فأري الورم الكبدي Bioluminescent النموذجي

Summary

توضح هذه المقالة إجراء لتحريض مثلي bioluminescent أورام الكبد في الفئران ، وتحليل لاحقة من نمو الورم محصورا في الكبد باستخدام يعيش التلألؤ الجسم كله التصوير.

Abstract

هذا الفيديو يصف إنشاء الانبثاث الكبد في نموذج الفأر التي يمكن تحليلها لاحقا من قبل bioluminescent التصوير. تدار خلايا الورم على وجه التحديد إلى الكبد للحث على وجود ورم في الكبد المترجمة ، عن طريق تعبئة والطحال وتقسيمه الى قسمين ، وترك الحبل على الغارب في الأوعية الدموية عنيق لكل نصف الطحال. يتم تلقيح خلايا سرطان الرئة لويس التي تعبر عن هذا الجين constitutively luciferase يراعة (luc1) إلى واحد نصفي الطحال وهي مقطوعة ثم 10 دقيقة في وقت لاحق. ويترك الآخر نصفي الطحال سليمة ، وعاد إلى البطن. ويمكن رصد نمو الورم في الكبد بواسطة التصوير تلألؤ بيولوجي باستخدام التصوير IVIS نظام الجسم كله. التصوير الكمي لنمو الورم باستخدام IVIS يوفر الكميات الدقيقة من الخلايا السرطانية قابلة للحياة. يشار إلى موت الخلايا والأورام نخر بسبب العلاج من تعاطي المخدرات في وقت مبكر عن طريق تخفيض في إشارة bioluminescent. هذا النموذج يسمح الماوس عن التحقيق في الآليات الكامنة الورم النقيلي خلايا البقاء والنمو ، ويمكن استخدامها لتقييم علاجات من ورم خبيث في الكبد.

Protocol

مقدمة

الكبد وغالبا ما يكون أول موقع من المرض المنتشر ، وربما يكون الموقع الوحيد للانتشار في ما يصل الى 30 40 ٪ من المرضى الذين يعانون من المرض المتقدمة. لكن الخيارات المتاحة لعلاج أورام الكبد المنتشر قليلة مع أقلية من المرضى مناسبة لاستئصال وفقط 23 ٪ من المستجيبين الرئيسية مبحث المعالجة الكيميائية. وقد اقتصرت البحوث قبل السريرية في هذا المجال بسبب عدم وجود نموذج الفأر مناسبة لدراسة أمراض الكبد معزولة. وصفنا نهج تقسيم الطحال التي يمكن استخدامها لإنشاء موثوق موحدة ، الانبثاث الكبد انتشارا. استئصال نصف هذا الطحال يتجنب العواقب المترتبة على نمو الورم الطحال ، وعاد والنصف الآخر في الطحال مع تداول بوابة سليمة للحفاظ على خصائص وقائية مناعية الطحال. والنموذج الذي وصف بسيط للغاية لتنفيذ ويمكن القيام به بسرعة من خلال شق واحد. خصائص bioluminescent الورم خط الخلية يسمح الكمي الدقيق للالاستجابة للعلاج من دون تضحية من الحيوانات.

بروتوكول

أولا تحضير خلية

1. تزرع خلايا سرطان الرئة متوسطة لويس Dulbecco من الضروري تعديل تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ وتحصد trypsinisation عندما شبه متموجة.
2. احصي الخلايا باستخدام Nucleocounter (الكيماوي metec ، الدنمارك) وتعليق خلية واحدة من الخلايا 1 X ⁶ 10 في 200 ميكرولتر أعدت في وسائل الإعلام الحرة المصل.

II. إعداد الماوس

ملاحظة : تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاق من جامعة كوليدج كورك. في مختبرنا نستخدم حقن التخدير لتخدير الماوس ، بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أن استخدام المسكنات استنشاقه لتحقيق التأثير نفسه. سلالة الماوس كنا هو أصلع MF1 نو / نو سلالة تم الحصول عليها من مختبرات هارلان (أوكسفوردشاير ، انكلترا). شملت الإناث MF1 نو / نو الفئران وزنها 16-22 غ و6-8 أسابيع من العمر في هذه التجربة. ويمكن أيضا سلالات أخرى مثل C57 وBALB / ج مناسبة يمكن استخدامها مع خطوط الخلايا السرطانية.

1. وتم تسليم التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين 100ul 1.5 ملغ و 300 ميكروغرام زيلازين.
2. ويتم تقييم عمق التخدير باستخدام قرصة أخمص قدميه. وينبغي أن يكون هناك منعكس الانسحاب مع قرصة أخمص قدميه.
3. يتوضع بشكل صحيح الماوس تخدير ، وسجلت أكثر من وسادة التدفئة.
4. وهيأهم البطن بمحلول betadine 10 ٪.
5. ورايات البطن وموقع الجراحة بطريقة عقيمة.

III. شق البطن

1. يتم إجراء شق صغير في الجلد تحت الضلع.
2. ويمتد الشق إلى 2-3 سم.
3. تم تقسيم عضلات البطن الجدار ودخلت التجويف البريتوني.

رابعا. وتعرض شعبة الطحال

1. وحشدت الطحال وexteriorized بلطف على شاش معقم قبل قطع.
2. وترتبط اثنين من الحروف المركبة vicryl 4-0 في جميع أنحاء الجسم منتصف الطحال.
3. وينقسم الطحال بين الحروف المركبة two two خلق نصفي الطحال.

خامسا حقن الخلايا في نصفي الطحال

1. وتستخدم مجموعة من 27 إلى 100 وحدة ضخ ميكرولتر من الخلايا في واحد نصفي الطحال.
2. ويسمح للخلايا الأورام لنزيف في الكبد لمدة عشر دقائق وقتا كافيا لتوفير غالبية حقن الخلايا للوصول إلى الكبد.

سادسا. استئصال الطحال ، هيمي ، وإغلاق البطن والاسترداد

1. يستأصل فيه حقن نصفي الطحال.
2. عاد هو الآخر نصفي الطحال إلى تجويف البطن.
3. إغلاق طبقة العضلات مع خياطة PDS 4-0 باستخدام غرزة بسيطة التشغيل.
4. إغلاق جلد البطن مع Prolene 4-0 باستخدام غرز توقف.
5. يدار بلعة السوائل وإدارة ما بعد الجراحة للوعي ، Carpofen (5 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن في مجال الملكية الفكرية لمدة 24 ساعة بعد الجراحة.
6. ولا يسمح للماوس على التعافي من التخدير

سابعا. IVIS كامل الجسم Bioluminescent التصوير

1. الفأر هو تخدير باستخدام حقن مخدر.
2. وتعطى Luciferin الركيزة التي داخل الصفاق عشر دقائق قبل الحقن التصوير
3. وضعت الفئران على المسرح وتصوير لمدة 3 دقائق باستخدام IVIS تصوير الجسم نظام الجامعة
4. ويمكن قياس التلألؤ من الكبد باستخدام أداة منطقة الفائدة

ثامنا. التعرض للكبد الفأر

1. الفأر هو تخدير باستخدام حقن مخدر.
2. هناك شق في البطن على السطح يسمح التصور من ورم خبيث في الكبد المنتشر في الجسم الحي.
3. هو الموت الرحيم الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم ، ويمكن استئصاله الكبد لإجراء مزيد من التحليل.

_upload/1977/1977fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. علاج الفئران يستأصل الورم طازجة وتسللت - الأكباد.

الشكل 2. حركية نمو الورم الكبدي كما يتضح من التصوير IVIS الجسم كله.

Discussion

وضع موثوق بها في النماذج الحية لدراسة الكبد الانبثاث أصبحت متزايدة الأهمية مع ظهور استراتيجيات علاجية جديدة. لدراسة دقيقة لوضع استراتيجيات جديدة ونماذج حيوانية ينبغي أن يكون من السهل نسبيا على أداء وشكل عددا كبيرا من ورم خبيث ، وإشراك جميع الخطوات من تتال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ketamine	Vétoquinol
Xylazine	Vétoquinol
Carprofen	Vétoquinol
Videne	Ecolab
Vicryl 4-0 suture	Ethicon Inc.
PDS 4-0 suture	Ethicon Inc.
Prolene 4-0 suture	Ethicon Inc.
Firefly Luciferin	Biosynth International, Inc