JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الانقاذ من فيروسات الانفلونزا من الحمض النووي البلازميد هو تقنية أساسية وضرورية التجريبية التي تسمح للباحثين لتوليد فيروسات الانفلونزا المؤتلف لدراسة جوانب متعددة في البيولوجيا من فيروس الانفلونزا ، وإلى أن تستخدم ناقلات المحتملة أو اللقاحات.

Abstract

وقد بذلت جهود من قبل عدد من المجموعات البحثية الأنفلونزا محوريا في تطوير وتحسين الأنفلونزا من الوراثة عكس الفيروس. أنشئت أصلا في عام 1999

Protocol

1. فيروس الانفلونزا ترنسفكأيشن الانقاذ

فيروس انفلونزا تنتمي إلى أسرة Orthomyxoviridae فيروسات الحمض النووي الريبي يلفها السلبية الذين تقطعت بهم السبل. الأنفلونزا فيروس A الجينوم يتكون من ثمانية جينات مختلفة من الحمض النووي الريبي القطبية السلبية التي ترميز ، على الأقل ، و 11 من البروتينات الفيروسية (الشكل 1) 4. سنركز في هذا التقرير ، على إنقاذ واحد من سلالة المختبر الأكثر شيوعا ، وأنفلونزا A/PR/8/34 ، 5 باستخدام البلازميدات ambisense (pDZ) يحتوي على 8 شرائح A/PR/8/34 الأنفلونزا الفيروسية ( الشكل 2).

للانقاذ من فيروسات الانفلونزا المؤتلف من الحمض النووي البلازميد ، نوصي 3 transfections مستقلة لكل فيروس المؤتلف. إذا حاولت أكثر من انقاذ فيروس المؤتلف ، وجدول الخطوات التالية accordantly لعدد من الفيروسات لانقاذهم. يتم تأسيس ترنسفكأيشن التالية وبروتوكول العدوى لمدة 6 لوحات رفاه. ويتضح تمثيل التخطيطي للبروتوكول في الشكل 3.

  1. OptiMEM Lipofectamine - 2000 (LPF2000) الخليط : إعداد 250 ميكرولتر من وسائل الاعلام OptiMEM و 6-8 ميكرولتر من LPF2000 ترنسفكأيشن الواحد. احتضان لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). وفي الوقت نفسه ، وإعداد خليط ترنسفكأيشن البلازميد.
  2. البلازميد خليط ترنسفكأيشن : تحضير الكوكتيل ترنسفكأيشن البلازميد في 50 ميكرولتر من وسائل الاعلام OptiMEM. نستخدم عادة 1 ميكروغرام لكل DNA البلازميد الأنفلونزا في الانقاذ. إضافة 1 ميكروليتر من البلازميدات pDZ (في 1 ميكروغرام / ميكرولتر) PB2 ، PB1 ، والسلطة الفلسطينية ، المغير ، NP ، NA ، M ، وNS لأنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من وسائل الاعلام OptiMEM.
  3. OptiMEM - LPF2000 الدنا خليط البلازميد : أضف 250 ميكرولتر من الخطوة 1.1 في خليط DNA البلازميد ترنسفكأيشن الأنفلونزا (الخطوة 1.2). احتضان هذا الخليط لمدة 20-30 دقيقة في RT. وفي الوقت نفسه ، وإعداد تعليق من الخلايا 293T وMDCK لترنسفكأيشن.
  4. إعداد 293T/MDCK الثقافة المشتركة : قبل أن تبدأ ، وجعل 1X PBS ، DMEM FBS 10 ٪ 1 ٪ وسائل الاعلام PS ، وخليط EDTA - التربسين إلى 37 درجة مئوية. وينبغي أن كثافة الخلايا تكون في التقاء 80-90 ٪ في اليوم من ترنسفكأيشن. عادة ، يمكن أن تستخدم واحدة متموجة طبق بقطر 100 ملم واحد من 293T متموجة طبق بقطر 100 ملم من الخلايا لمدة 10-12 MDCK الإنقاذ. نحن نذهب إلى استخدام 250 خلية لكل ميكرولتر من جيد. وسيتم معلق الخلية في كلا الخطين ما مجموعه 3 مل من FBS DMEM PS 10 ٪ 1 ٪.
    • resuspend بعناية كل سطر الخلية في 10 مل من FBS DMEM PS 10 ٪ 1 ٪ في أنبوب 15 مل الطرد المركزي. سيكون لديك أنبوب واحد لخلايا 293T وأنبوب واحد لخلايا MDCK.
    • Resuspend الخلايا 293T في 3 مل من FBS DMEM PS 10 ٪ 1 ٪ ، وعندما معلق ، وتقديم 3 مل إلى الخلايا MDCK resuspend لتلك الخلايا. هذا وسوف تعطيك مزيجا من الخلايا 293T وMDCK لاستخدامها للثقافة المشترك الخاص.
    • إضافة 250 ميكرولتر من الخلايا 293T/MDCK لكل بئر (10-12 6 آبار جيدا).
  5. بعد حضانة RT 20-30 دقيقة (الخطوة 1.3) ، إضافة 1 مل من FBS DMEM PS 10 ٪ 1 ٪ إلى خليط DNA - OptiMEM LPF2000 الأنفلونزا البلازميد.
  6. إضافة مل 1.3 (1.5 خطوة) في الآبار مع ميكرولتر 250 من خلايا 293T/MDCK (الخطوة 1.4).
  7. يهز بلطف 6 - جيدا لوحة ، والسماح للاحتضان ترنسفكأيشن بين عشية وضحاها (ON) في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
  8. اليوم التالي ، وحوالي 16-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، وتغير وسائل الاعلام واحتضان ترنسفكأيشن الخلايا على درجة البكالوريوس في transfected DMEM 0.3 ٪ 1 ٪ PS يحتوي على 1 ميكروغرام / مل من TPCK - التربسين لمدة 48 ساعة.
  9. بعد 48 ساعة من تغيير وسائل الإعلام ، ونقل طاف من الخلايا transfected في أنبوب microcentrifuge.
  10. أجهزة الطرد المركزي لطاف زراعة الأنسجة في microcentrifuge لمدة 1-2 دقائق ، 13000 دورة في الدقيقة.
  11. إصابة خلايا جديدة في MDCK 6 - جيدا لوحات (مطلي قبل يوم واحد) أو بيض الدجاج 10 يوما من العمر المحتوي مع 200 ميكرولتر من طرد supernatants زراعة الأنسجة من الخطوة 1.10. احتضان الخلايا و / أو البيض عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
    1. يتم تنفيذ كافة الإجراءات التي تصيب الدجاج البيض المحتوي تحت ظروف معقمة : العدوى من بيض الدجاج لمدة 10 أيام عمره المحتوي.
      1. شمعة البيض 10 يوما باستخدام مربع الضوء تشميع لرؤية التفاعل بين كيس الهواء وجوف السقاء. جعل علامة قلم رصاص على الحدود واجهة.
      2. بإبرة حقنة 5 مل جعل حفرة في قشرة البيضة.
      3. مع حقنة 1 مل ، تصيب كل البيض مع 200 ميكرولتر من supernatants زراعة الأنسجة من الخطوة 1.10.
      4. تغطية فتحة في قشر البيض مع ذاب الشمع باستخدام مسحة القطن.
      5. احتضان البيض المصابة في 37οC لمدة 2-3 أيام.
    2. إصابة خلايا جديدة MDCK : قبل يوم من مرور طاف زراعة الأنسجة من 293T/MDCK المشترك الثقافات ، قبلأطباق حلج وحة 6 بشكل جيد مع الخلايا للوصول إلى نقطة التقاء MDCK 80-90 ٪ في اليوم التالي. عادة ، يمكن تقسيم الأنسجة متموجة 100 ملم لوحة الثقافة في 08/06 الآبار. غسل الخلايا ، مرتين ، مع 1X PBS ، يعرض للتريبسين وإعداد لوحات 6 - جيدا. هزة برفق باليد على لوحات من أجل أن يكون توزيع الزي الرسمي للخلايا. ثقافة الخلايا ، ON ، في الحاضنة 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2. قبل الإصابة ، والتحقق من الخلايا تحت المجهر لتأكيد أحادي الطبقة ، ثم انتقل مع العدوى :
      • غسل الخلايا ، مرتين ، مع 1 مل من 1X PBS.
      • تصيب مع ميكرولتر 200 من طرد supernatants زراعة الأنسجة لمدة 1 ساعة على RT. لا تدع الخلايا الجافة. صخرة 6 - جيدا لوحة كل 10 دقائق.
      • بعد 1 ساعة من امتصاص الفيروسية ، وإزالة وسائل الإعلام العدوى من الخلايا MDCK وإضافة 2 مل من 0.3 ٪ BA DMEM PS 1 ٪ يحتوي على 1 ميكروغرام / مل من TPCK - التربسين.
      • في 48-72 ساعة بعد مرور ، اعتمادا على كفاءة ترنسفكأيشن وتحميل الفيروس ، وتأثير الاعتلال الخلوي (CPE) يمكن ملاحظتها في الخلايا المصابة MDCK. CPE تقترح خطة انقاذ ناجحة. ومع ذلك ، ينبغي أن تزال هناك مقايسة HA (القسم 2) يجب القيام بها لتأكيد وجود الفيروس في supernatants زراعة الأنسجة.
  12. يتم تنفيذ كافة الإجراءات لحصاد السائل السقائي من البيض المصابة تحت ظروف معقمة : الحصاد السائل السقائي من بيض الدجاج المصاب المحتوي. يمكن حصاده حوالي 8-12 مل من السائل السقائي البيض من كل 10 يوما من عمره مصاب. قبل الحصاد السائل السقائي ، احتضان للبيض الدجاج لمدة 2 ساعة (أو على) في 4 درجات مئوية لقتل الجنين الدجاج وتخثر الدم.
    • غسل قشر البيض مع الايثانول 70 ٪ إلى تهيئة الظروف العقيمة.
    • فتح البيض ، وبعناية ، عبر الهواء عن طريق التنصت على تجويف بملعقة. إزالة قشرة البيضة المكسورة بمساعدة ملقط.
    • بإبرة 1 مل ، إزالة الغشاء السقائي دون كسر صفار البيض و.
    • استقرار الجنين الدجاج مع ملعقة وأنتم تقودون ماصة 10 مل في السائل السقائي. كما جمع السائل السقائي أكبر قدر ممكن من أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل على الجليد في دلو الثلج دون كسر أو جمع أي من صفار البيض و. استخدام أجهزة الطرد المركزي أنبوب 15 مل لكل بيضة.
    • أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية ونقل السائل السقائي (من دون أخذ مكعبات خلايا الدم الحمراء) إلى 15 الطازجة أنابيب الطرد المركزي مل.
    • تخزين السوائل التي تحتوي على أنابيب طرد السقائي في 4 درجات مئوية حتى يتم التحقق من وجود الفيروس انقاذ مع مقايسة (HA) التراص.

2. HA مقايسة لتأكيد الانقاذ لفيروسات الأنفلونزا المؤتلف

يستخدم بشكل روتيني مقايسة التراص الدموي (HA) للكشف عن وجود الفيروس في انقاذ MDCK supernatants زراعة الأنسجة و / أو السائل السقائي البيض المقطوع. بدلا من ذلك ، يمكن المقايسات المناعي (IFA) يقوم أيضا. بمجرد أن يحدد الفحص وجود الفيروس انقاذ ، ينبغي أن يكون الفيروس وحة المنقى وسيتم التأكيد على التركيب الجيني للفيروس الذي RT - PCR وتسلسلها.

ويمكن تحديد وجود الفيروس في supernatants نسيج الثقافة MDCK و / أو في السائل السقائي من البيض المصابة به ظاهريا هكتار من الدجاج (أو مصدر آخر) خلايا الدم الحمراء (RBC). وجود الفيروس من RBC يدفع التراص في حين أن عدم وجود الفيروس يسمح تشكيل بيليه الحمراء في قاع البئر (الشكل 4). في حالة من فيروس الانفلونزا ، ويعتقد أن هناك حاجة وحدات اللوحة حوالي 10 3 4 -10 تشكيل (PFU) لإعطاء إشارة إيجابية في مقايسة HA ، وبالتالي ، يمكن أن يتم تنفيذ ايفا بالتوازي مع مقايسة لتأكيد HA نتيجة حقيقية سلبية. ايفا مع أضداد الأنفلونزا الأساسي هو أكثر حساسية من مقايسة HA لأنه يمكن الكشف عن أقل من 103-104 الفيروسات مع هذه التقنية. فمن الممكن من supernatants أو السوائل التي يتم السقائي HA - السلبية ايجابية من قبل شركة ايفا. في هذه الحالة ، ينبغي تضخيم الفيروس عن طريق الركض ، مرة أخرى ، أو في خلايا MDCK في البيض. وينبغي أن السائل السقائي و / أو supernatants زراعة الأنسجة من مرور الثانية ستكون إيجابية بشكل واضح الآن في مقايسة HA.

وتجرى فحوصات HA في لوحات 96 - V - جيدا القاع. السلبية (على سبيل المثال ، في برنامج تلفزيوني 1X) وإيجابية ينبغي (supernatants زراعة الأنسجة و / أو السائل السقائي من عدوى فيروس الأنفلونزا) دائما عينات مراقبة يتم تضمينها في أي فحص للتحقق من صحة HA عليه.

  • الاستغناء عن 50 ميكروليتر من PBS 1X في كل بئر من القاع - V - 96 لوحة جيدا.
  • إضافة ميكرولتر من 50وزراعة الأنسجة MDCK supernatants و / أو السائل السقائي من البيض المصابة إلى البئر الأولى ، وجعل 2 أضعاف التخفيفات التسلسلي للآبار التالية. تجاهل إضافية تبلغ 50 ميكرولتر من البئر الماضي.
  • إضافة 50 ميكرولتر 0.5 ٪ -1.0 ٪ خلايا الدم الحمراء الدجاج (المعد في برنامج تلفزيوني 1X) إلى كل بئر.
  • احتضان لV - 96 - أسفل جيدا لوحة 30-45 دقيقة (حتى نقطة حمراء واضحة في الجزء السفلي من عينة السيطرة السلبية PBS) على الجليد. قراءة وinterpretate النتائج كما هو مبين في الشكل 4.

3. مرور supernatants زراعة الأنسجة

قد تكون نتيجة الفحص سلبية في HA يكون نتيجة لانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن مع مستويات منخفضة من الفيروس الموجود حاليا في supernatants زراعة الأنسجة و / أو السوائل السقاء. ومرور هذه العينات في البيض الطازج MDCK و / أو المحتوي تسمح التضخيم من الفيروس (كما هو مبين في الشكل 3) تتم العدوى كما هو موضح سابقا في القسم 1.11.2.

4. ممثل النتائج

وسيتم تأكيد نجاح الانقاذ بواسطة فيروس الانفلونزا وجود فحص ايجابي HA (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، فإن وجود CPE في الخلايا المصابة مع supernatants زراعة الأنسجة أو مع البيض السائل السقائي من اقتراح الانقاذ ايجابية الفيروسية.

figure-protocol-11924
الشكل 1. إنفلونزا بنية الفيروسات : فيروس الأنفلونزا ويحيط بها طبقة ثنائية المادة الدهنية التي تحتوي على جليكوبروتينات two الفيروسي (HA ، NA) ، وأيضا البروتين القناة الايونية ، M2. ها هو البروتين الفيروسي المرفق ، وهو مسؤول عن الربط السياليك المحتوية على حامض المستقبلات. NA هي المسؤولة عن اطلاق سراح الفيروسية من الخلايا المضيفة. تحت طبقة ثنائية المادة الدهنية ، هي طبقة من البروتين يتكون من البروتين السطح الداخلي المغلف مصفوفة 1 ، M1 ، والتي تلعب دورا في التجمع الفيريون والناشئين والبروتين النووي المصدرة (النيب) ، واللازمة لتصدير المواد النووية من ribonucleocapsids الفيروسية. يرصد الأساسية للفيروس من مجمع (RNP) بروتين نووي ريبوزي ، التي تتألف من 8 المفرد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الجينات الفيروسية encapsidated السلبية التي البروتين النووي الفيروسي ، NP. المرتبطة RNP المعقدة هي الفيروسية بوليميريز الحمض النووي الريبي النووي الريبي التي تعتمد على مفارز السلطة الفلسطينية ، PB1 وPB2. البروتينات غير البنيوية وNS1 PB1 F2 ، المشفرة بواسطة الحمض النووي الريبي وشرائح NS PB1 ، على التوالي ، ليست جزءا من هيكل الفيريون.

figure-protocol-13117
الشكل 2. البلازميدات الأنفلونزا فيروس الإنقاذ : يشار إلى أن فيروس انفلونزا eight الجينات المستنسخة في pDZ ambisense البلازميد. pDZ البلازميد 6 ، المستمدة من بروتين تعبير البلازميد pCAGGs 7 ، هي ناقلات ثنائية الاتجاه البلازميد مع بوليميريز الحمض النووي الريبي الإنسان أنا المروج وتسلسل فاصل الفأر الذي بترميز الجينومية بالمعنى السلبي الحمض النووي الريبي ، في اتجاه معاكس للبوليميريز أنا توحد ، والثاني بوليميريز الكاسيت النسخ (دجاج β - أكتين المروج وpolyA) بترميز البروتينات الفيروسية من الجينات الفيروسية نفسها. تتولد من كل قطعة cDNAs الفيروسية التي كتبها RT - PCR مع الاشعال إلى الأمام وعكس نوكلياز داخلية تحتوي على قيود SAPI الموقع والمناطق noncoding كل جزء (مربعات سوداء في نهاية الجينات الفيروسية). هو استنساخ للمنتج PCR في pDZ يهضم مع SAP - I.

figure-protocol-14043
الشكل 3. ثمانية البلازميد المستندة إلى نظام الانقاذ الإنفلونزا : هي البلازميدات pDZ تحتوي على جينات الأنفلونزا الفيروسية 8 transfected المشترك ، في التعليق ، في 293T - MDCK الخلايا المشترك الثقافات (يوم 1). يتم استبدال أربع وعشرين ساعة بعد ترنسفكأيشن وسائل الاعلام ولكن من دون FBS تحتوي TPCK / التربسين (يوم 2). ثمان وأربعين ساعة بعد تغيير وسائل الإعلام ، هو المقطوع طاف نسيج الثقافة وتستخدم لنقل العدوى MDCK أو 10 يوما القديمة بيض الدجاج المحتوي (يوم 4). ويتم حصاد 48-72 ساعة بعد التضخيم ، supernatants زراعة الأنسجة من الخلايا المصابة MDCK أو السائل السقائي من البيض ويعاير عن وجود الفيروس بواسطة HA (اليوم 6). إذا لم يتم الكشف عن الفيروس ، يمكن supernatants نفسه و / أو السوائل السقائي إعادة passaged الى خلايا MDCK جديدة و / أو البيض المحتوي.

figure-protocol-14945
الشكل 4. راصة دموية مقايسة (HA) : RBC التراص من جسيمات الفيروس التي مرئيا وظاهريا هو الأساس للكشف عن الجسيمات الفيروسية في supernatants زراعة الأنسجة و / أو السوائل السقاء. على الرغم من أن الفحص HA لا يميز بين الجزيئات الفيروسية المعدية التي والجزيئات التي تتدهور وأنه لم يعد قادرا على إصابة الخلايا ، مقايسة يعد مؤشرا جيدا من وجود الفيروس في العينات. أ) يتم تحديد الغياب (أعلى) وجود (القاع) من الفيروس في العينات البيولوجية بواسطة جود RBC في الجزء السفلي من لوحة أو غيابهم ، التركيبectively. ب) ويرد ممثل عن نتيجة الفحص HA دون المستويات التي يمكن اكتشافها من فيروس (أعلى) أو وجود (القاع) من الفيروس.

Discussion

الانقاذ من فيروسات الانفلونزا المؤتلف من الحمض النووي البلازميد هو عملية بسيطة ومباشرة مرة واحدة يتم تنفيذ البروتوكول بشكل روتيني في المختبر ، ولكن في البداية ، يمكن للعديد من الأمور على غير ما يرام. لا بد أن يكون إعداد البلازميد جيدة لتوليد الفيروس. الصيانة السليمة...

Disclosures

جبل سيناء كلية الطب وحقوق الملكية الفكرية في مجال فيروسات الأنفلونزا المؤتلف ، وAG - S هو المخترع في هذه الملكية الفكرية.

Acknowledgements

الكتاب أريد أن أشكر أعضاء سابقون وحاليون في أدولفو غارسيا ساستري وبيتر باليس مختبرات لتطوير تقنيات الوراثة عكس الإنفلونزا والبلازميدات. وتمول جزئيا البحوث في مختبرات AG - S و التراث ، وهو مركز NIAID الممولة من التميز لأبحاث الأنفلونزا ومراقبة (HHSN266200700010C) ، ومنح NIAD R01AI046954 ، وU01AI070469 P01AI058113. ويمول جزئيا البحث في LM - S المختبر منح NIAID RO1AI077719.

Materials

خطوط خلية

293T (رقم الكتالوج CRL - 11268) وMDCK (رقم الكتالوج CCL - 34) تمسك خطوط الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 في FBS 10 ٪ DMEM ، PS 1 ٪. الخلايا هي شكل متاح للثقافة الأمريكية نوع مجموعة (آي تي ​​سي سي ، 10801 جامعة بوليفارد ، ماناساس بولاية فرجينيا. 20110-2209 الولايات المتحدة).

بيض الدجاج المحتوي

ويمكن الحصول على المحتوي بيض الدجاج 10 يوما من عمره من مختبرات نهر تشارلز ، رسوم محددة الطيور المرضي التموين (SPAFAS) منتجات الطيور والخدمات. فرانكلين العموم ، 106 شارع 32 ، شمال فرانكلين ، CT 06254 الولايات المتحدة الأمريكية. يتم تحضين البيض عند 37 درجة مئوية السابقة وبعد العدوى الفيروسية. قبل وبعد العدوى الفيروسية ، وcandled البيض لتحديد الجدوى من الأجنة. من المهم جدا أن نبحث عن البيض الموتى قبل وبعد العدوى الفيروسية. يمكن أن تكون العدوى قبل بيضة بالرصاص رصدت بسهولة بسبب عدم وجود الأوعية الدموية ، فضلا عن غياب الحراك الجنين. عندما candled والأجنة الحية التحرك. وبعد عدوى فيروسية تكون البويضة ميتة (ربما تتعلق عدوى فيروس الأنفلونزا) رصدت بسهولة عن طريق مظهر سيئ للبويضة من وجهة نظر حجم أصغر ودموية من السوائل السقاء. يتم التخلص من المصابين ، في أكياس البيض autoclavable المزدوجة وتعقيمها وفقا للإجراءات القياسية.

الدجاج خلايا الدم الحمراء (RBC)

يمكن شراؤها من مزارع الدجاج RBC Truslow ، 201 شارع وادي ، Chestertown ، MD 21620. المحل في 4 درجات مئوية. لفحوصات HA ، وغسل 5 مل من RBC الدجاج مع 45 مل من 1X PBS الطرد المركزي في أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 RPMS ، RT. تجاهل طاف بعناية واستخدام التخفيف 1:1000 من مكعبات في RBC 1X PBS (تركيز النهائي من RBC 0،5-1،0 ٪).

supernatants زراعة الأنسجة وسوائل السقائي

ويمكن تخزين كل من زراعة الأنسجة ، والسوائل supernatants السقائي في 4 درجات مئوية لفترة قصيرة من الزمن. بعد التأكد من فيروس الانقاذ ، يتم تخزين الفيروسات من supernatants الخلية أو السوائل في السقاء -80 درجة مئوية.

البلازميدات

وتعد جميع البلازميدات باستخدام طقم توصيات ماكسي البلازميد المصنعة التالية. جميع البلازميدات هي قسامة بتركيزات من 1 ميكروغرام / مل في DDH 2 O وتخزينها على -20 درجة مئوية. للتخزين على المدى القصير ، يمكن أن يكون الحفاظ على البلازميد في 4 درجات مئوية. يتم تحديد تركيز الحمض النووي البلازميد تنقيته بواسطة القياس الطيفي عند 260 نانومتر ، والتي تقدر نسبة النقاء باستخدام نانومتر 260:280. وتعتبر نسب الاستعدادات مع 1،8-2،0 نانومتر 260:280 المخصصة لأغراض الإنقاذ الفيروس. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي التركيز أكد البلازميد والنقاء مع agarose هلام اللوني. موضحة Ambisense pDZ البلازميدات (6) تحتوي على ثمانية جينات الأنفلونزا A/PR/8/34 الفيروسي (7) في الشكل 2.

الفيروسات

لا يمكن أن يؤديها في وصفها لانقاذ بروتوكول الأنفلونزا A/PR/8/34 تحت مستوى السلامة الأحيائية (BSL) 2 شروطه. ويجب تعقيم المواد الملوثة ، بما في ذلك supernatants زراعة الأنسجة والبيض المحتوي ، قبل التخلص منها. قد الانقاذ من فيروس الانفلونزا ظروف أخرى تتطلب أعلى BSL ، وبالتالي ، الشروط الخاصة / مقاييس الأمن وسوف يتعين اتباعها.

زراعة الأنسجة وسائل الاعلام والحلول

DMEM 10 ٪ FBS PS 1 ٪ : 445 مل Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) ، و 50 مل من مصل بقري جنيني (FBS) ، و 5 مل من البنسلين 100X / الستبرتوميسين (PS). المحل في 4 درجات مئوية. وسيتم استخدام هذه الوسائط للحفاظ على خلايا 293T MDCK وكذلك لtransfections. DMEM BA 0.3 ٪ 1 ٪ PS : 495.7 مل من DMEM ، 4.3 مل من 35 ٪ من الأبقار الزلال (BA). المحل في 4 درجات مئوية. قبل الاستخدام ، إضافة إلى تعامل TPCK التربسين تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / لتر. المعدية وسائل الإعلام.

10X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) : 80 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 2 غرام من بوكل ، 11.5 غراما من نا 2 4 هبو 0.7 H 2 O ، 2 غرام من KH 2 PO 4. إضافة DDH 2 O يصل إلى 1 لتر. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف. تخزين في درجة حرارة الغرفة.

1X PBS : خفف 10X مع PBS 01:10 DDH 2 O. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.

References

  1. Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).
  2. Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J Virol. 73, 9679-9682 (1999).
  3. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Recombinant influenza virus vectors. Future Virology. 2, 401-416 (2007).
  4. Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. Orthomyxoviridae. The viruses and their replication. Fields Virology. , 1647-1689 (2006).
  5. Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).
  6. Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein. J Virol. 79, 8431-8439 (2005).
  7. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

42 HA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved