جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

Summary

ويشيع استخدام الديدان المعدلة وراثيا في C. ايليجانس البحوث. ووصف هو بروتوكول بسيطة ، لكنها فعالة ، ليعرض في الجينات المحورة باستخدام الديدان القصف biolistic مع جزيئات الذهب المطلي الحمض النووي. على الجهد المبذول والنتائج من القصف إيجابية لدى مقارنتها microinjection لتوليد حيوانات معدلة وراثيا.

Abstract

عدد المختبرات باستخدام النيماتودا تعيش حرة C. ايليجانس يشهد نموا سريعا. ويعزى الإقبال على هذا النموذج البيولوجي إلى وقت الجيل السريع والقصير العمر ، صيانة سهلة وغير مكلفة ، تسلسل الجينوم بالكامل ، ومجموعة من الموارد رني والحيوانات الطافرة. بالإضافة إلى ذلك ، تحليل جيم كشفت ايليجانس الجينوم تشابه كبير بين الديدان والفقاريات العليا ، مما يوحي بأن البحث في الديدان يمكن أن يكون إضافة هامة للدراسات التي أجريت في الفئران كليا أو الخلايا المستزرعة. إن جزءا مهما من قوة والبحوث الدودة هي القدرة على استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا لدراسة الجينات وظيفة الترجمة. يمكن خلق حيوانات معدلة وراثيا إما عن طريق microinjection من germline دودة أو من خلال استخدام القصف biolistic. القصف هو أحدث تقنية وغير مألوفة لعدد من المعامل. نحن هنا وصف بروتوكول بسيط لتوليد الديدان المعدلة وراثيا عن طريق القصف biolistic مع جزيئات الذهب باستخدام بيو راد PDS - 1000 النظام. مقارنة الحمض النووي في microinjection germline خنثى ، هذا البروتوكول لديه ميزة لا تتطلب مهارات خاصة من المشغل فيما يتعلق بتحديد تشريح دودة أو أداء microinjection. وعادة ما يتم الحصول على مزيد من خطوط المعدلة وراثيا متعددة من القصف واحدة. أيضا على النقيض من microinjection ، قصف biolistic تنتج حيوانات محورة جينيا مع كل من صفائف خارج الصبغي والجينات المحورة المتكاملة. يمكن أن القدرة على الحصول على خطوط المعدلة وراثيا متكاملة تجنب استخدام البروتوكولات مطفرة لدمج الحمض النووي الأجنبية. في الختام ، يمكن أن يكون القصف biolistic طريقة جذابة لجيل من الحيوانات المعدلة وراثيا ، وخاصة بالنسبة للمحققين ليست مهتمة في الاستثمار في الوقت والجهد اللازم ليصبحوا مهرة في microinjection.

Protocol

نظرة عامة

وقد تولدت الديدان المعدلة وراثيا تقليديا microinjecting DNA التحوير في C. ايليجانس germline ^1،2،3،4. بينما ناجحة ، حسب هذا النهج المعدات المتخصصة وتطوير الخبرات مع تشريح دودة وتقنية microinjection. في الآونة الأخيرة وضعت القصف biolistic كنهج بديل والذي يستخدم الحمض النووي جزيئات الذهب المطلي لإدخال الحمض النووي الأجنبية إلى ^5،6 germline. هذا النهج يتطلب وقتا أقل في الاستثمار من حيث الممارسة لتصبح ناجحة.

القصف biolistic من جيم ايليجانس لتوليد الديدان المعدلة وراثيا وانخفاض الكفاءة على مستوى الفرد الدودة حتى النجاح يتطلب كمية كبيرة من الحيوانات. يمكن زراعتها في هذه بعدة طرق ، ولكن علينا استخدام لوحات البيض للحد من العمل وعدد من اللوحات المشاركة. بروتوكول لدينا يبدأ إعداد أطباق البيض والديدان ومن ثم يركز على القصف باستخدام بروتوكول بيو راد نظام سباعي PDS-1000/He. نحن لدينا بروتوكول تكييفها في جزء من عمل Berezikov ⁷ آخرون.

مع القصف ، وعادة ما تستخدم هذا الجين UNC - 119 كعلامة للحيوانات معدلة وراثيا. سلالات دودة تحمل هذا التحور وغير المنسقة بشدة والتحرك الا بصعوبة ، وبدين وقصير في المظهر ، وغير قادر على شكل يرقات dauer ^8. وdauer يشكل مرحلة اليرقات البديل الذي يستخدم لتأخير التنمية إلى الكبار الإنجابية في ظروف غير مواتية ، وينظم دخول dauer بواسطة الجينات متعددة ^9. عدة سلالات تحمل الجينات UNC - 119 تتوفر من C. ايليجانس مركز علم الوراثة (CGC ، مينيابوليس ، مينيسوتا). الأصلي DP38 سلالة (UNC - 119 (ed3)) يحمل أيضا لا علاقة لها dauer - تشكيل التأسيسية (داف ج) الطفرة التي يمكن أن تؤثر تجارب المصب. وقد outcrossed عدة مختبرات هذه الطفرة ، وسلالة HT1593 يتوفر من CGC. نجد أن الحيوانات المعدلة وراثيا إلى حد ما مع الأسهل تحديد سلالة DP38 وتميل إلى استخدام هذه السلالة لخلق حيوانات معدلة وراثيا. عندما يكون ذلك ضروريا ، ونحن نستخدم HT1593 إلى تهجين الديدان المعدلة وراثيا لإزالة طفرة داف ج. الحصول على الديدان DP38 أن تنمو هي واحدة من أبطأ الخطوات في البروتوكول حتى نتمكن من الحفاظ على المخزون المتزايد لوحات أثناء إعداد الجينات المحورة.

التعبير عن علامة UNC - 119 مع الجينات ذات الاهتمام يسمح سهولة تحديد الحيوانات معربا عن التحوير على أساس إنقاذ حركية طبيعية وحجم الجسم ^5. يمكن الحصول على UNC - 119 جينة من مصادر عدة ، والنواقل باستخدام الحمض النووي الجيني UNC - 119 ، UNC - 119 [كدنا] والمروج ، والحمض النووي الجيني لأصغر C. وتستخدم الجينات briggsiae ^8،10. وصفنا مؤخرا بروتوكولا بسيط لإضافة الكاسيت UNC - 119 على أي البلازميد التي تحتوي على جينات مقاومة الأمبيسيلين بواسطة تأشب مثلي ⁽¹¹⁾ وسيلة لتعديل fosmids دودة لحمل الجينات UNC - 119 - من قبل لجنة المساواة العرقية لوكس إعادة التركيب لتوليد حيوانات معدلة وراثيا ^12. والبلازميدات متوفرة من شركة Addgene (كمبريدج ، ماساتشوستس).

في حين أن الجهد المبذول في أداء قصف احد مهم ولكن التعامل معه ، والعمل الإضافي تشارك في تنفيذ عمليات القصف متعددة في يوم واحد هو الحد الأدنى. وبالتالي ، فإننا العنقودية بشكل روتيني إنتاج الديدان المعدلة وراثيا لخفض حجم العمل المطلوب في توليد كل منها.

1. إعداد طبق البيض

الديدان UNC - 119 متحولة من الصعب أن تنمو على لوحات NGM قياسية بسبب ضعف قدرتها على التنقل مع أنها تميل إلى تجويع على أجزاء من لوحة في حين أن أجزاء أخرى من لوحة لا تزال تحتوي على المواد الغذائية. لوحات البيض حل هذه المشكلة باعتبارها طبقة سميكة الغذاء على لوحات البيض يسمح UNC - 119 الديدان على الزحف بسهولة أكبر وأكثر من لوحة إلى اتخاذ جميع ^7. لوحات البيض أيضا الاستفادة من دعم نمو عدد كبير من الديدان لذا فنحن بحاجة لعدد أقل من لوحات ^13. 5 لوحات عادة البيض كافية لتنمو الديدان لمدة القصف. الوصفة أدناه يجعل ما يقرب من 50 لوحات ولكن يمكن أن يكون أقل من النصف لجعل الرغبة.

ويمكن لوحات البيض تصبح ملوثة بهذه السهولة التي نستخدمها كل من المضادات الحيوية والأدوية المضادة للفطريات في لوحات واستخدام البيض فقط التي تم إنشاؤها بواسطة العلاج هيبوكلوريت عن لوحات البذر.

اليوم 1 :

1. إعداد LB (400 مليلتر) في زجاجة 500mL. الأوتوكلاف ل20min.
2. صب ~ 50 10 سم لوحات باستخدام NGA NGA 1 ليتر مع آغار 2 ٪. نضيف النيستاتين 10 مل لتر الواحد والستربتوميسين إلى 200 ميكروغرام / مل ^13.
3. تنمو ثقافة مل بين عشية وضحاها من 40 1 - LB في OP50 مع الستربتوميسين ميكروغرام / 200 مل. هذه السلالة هو مقاومة والستربتوميسين المتاحة من شركة الخليج المتحدة.
4. الأوتوكلاف زجاجة ل500mLفي اليوم التالي.

يوم 2 :

1. فصل صفار بيض الدجاج من 10 في زجاجة معقمة. نستخدم فاصل صفار (متوفر في محلات المنزلية ، بما في ذلك الهدف). هزة.
2. ليصل حجم 400mL مع LB. هزة
3. في احتضان 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
4. تبرد لدرجة حرارة الغرفة.
5. إضافة 40mL من 1 OP50. هزة
6. توزيع 5-8 مل من الخليط في طبق من ذهب.
7. السماح لوحات ليستقر عند درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.

يوم 3 :

1. تصب بلطف السائل المتبقي من لوحات. السماح ليجف مع الأغطية على في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.

اليوم 4 :

1. وضع لوحات في صندوق أو كيس من البلاستيك وتخزينها في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها. هذه اللوحات يبدو على ما يرام لاستخدام لمدة 1-2 أشهر.

2. لوحات البذر البيض

1. توسيع الديدان DP38 في 6 لوحات NGA الطول بإضافة OP50 مركزة لوحات جوعا مؤخرا. للقصف واحدة ، ونحن نستخدم ~ 6 لوحات صغيرة لوحات البذور البيض 5. للقصف عدة ، ونحن نستخدم لوحات صغيرة لوحات بدلا من البذور 2 ببتون المخصب قبل البذر لوحات البيض.
2. عزل البيض من الديدان DP38 من خلال استخدام هيبوكلوريت ^13،14. Resuspend البيض في مخازن العقيمة القاعدية أو S - M9 ^13،14.
3. إضافة البيض (> 10،000 لكل لوحة) إلى عدد مناسب من اللوحات البيض. تنمو الديدان على لوحات البيض في 20 درجة مئوية لمدة 7-10 أيام لاستخدامه في عمليات القصف. وسوف تكون لوحات جاهزة للاستخدام مرة واحدة بدأت الديدان لمسح المواد الغذائية من لوحات. هذه اللوحات هي في الحقيقة من الصعب تجويع والمتنامية لفترات أطول من شأنها تحسين العائد دودة.

قصف

نحن نستعد للمخزون الذهب في وقت سابق ويبقيه المخزنة في 4 درجات مئوية للاستخدام. وهناك حاجة أيضا غير مرقط ورصدوا 10 سم لوحات NGA. لوحات غير مرقط تحتاج إلى صب في وقت مبكر ، وسمح لتجف تماما لتسهيل امتصاص السائل واضاف مع الديدان.

في يوم القصف ، ونحن يغسل الديدان أولا ثم البدء في التحضير للحمض النووي المغلفة جزيئات الذهب. ثم نضيف الديدان لوحات NGA غير مرقط والانتهاء من غسل جزيئات الذهب وتحويلها إلى macrocarriers.

الذهب الجسيمات التحضير :

1. تزن 60mg من جزيئات الذهب في أنبوب 1.7mL ونقع في الإيثانول 70 ٪ ل15min. تدور لفترة وجيزة لترسيب جزيئات الذهب.
2. تغسل 3 مرات في الماء المعقم وتدور لفترة وجيزة في كل مرة لجمع الذهب.
3. Resuspend الذهب في 1mL من الجلسرين العقيمة 50 ٪. هذا هو الحل الجسيمات الذهب الأسهم ويمكن تخزينها لعدة أشهر في 4 درجات مئوية.

الديدان :

1. تعويم الديدان DP38 قبالة البيض مع لوحات عازلة القاعدية أو S - M9 ونقلها إلى أنبوب 50mL المخروطية.
2. إبقاء الأنابيب على مقاعد البدلاء حتى الديدان هي في القاع. ثم نضح عازلة وإضافة جديدة القاعدية أو S - M9. غسل 2 أو 3 مرات ، حتى العازلة واضح نسبيا من الحطام. الحفاظ على الديدان في هذه الخطوة حتى يتم الانتهاء من طلاء الحمض النووي.
3. نضح وترك حوالي 2-3 مليلتر من الديدان في المخزن في القصف. نقل إلى لوحة 10 سم NGA غير مرقط على الجليد. فمن المهم التقليل من حجم نقل مثل لوحة NGA سوف تحتاج لتجف تماما قبل القصف. تأكد من تغطية كامل سطح اللوحة مع الديدان.
4. تسمح لوحة لتجف على الجليد. سوف الجليد منع الديدان من التثاقل بينما التجفيف.

هذه الخطوة هامة : لوحة ينبغي أن تكون جافة والديدان فرقت بالتساوي على لوحة NGA. حفظ الديدان على الجليد يمنعهم من التحرك على لوحة وتجميعها في أكوام.

الحمض النووي التحضير (لمدة القصف) :

1. المزيج في أنبوب 1.7mL :
   • 50μl جزيئات الذهب. Resuspend جيدا قبل ان يضيف.
   • 50μl الحمض النووي (10 15ug). نرى فرقا يذكر بين الحمض النووي دائرية أو خطية. وعادة ما نستخدم Qiagen midiprep خراطيش لتنقية الحمض النووي (Qiagen شركة ، فالنسيا ، كاليفورنيا).
   • 50μl 2.5M CaCl _2. هذا الحل هو مستقر لعدة اسابيع في درجة حرارة الغرفة.
   • 20μl 0.1M سبيرمدين.
     
     وسبيرمدين غير مستقرة في محلول مائي. نجعل aliquots سبيرمدين 70μl وتخزينها في -20 درجة مئوية. ثم نضيف الماء 1mL الحق قبل استخدامها للحصول على حل 0.1M. يجب أن يكون مستعدا لهذا الحل الطازجة كل القصف.
     
     نحن دوامة عادة جزيئات الذهب في أنبوب 1.7mL بسرعة منخفضة ثم إضافة CaCl ₂ ، الحمض النووي وسبيرمدين / قطرة قطرة بينما بروتامين vortexing. بالنسبة للشعب التي transfected فوسفات الكالسيوم مع هذا الأسلوب هو مألوف.
     
     لدينا أيضا استخدام بروتامين بدلا من سبيرمدين مع نتائج جيدة جدا ^15. نحن نستعد حل الطازجة (1mg/mL) في مجال المياه ولناه 50μl بدلا من 20μl من سبيرمدين. إذا أردنا استخدام بروتامين ، ونحن عادة احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق بدلا من وضع على الجليد. بروتامين لا تحتاج إلى أن تبقى مجمدة ، ومسحوق بدلا من السائل.
2. احتضان الخليط على الثلج لمدة 30min ، وتخلط بشكل دوري للحفاظ على جزيئات الذهب في التعليق. ثم تدور في فترة وجيزة ونضح طاف.
3. يغسل مع 300μl الايثانول 70 ٪. تدور لفترة وجيزة.
4. يغسل مع 1mL الإيثانول بنسبة 100 ٪. تدور لفترة وجيزة.
5. Resuspend في 170μl الإيثانول بنسبة 100 ٪.

إعداد macrocarriers :

1. شطف 7 macrocarriers (بيو راد مختبرات ، هرقل ، كاليفورنيا) في بروبانول - 2. وضعها على المناديل الورقية والسماح لهم الجاف في درجة حرارة الغرفة.
2. إضافة 20μl من الحمض النووي / خليط من الذهب في مركز كل macrocarrier. تأكد من دوامة الحق قبل pipetting للحفاظ على الذهب في التعليق.
3. السماح للايثانول تتبخر.

3. قصف

يجب التأكد من تنفيذ عملية القصف فارغة قبل تجربة لطرد الهيليوم من خلال النظام.

1. بدوره على مضخة فراغ مضخة وإغلاق فخ الفراغ. نحن نستخدم مضخة فراغ الخالية من الزيت.
2. تشغيل خزان الهيليوم. تأكد من أن الضغط ≥ 2200psi.
3. الرطب تمزق القرص (1350 رطل) في بروبانول - 2 ، ووضع سقف للفي الاحتفاظ محول سباعي.
4. المسمار محول في النظام PDS - 1000 وتشديد عزم الدوران مع وجع الموردة.
5. ضع macrocarriers 7 في ماسك ومقعد لهم أداة الموردة. ثم وضعت شاشة التوقف سباعي والقاع في لحاملها. حائز على الوجه ومكان على الرف الثاني من القمة. يجب على الجانب رصدت الذهب من macrocarriers يكون أسفل عند هذه النقطة.
6. محاذاة الفتحات الموجودة في الجزء العلوي من حامل macrocarrier مع منافذ لمحول سباعي.
7. مكان لوحة NGA المغلفة مع الديدان (خارج الغطاء) على الرف في الغرفة أدنى القصف.
8. مفتوحة تماما الفراغ معدل التدفق على مقبض PDS - 1000. اضغط على زر بطالة تصل حتى 26 في غرفة الزئبق. ثم التبديل إلى الاستمرار في الحفاظ على موقف فراغ.
9. اضغط مع الاستمرار على زر اطلاق النار حتى تمزق القرص. وهذا يحدث عندما يصل ضغط 1350psi. أحيانا يأخذ هذا 50-20 ثانية لتحدث. الافراج عن زر.
10. الافراج عن فراغ الغرفة (موقف تنفيس) ، وإزالة اللوحة.
11. بدوره قبالة الفراغ والهيليوم.
12. اطلاق النار عدة مرات حتى خط لا يحتوي على الهليوم (الهيليوم وينبغي قياس علامة 0 رطل).
13. إيقاف نظام PDS - 1000.

الانتعاش بعد القصف دودة :

1. ترك لوحة قصفت عند 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
2. تعويم الديدان من لوحة العازلة مع 10 مل S - القاعدية أو M9.
3. وضع الديدان 0.5mL على 20-10 سم رصدوا لوحات NGA.
4. ترك عند 20 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة (22-24 درجة مئوية) لحوالي 2 أسابيع قبل التحقق من وجود الديدان انقاذهم.
5. الشاشة للديدان مع النمط الظاهري UNC - 119 (+) مع مجهر تشريح. الوقت الأمثل للفحص وبعد لوحات وتجويع منذ الديدان انقاذ بميزة البقاء على قيد الحياة أكثر من غير أنقذت الديدان.
6. يولد الفرد من سطر واحد كل لوحة 10 سم الديدان التي تحتوي على انقاذهم.

4. ممثل النتائج

نجاح البروتوكول فيما يتعلق بالحصول على الحيوانات المعدلة وراثيا تعتمد على التحوير معينة. لالمروج : الجينات المحورة مراسل GFP لقد حصلنا على ما يصل الى 20 خطوط. والنتيجة هي أكثر نموذجية 30-10 خطوط. ما يصل الى 30 ٪ من خطوط المعدلة وراثيا هي خطوط متكاملة ، ولكن هذا هو عشوائي ، ونحن سوف تؤدي عمليات القصف متعددة في يوم واحد اذا هو المطلوب ولا سيما على خط متكامل.

Discussion

قصف Biolistic هي طريقة بسيطة لإدخال الحمض النووي الأجنبية إلى العديد من الكائنات الحية ، بما في ذلك جيم ايليجانس ^{1،5،6،7،16.} لأنه يعتمد على جزيئات الذهب تشكيل معقدة مع الحمض النووي في وجود CaCl _2. الأمينات الموجبة ، مثل سبيرمدين ، وحماية الحمض النووي من تدهور nu...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556