A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
هذا الفيديو يوضح إعداد الثقافات العصبية الأولية من العقول في وقت متأخر من مرحلة الشرانق ذبابة الفاكهة. آراء الثقافات الحية تظهر ثمرة neurite والتصوير باستخدام مستويات الكالسيوم Fura - 2.
في هذا الفيديو ، ونبدي استعدادا للثقافات العصبية الأولية من العقول في وقت متأخر من مرحلة الشرانق ذبابة الفاكهة. يبدأ الإجراء مع إزالة العقول من الحيوانات في 70-78 ساعة بعد تشكيل puparium. وأظهرت أدمغة معزولة بعد حضانة قصيرة في غراء تليها يغسل عدة في وسط النمو المصل الحرة. ويتضح من عملية التفكك الميكانيكي للدماغ في كل قطرة 5 المجاهدين من وسائل الإعلام على ساترة. وعلى المحاور sheered و dendrites من الخلايا العصبية في مرحلة ما بعد الإنقسامية قبالة قرب سوما خلال تفارق ولكن تبدأ الخلايا العصبية لتجديد العمليات في غضون ساعات قليلة من الطلاء. تظهر الصور الثقافات تعيش في 2 يوما. الخلايا العصبية مواصلة تطويرها العمليات خلال الأسبوع الأول في مجال الثقافة. يمكن التعرف على السكان العصبية المحددة في الثقافة GAL4 باستخدام خطوط لمحرك التعبير أنسجة معينة من علامات الفلورسنت مثل GFP أو طلب تقديم العروض. وقد أظهرت التسجيلات خلية كاملة من الخلايا العصبية مثقف شكل وظيفي ونشطة بشكل تلقائي والمشابك كوليني GABAergic. قطعة شريط فيديو قصير يوضح ديناميات الكالسيوم في الخلايا العصبية مثقف باستخدام Fura - 2 باعتبارها الكالسيوم صبغ المؤشر لمراقبة العابرين الكالسيوم عفوية والنيكوتين أثار ردود الكالسيوم في طبق من الخلايا العصبية مثقف. هذه الثقافات الدماغ العذراء هي نظام نموذجا مفيدا يمكن من خلالها استخدام أدوات والدوائية الجينية لتحديد العوامل الجوهرية التي تؤثر على وخارجي تشكيل وظيفة نقاط الاشتباك العصبي المركزي.
الاستعدادات قبل يوم من زراعة :
في يوم من زراعة
أولا تحضير محلول أنزيم (ES) في غطاء تدفق الصفحي
II. جعل وسائل الاعلام DDM2
في يوم من زراعة : إضافة المكملات التالية لإجراء DDM2
إلى 10 مل من DMEM إضافة ملاحق ، وقبل زراعة :
ملاحظة : تحقق ما يكفي لجميع الثقافات DDM2 المخططة (كل الدماغ مطلي على ساترة واحد في الفردي 35 مم طبق بتري ، 1.5 مللي ثانية من وسائل الإعلام / ثقافة)
الخطوة يمكن أن تكون من الثالث إلى السادس في المختبرات nonsterile القيام به ، وينبغي أن يكتمل في 45 دقيقة أو أقل.
III. كوكتيل الشرانق
ملاحظة : نحن نستخدم العقل عموما من الشرانق ما بين 55-78 ساعة بعد تشكيل puparium (APF). يصعب قليلا إلى خارج تشريح الدماغ من الشرانق الاصغر منذ كبسولات رئيس تميل إلى الانهيار ، في حين أن المستوى العام للثمرة neurite أقل قليلا من أقدم الشرانق. في سلالة wildtype كانتون - S ، يتم التعرف على هذه المراحل من قبل عيون الصباغية التي البني الفاتح إلى الحمرة قليلا ، قليلا مع الصباغ في أماكن أخرى.
رابعا. قطع الرأس تحت مجهر تشريح
خامسا إزالة المخ من الرأس تحت مجهر تشريح
سادسا. إزالة الفص البصري والعلاج الانزيم
معقمة داخل غطاء تدفق الصفحي -- ينبغي لجميع الخطوات التي تعرض الأنسجة للهواء ينبغي القيام به في التدفق الصفحي غطاء لتنفيذ الخطوات المتبقية.
سابعا. غسل
ثامنا. سحن والتصفيحات تشريح تحت المجهر
تاسعا. تغذية الخلايا
يمكن زراعة الخلايا العصبية التي تحصد من أدمغة الفئران الجنينية / ما بعد الولادة في الثقافة الخلية الأولية حيث تمتد neurites اتصالات وشكل متشابك وظيفية. هي راسخة طرق تحضير هذه الثقافات والدراسات في ثقافات القوارض العصبية لعبت دورا حاسما في تحديد الجينات والعوامل البيئية المتورطين ?...
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة لمنح NS27501 DKOD. وقدمت دعما إضافيا لهذا العمل من خلال منحة لجامعة كاليفورنيا في ايرفين في دعم DKOD من خلال برنامج أستاذ HHMI.
Coverslips طلاء : ضع coverslips تعقيمها في طبق بتري 60 مم. الماصة 5 من المجاهدين الموالين مزيج Laminin / على مركز كل ساترة. مكان في الحاضنة لمدة 2 C 37 ساعة. شطف coverslips 3X مع 100 UL تعقيمها كل من المياه. استخدام الفراغ يعلق على الماصة باستور العقيمة. خلال مشاركة شطف ، التقط ساترة مع ملقط والجافة الجانبين. نقل ساترة لطبق بيتري 35mm. تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل الى شهر.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved