تسجيل متعددة الخلايا في السلوك Myxococcus زانثس الأغشية الحيوية باستخدام الزمن الفاصل بين Microcinematography

Summary

لدراسة Myxococcus زانثس سرب السلوك ، قمنا بتصميم بروتوكول microcinematography مرور الزمن التي يمكن تعديلها لفحوصات مختلفة. انها توظف ظروف النمو القياسية تكييفها للفحص المجهري ، وتعطي نتائج استنساخه من خلال استخدام غير مكلفة ، والحشايا السيليكون التي يعاد استخدامها. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لتحديد الكيميائي متعددة الخلايا.

Abstract

سرب من δ - proteobacterium زانثس Myxococcus تحتوي على الملايين من الخلايا التي تتصرف كحركة جماعية تنسيق من خلال سلسلة من إشارات إلى إنشاء مجمع ، وأنماط دينامية واستجابة لمنبهات البيئية. هذه الأنماط هي التنظيم الذاتي والناشئة ، لا يمكن التنبؤ من خلال مراقبة سلوك الخلايا الفردية. باستخدام تتبع microcinematography الوقت الفاصل بين مقايسة ، حددنا نمطا متميزا الناشئة في م. دعا زانثس الكيميائي ، الذي يعرف بأنه حركة موجهة من سرب يصل الانحدار نحو مصدره المغذيات ^1.

طورنا من أجل تميز بكفاءة الكيميائي عبر مرور الزمن microcinematography ، لوحة معقدة للغاية للتعديل (الشكل 1) ، وشيدت مجموعة من 8 المجاهر (الشكل 2) ، كل قادر على الفيديو مرور الزمن الالتقاط. في مقايسة غير دقيق بما فيه الكفاية للسماح النسخ ثابت من البيانات القابلة للقياس الكمي ، وأشرطة الفيديو مما يتيح لنا مراقبة وتعقب التغييرات الطفيفة في السلوك سرب. القبض على مرة واحدة ، يتم نقل مقاطع الفيديو إلى جهاز كمبيوتر التحليل / التخزين مع ذاكرة كافية لمعالجة وتخزين الآلاف من أشرطة الفيديو. وقد أثبت مرونة هذا الإعداد مفيد لعدد من أعضاء م. زانثس المجتمع.

Protocol

الإمدادات اللازمة :

• Klett متر
• ماصة ونصائح
• 2.5 مل أنابيب microcentrifuge
• Microcentrifuge
• CTTYE وسائل الإعلام :
  • 1.0 ٪ Casitone (Difco مختبرات) ، و 0.5 ٪ مستخلص الخميرة (Difco مختبرات)
  • 10.0 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، 1.0 ملي KH ₂ PO ₄ ، 8.0 ملي MgSO ₄
• TPM وسائل الإعلام :
  • 10.0 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، 1.0 ملي KH ₂ PO ₄ ، 8.0 ملي MgSO ₄
• Agarose
• مجموعة حمام مائي إلى 55 درجة مئوية
• الشرائح الزجاجية المجهر
• coverslips الزجاجية الكبيرة
• 2 × 2 سم ، و 0.5 ملم سميكة سيليكون المطاط طوقا (غريس مختبر شركة بيو)
• Parafilm (أو الشريط التوسيم)
• ملقط
• مقاطع صغيرة الموثق
• أخذ العينات الصغيرة ماصة (فيشر)
• 100 طرف زجاج ميكرولتر المتاح (فيشر)
• Kimwipes

الجزء 1 : إعداد الخليوي

تبدأ من خلال خلق بيئة معقمة.

• تنظيف مساحة العمل ، دون قفازات ، والناسخ الخفيفة.

1. بدء ثقافة بين عشية وضحاها من الخلايا بتلقيح في قارورة تحتوي على CTTYE مرق والمحتضنة في الظلام على 32 درجة مئوية مع دوامات قوية.
2. وصلت مرة واحدة في ثقافة كثافة 5 × 10 ⁸ خلايا / مل ، ماصة 1 مل خلايا في أنبوب microcentrifuge 2.5 مل.
3. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة على 16000 XG (أو سرعة قصوى).
4. صب وتجاهل طاف.
5. غسل الخلية بيليه مع TPM مل 1 (الملح متوازنة ، خالية من المغذيات وسائل الاعلام).
   • اعادة تعليق والدوامة
6. إعادة بيليه الخلايا من خلال الدوران لمدة 2 دقيقة على 16000 XG (أو سرعة قصوى).
7. صب وتجاهل طاف.
   
   الخطوة الحرجة
   
   
8. تماما اعادة تعليق بيليه وسائل الاعلام في 100 TPM ميكرولتر باستخدام مزيج من pipetting وvortexing.
   
   IMPORTANT : هذه الخطوة يضمن عدم وجود كتل من الخلايا المتبقية في الأنبوب. وهذا قد يستغرق بعض الوقت.
9. تعيين جانبا الخلايا في درجة حرارة الغرفة بينما كان يستعد لوحات مقايسة التعقب.

الجزء 2 : إعداد آجار

1. تحضير 50 ​​مل من كل من TPM (فحص وسائل الإعلام) وCTTYE (القرص الغذائية) وسائل الإعلام.
2. إضافة إلى 0.5 غرام لكل agarose (agarose أقل من إنحرافي آغار).
3. الأوتوكلاف لتعقيم.
4. بعد التعقيم ، والحفاظ على وسائل الإعلام عند درجة حرارة 55 مئوية في حاضنة (أو حمام مائي) ، في حين بناء لوحة مقايسة تتبع المجمعات.

الجزء 3 : غذائية البناء القرص

1. مكان معقم المطاط سيليكون 0.5 ملم سميكة طوقا على رأس اللهب تعقيم الزجاج شريحة المجهر ، وتشكيل بئر صغيرة.
2. ماصة ~ 300 ميكرولتر من 55 درجة مئوية وسائل الاعلام CTTYE / agarose في خلق جيدا من قبل طوقا على الشريحة والذي يحتوي على قرص الغذائية. يجب على وسائل الاعلام CTTYE / agarose تل يصل.
3. مكان شريحة اللهب معقمة (بدون طوقا) على رأس وسائل الإعلام CTTYE / agarose.
   
   IMPORTANT : يجب أن يتم تعيين هذه الشريحة في اسفل الزاوية لمنع الفقاعات من التشكل.
4. مرة واحدة على الشريحة في مكانها ، المشبك مجمع جنبا إلى جنب مع مقاطع الموثق صغيرة -- على كل جانب واحد.
5. مكان المجمع قص عند 4 درجة مئوية ، والسماح لوسائل الإعلام CTTYE / agarose تعيين. هذا يستغرق عادة حوالي 5 دقائق.

الجزء 4 : تعقب إعداد الفحص -- إعداد المجمعات بلايت

تجميع المكونات ، وإعداد مجمعات الشرائح ، ضع القرص الغذائية ، من أجل وسائل الإعلام TPM / agarose والمجمعات وحة منفصلة والجافة ، وخلايا لوحة ، وتجميع تتبع المجمعات وحة مقايسة.

تجميع مكونات لوحة معقدة

1. لكل مجمع ، لهب تعقيمها شريحة المجهر والزجاج
2. وضع علامة تعقيمها طوقا على رأس الشريحة ويوضع جانبا (تعقيم الجانب متابعة). وهذا النموذج في أسفل مقايسة.
3. الشعلة تعقيم غطاء زجاجي زلة ووضعه على رأس شريحة المجهر والزجاج second ملفوفة بشريط لوضع العلامات (أو Parafilm) ويوضع جانبا (تعقيم الجانب متابعة). كما يتم استخدام هذه الشريحة الدعم للحفاظ على ساترة من التصدع. وهذا النموذج الأعلى للمقايسة.
4. الشعلة تعقيم المجهر third الشريحة الزجاجية ويوضع جانبا (تعقيم الجانب متابعة). وسيتم استخدام هذا تسطيح agarose.
   
   هام : تأكد من أن الجوانات شكل خاتم مع الزجاج بالضغط عليه مع ملقط ، وإلا فإن وسائل الإعلام قد / agarose تجف.

ف الدانتيل القرص الغذائية

خطوات يجب القيام به من 5 إلى 10 لمجمع الشريحة في وقت واحد ، الا ان وسائل الاعلام / agarose يمكن أن تبدأ لترسيخ مما أدى إلى سوء نوعية الفيلم : هام.

5. إزالة شكل قرص الغذائية المعقدة 4 درجات مئوية (الخطوة 5 من الجزء 3) ، ونقب عدا الشرائح تعريض CTTYE طدت الآن / agarose.
6. إزالة 1 مم 'القرص الغذائية" من وسائل الإعلام CTTYE / agarose صفا جيدا أعلاه باستخدام ماصة المعاينة الدقيقة مع 100 بلاغا ميكرولتر الزجاج القابل للتصرف ووضعه في خلق جيدا من قبل طوقا على تغطية زلة (الخطوة 3 أعلاه) .

صب لوحات

الخطوة الحرجة

7. ماصة ~ 300 ميكرولتر من 55 درجة مئوية وسائل الاعلام TPM / agarose في خلق جيدا من قبل طوقا على قسيمة الغطاء والذي يحتوي على قرص الغذائية. يجب على وسائل الاعلام TPM / agarose تل يصل.
   
   الخطوة الحرجة
8. مكان الشريحة مع عدم وجود لهب تعقيمها طوقا (من الخطوة 3) على رأس وسائل الإعلام TPM / agarose.
   
   IMPORTANT : يجب أن يتم تعيين هذه الشريحة في اسفل الزاوية لمنع الفقاعات من التشكل.
   
   
9. مرة واحدة الشريحة (من الخطوة 5) هو في مكان ، المشبك مجمع جنبا إلى جنب مع مقاطع الموثق صغيرة -- على كل جانب واحد.
10. مكان المجمع قص عند 4 درجة مئوية ، والسماح لوسائل الإعلام / agarose تعيين. هذا يستغرق عادة حوالي 5 دقائق.

لوحات منفصلة والجافة

هام : لمنع وسائل الإعلام / agarose من الجفاف ، الخطوات التي ينبغي فقط من 11 إلى 20 سيتم تنفيذه على الشريحة المعقدة في وقت واحد.

يجب أن يكون تنفيذ للحصول على أفضل النتائج ، والخطوات 11 إلى 13 درجة مئوية عند 4 : هام

11. مرة واحدة في وسائل الاعلام / agarose وضعت ، وإزالة لقطات الموثق والضغط نهاية معقدة لتخفيف الشريحة الشريط الملفوفة.
12. إزالة الشريحة الشريط الملفوفة ووضعه على مقاعد البدلاء لاستخدامها مرة أخرى.
    
    الخطوة الحرجة
13. باستخدام الملقط كاسفين ، فصل زلة تغطية / المعقدة طوقا / وسائل الإعلام / agarose من الشريحة الدعم (مع عدم وجود طوقا) وتجاهل شريحة الدعم.
    
    هام : لا تستخدم الحركة التحديق لفصل زلة تغطية / المعقدة حشية. هذا يمكن أن يؤدي إلى تغطية كسر التسلل و / أو وسائل الإعلام الشائكة / agarose إلى الشريحة الدعم.
14. ضع الغطاء زلة / المعقدة طوقا / وسائل الإعلام / agarose على الشريحة الشريط الملفوفة (طوقا الجانب متابعة) وإزالتها من 4 درجات مئوية. هذا المكان المقبلة معقدة لناسخ للسماح لجميع تتبخر الرطوبة مرئية من على سطح وسائل الإعلام / agarose تتعرض حديثا -- لا يزيد عن 1 دقيقة.
    
    هام : قد لا تدع وسائل الاعلام الجافة / agarose لفترة طويلة لأن هذا يؤثر على M. زانثس سرب السلوك.

لوحة الخلايا

الخطوة الحرجة

1. مرة واحدة وقد تبخر الرطوبة الزائدة ، ماصة 0.5 ميكرولتر من الخلايا مركزة (الخطوة 8 من الجزء 1) على ما يقرب من 1 ملم وسائل الاعلام / agarose بعيدا عن القرص المغذيات.
   
   هام : من المهم للغاية للتأكد من أن يتم إيداع الخلايا عن طريق تحريك ماصة أسفل على التوالي ، وبعد ذلك مباشرة. هذا يضمن أن سرب سيتم التعميم.
   
   هام : من المهم للغاية عدم لمس الحافة ماصة لوسائل الاعلام / agarose. وهذا سيجعل من الاكتئاب على السطح وتغيير سلوك م. زانثس سرب.
   
   TIP : خفض رأس ماصة قبل الاقتراب من وسائل الاعلام / agarose. وسوف تسمح هذه قطرة من الخلايا لتظهر في الجزء السفلي من طرف ماصة وتجعل من السهل على إيداع الخلايا.
2. حالما يتم إيداع الخلايا ، ضع المقبل معقدة إلى ناسخ للسماح للبقعة الخلية الجافة -- أي أكثر من 20 ثانية.

التجمع مقايسة

1. مرة واحدة في بقعة الخلية قد جفت ، محاذاة المجمع الشريحة / حشية (من الخطوة 1) مع وحشية على تغطية زلة / طوقا / وسائل الإعلام / agarose / خلية المعقدة (من الخطوة 13) ، ثم اضغط بلطف معا لتشكيل الختم.
   
   الخطوة الحرجة
2. تنظيف أسطح الشرائح وتغطية زلة مع Kimwipe لإزالة رواسب خلفتها Parafilm. ينبغي للمقايسة الانتهاء تشبه الشكل 1.
3. مكان مجمع الشريحة انتهت في مرحلة ساخنة حافظت على 32 درجة مئوية (الانزلاق ، وتغطية زلة متابعة) مباشرة بعد مسح أسفل (الخطوة 15) لمنع تشكيل النموذج التكثيف. إذا كان التكثيف قد شكلت ، دعونا نجلس الشريحة المعقدة على المسرح ساخنة لعدة ثوان قبل البدء في البرنامج الحصول على الصور.
4. اختيار الهدف المناسب (2X ، 4X ، أو 10X).

الجزء 5 : إعداد الفيلم

ر "> خطوة حاسمة

1. بدوره على الكاميرا والمجهر ، وفحص مستويات الضوء (تأكد من أن الإضاءة غير مكثفة للغاية). بدء تشغيل الكمبيوتر وفتح البرنامج الحصول على الصور.
2. فوق إطار الصورة الحية والتركيز المجهر. وينبغي أن تظهر الصورة مشابهة لتلك المشاهدة في الشكل 3. إشعار السطح آغار موحدة.
3. بدء الحصول على الصور.
   
   الخطوة الحرجة
4. تحقق من التركيز بشكل منتظم خلال الساعة الأولى ، حيث أن وسائل الإعلام / آغار يميل إلى تسوية يسبب التركيز إلى الانجراف.
5. تنظيف منطقة العمل.
6. الحصول على الصور مرة واحدة كاملة ، اكتسب نقل الصور للتخزين وكسر معقدة الشريحة التي تمرغ في الايثانول 90 ٪ بين عشية وضحاها.
7. الأوتوكلاف جوانات لإعادة استخدامها.

الشكل 1. التوضيح الكرتون لوحة معقدة TM. (أ) يبين لوحة معقدة TM الأساسية في طريقة انفجرت والمقطع العرضي. (ب) يوضح استخدام جوانات أكبر.

الشكل 2. الكتلة مجهر. كل عقدة المجهر (الشكل) وتتألف من E400 نيكون المجهر ، والأهداف ، مرحلة ساخنة ، كاميرا انسايت ، وجهاز كمبيوتر محمول. هو كل عقدة شبكية معا وربطها بجهاز كمبيوتر وحدة تحكم رئيسية. يتم تعيين اثنين من العقد مع قدرات مضان التي تتكون من مصدر للضوء ومصاريع EXFO Uniblitz اثنين.

الشكل 3. 20X صورة لجهاز فحص تتبع في الوقت = 0. مقياس بار ، 1 ملم.

الشكل 4. التكيف للمجمع لوحة TM. (أ) صورة 100X م. زانثس التزلق على حركية CTTYE في آغار 1.0 ٪. (ب) صورة من 20X P. الزنجارية الوخز حركية. (C) صورة 20X س. الذابلة يحتشدون حركية. ويعاير كل من (ب) و (C) على LB في آغار 1.0 ٪. (D) صورة 40X م. اللخنية انزلاق حركية على LB في آغار 0.5 ٪. تم القبض على هذه الصورة باستخدام التكوين مقايسة بديل ينظر في الشكل 1B.

الفيديو 1. شريط فيديو مرور الزمن من السرب يخضع لفحص التتبع.

الفيديو 2. شريط فيديو الوقت الفاصل بين لM. زانثس سرب حيث fluorescently المسمى 1 ٪ من الخلايا. تم القبض على الصور المتبادلة وعلى النقيض من المرحلة الفلورسنت ومضافين لاستجلاء الموقف من الخلايا الفلورسنت داخل السرب. تم القبض على هذا الفيديو على CTTYE في آغار 1.0 ٪.

الفيديو 3. شريط فيديو الوقت الفاصل بين م. زانثس مزلق حركية. تم القبض على هذا الفيديو على CTTYE في آغار 1.0 ٪.

الفيديو 4. شريط فيديو من الوقت الفاصل بين P. الزنجارية الوخز حركية. تم القبض على هذا الفيديو على LB في آغار 1.0 ٪.

الفيديو 5. شريط فيديو مرور الزمن س الذابلة يحتشدون حركية. تم القبض على هذا الفيديو على LB في آغار 1.0 ٪.

الفيديو 6. شريط فيديو الوقت الفاصل بين م. اللخنية انزلاق حركية. تم القبض على هذا الفيديو على LB في آغار 0.5 ٪ باستخدام التكوين مقايسة بديل ينظر في الشكل 1B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد أصبح الوقت الفاصل بين microcinematography (TM) نهج موحد لدراسة حركية بروكاريوتيك ^2-7. تقليديا ، يتم تنفيذ TM باستخدام الفتائل رقة الترشيح ، ومنصات آغار رقيقة ، أو ألواح آغار بمثابة ركائز ^11/08. هذه الأساليب هي كافية وفعالة من حيث التكلفة عند استخدامها لتوليد متواليات...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0% Casitone	Difco Laboratories
0.5% yeast extract	Difco Laboratories
Micro-sampling pipette	Fisher Scientific
100 μl glass disposable tip	Fisher Scientific
2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket	Grace Bio-Lab Inc.