E2). وكانت نواة الخلية عبر تصور تلطيخ دابي بينما توطين GFP - 6E2 في الخلايا transfected كان تصور مباشرة عن طريق مضان GFP. وكان امين A / C - α تصور به لامين A / C مترافق الأجسام المضادة لTRITC ومجموعة TRITC التصفية. دمج الصور تكشف عن أن يرتبط بعض من البروتين GFP - 6E2 مع مصفوفة النووية (اللوحة السفلية اليمنى). تم الحصول على الصور كما هو موضح في الشكل 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

مشترك المشاكل والاقتراحات :

وفقدت كل أو معظم الخلايا أثناء الغسل. ويجب غسل خلال الخطوات تضاف السوائل ببطء الى جانب لوحة 6 - جيدا تجنب ساترة. وبالمثل ، ينبغي إزالة السوائل من خلال إمالة لوحة pipetting بعناية وببطء قبالة السوائل الزائدة. و?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Chemical	Sigma-Aldrich	A9647-100G
DNase I	Chemical	Sigma-Aldrich	DN25-1G
poly-L-Lysine	Chemical	Sigma-Aldrich	P-8920
Trypsin	Chemical
EGTA	Chemical	Sigma-Aldrich	E4378-25G
Fomaldehyde	Chemical	VWR	284216N
PIPES	Chemical	Sigma-Aldrich	P-6757
Sucrose	Chemical	Fisher Scientific	S/8600/53
Triton X-100	Chemical	Sigma-Aldrich	T-6876
Mounting Medium with DAPI	Chemical	Vector Laboratories	H-1200
Fugene 6 Transfection Reagent	Chemical	Roche Group	11814443001
Histone H1	Antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-8030
Lamin A/C	Antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-20681
Tubulin-α	Antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-32293