دراسة التجانس الخلية الدبقية التأثير على النمو أكسون باستخدام أسلوب جديد Coculture

Summary

في هذا البروتوكول ، وصفت لنا طريقة جديدة لدراسة تأثير عدم التجانس الخلايا الدبقية على النمو مع محوار في المختبر شارك في ثقافة النظام. وكانت الفئران مثقف الخلايا الدبقية القشرية للالتقاء وcocultured عالي النقاء مع الفئران العقد الجذرية الظهرية الخلايا العصبية. وتمت مقارنة تأثير مختلف الخلايا الدبقية على التصاق الخلايا العصبية والنمو محوار مباشرة في نفس الثقافة. هذا الأسلوب يوفر طريقة جديدة لدراسة الخلية مباشرة التجانس الدبقية تؤثر على التصاق الخلايا العصبية والنمو محور عصبي.

Abstract

في الجهاز العصبي المركزي لجميع الثدييات ، المحاوير قطعت بعد اصابة غير قادر على تجديد لأهدافها الأصلية والانتعاش وظيفية سيئة للغاية ^1. فشل تجديد محور عصبي هو نتيجة تضافر عوامل عدة من بينها البيئة الخلايا الدبقية معادية ، المثبطة الميلين جزيئات ذات الصلة ، وانخفضت القدرة الذاتية على التجدد الخلايا العصبية ^2. النجمية هي الأكثر الغالب نوع من الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي وتلعب دورا هاما في وظائف محوار تحت علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الظروف ^3. على النقيض من oligodendrocytes مثلي ، النجمية هي خلية السكان غير متجانسة تتألف من قبل مجموعات سكانية فرعية نجمية مختلفة مع morphologies متنوعة والتعبير الجيني ^4. الأهمية الفنية لهذا التباين ، مثل تأثيرها على النمو المحور ، غير معروفة الى حد كبير.

لدراسة الخلايا الدبقية ، وخصوصا وظيفة نجمية عدم التجانس في سلوك الخلايا العصبية ، التي أنشئت لدينا طريقة جديدة من خلال المشاركة في استنبات الخلايا العصبية المنقى الظهرية عالية العقد الجذرية مع الخلايا الدبقية التي تم الحصول عليها من القشرة الفئران. بواسطة هذه التقنية ، تمكنا من مقارنة مباشرة التصاق الخلايا العصبية والنمو محوار على المجموعات السكانية الفرعية النجمية المختلفة في إطار نفس الشرط.

في هذا التقرير ، أن نعطي للبروتوكول مفصل لهذا الأسلوب لعزل الخلايا النجمية والثقافة ، والعزلة الجذرية الظهرية العقد العصبية وتنقيتها ، وشارك في ثقافة DRG الخلايا العصبية مع الخلايا النجمية. ويمكن أيضا هذا الأسلوب أن تمتد إلى مناطق أخرى من الدماغ لدراسة التفاعل الخلوية أو إقليمية محددة بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية.

Protocol

1. الخلية الدبقية الثقافة

يمكن أن يكون مثقف الخلايا الدبقية من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. يظهر في الشكل العملية برمتها العملية.

يوم الثقافة طلاء 1 لوحة وcoverslips

1. ميكروسكوب تعقيم جاف الجولة coverslips في الأوتوكلاف.
2. لوحة coverslips تعقيمها في تعقيم لوحة الثقافة 24 أيضا.
3. معطف coverslips مع يسين بولي واحتضان لمدة 2 ساعة تحت درجة حرارة الجذر.
4. لوحات معطف الثقافة جيدا في 6 بنفس طريقة الخطوة 3.
5. غسل coverslips و 6 - جيدا لوحة الثقافة مرتين بالماء المقطر والهواء الجاف في غطاء الثقافة.
6. إضافة 200 المتوسطة DMEM ميكرولتر (FBS مع 10 ٪) في كل بئر في 24 لوحة وكذلك 2 مل في كل بئر في 6 - جيدا لوحة ووضعها في الحاضنة تحت درجة 37 مع 5 ٪ CO ₂

اليوم 2 القشرة عزل وزراعة الخلايا الدبقية

1. تعقيم تشريح تدفق إيجابي غطاء محرك السيارة.
2. بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
3. رش جميع الأسطح مع الايثانول 70 ٪ وانتظر 15 دقيقة قبل الاستخدام.
4. تغيير متوترة : تخدير الفئران الوليدة (P2 - P6) من انخفاض حرارة الجسم ، وقطع رأس في قاعدة ماغنوم framen باستخدام مقص التشغيل.
5. فتح الجمجمة على طول الدرز السهمي باستخدام مقص القزحية وتقشر الجمجمة.
6. إزالة الدماغ الأمامي ووضعها في المتوسط ​​L15 المبردة ، تحت stereomicroscope ونظيفة بعناية غشاء الجافية والحنون مع الأوعية الدموية ، وعزل القشرة ويغسل عدة مرات مع L15 المتوسط.
7. قطع القشرة الى قطع صغيرة مع مقص المجهرية.
8. إضافة 0.125 ٪ التربسين EDTA - L15 أعدت مع القشرة الى قطع متوسطة واحتضانها في 37 درجة لمدة 15 دقيقة.
9. نقل كتل الأنسجة في المتوسط ​​DMEM 20mL FBS مع 20 ٪ في 50mL الأنبوب ، إضافة إلى الأسهم الدناز الحل النهائي 10ug/mL تركيز ، نضح الحل النسيج صعودا وهبوطا لمدة 20 مرات مع الزجاج المصقول النار Pasteure ماصة ، وجمع الخلايا تعليق واحد.
10. غسل تعليق الخلية مرة واحدة مع DMEM المتوسطة ، وإعادة تعليق الخلايا في DMEM FBS مع 10 ٪ ، وعدد الخلايا تحت المجهر مع الخلايا عدادة الكريات البذور ، في 5000-10000/cm ^2. المحافظة على الخلايا في الحاضنة 37 درجة 5 ٪ ، وتغير من نصف المتوسط ​​2 مرات في الأسبوع.

2. الجذر الظهري عزل الخلايا العصبية العقد والثقافة وتنقية

اليوم 1 تحضير مادة الثقافة

1. معطف coverslips تعقيمها مع بولي يسين coverslips يغسل ، ومرتين مع تقطير المياه والهواء الجاف ، ووضعها في 24 لوحات جيدة.
2. إضافة المتوسطة Neurobasal 100μL مع 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50 نانوغرام / مل) ، ووضع لوحة في ثاني درجة 37 5 ₂ ٪.

اليوم 2 عزل DRGs من أجنة

1. تعقيم الغطاء التدفق بالطريقة نفسها كثقافة الخلية الدبقية.
2. الموت ببطء وفأر حامل (E15) بواسطة جرعة زائدة مع CO ₂ ، والبطن تعقيمها بواسطة الايثانول 70 ٪ ، معزولة الأجنة من رحم ووضعها موضع المتوسطة L15 مبردة.
3. عزل النخاع الشوكي متصلا مع العقد الجذرية الظهرية تحت stereomicroscope ونقل إلى الأطباق مع 35mm المتوسطة L15 مبردة.
4. تعليق واحد جمع خلية ويغسل مرة واحدة مع NBF المتوسط ​​(متوسطة Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50 نانوغرام / مل)).

اليوم 3 تنقية الخلايا العصبية DRG

1. 18H - 24H بعد البذر الخلايا العصبية ، إضافة 1 ملم الأسهم FUDR تتركز حل للثقافة عصبون إلى تركيز النهائي من 20 ميكرون ، والحجم النهائي من 200 ميكرولتر.
2. 72H في وقت لاحق ، يستعاض عن نصف المتوسط ​​مع المتوسطة Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50ng/mL) دون FUDR. بعد ذلك ، وتغير كل يوم وسيلة أخرى.

3. Coculture الخلايا العصبية مع الخلايا الدبقية DRG

1. وعندما وصلت الخلية الدبقية الثقافة التقاء (حوالي 20 يوما بعد البذر) ، وعلى استعداد لcoculture مع الخلايا العصبية.
2. قبل 24 ساعة مضيفا ان الخلايا العصبية المنقى ، تم تغيير الخلايا الدبقية المتوسطة والمتوسطة Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50 نانوغرام / مل).
3. وقد تم جمع الخلايا العصبية تنقيته من الآبار والثقافة ، والحصول على تعليق واحد الخلايا عن طريق تمرير الميكانيكية من خلال ماصة النار Pasteure المصقول.
4. بعد فرز العدد ، كان المصنف في الخلايا العصبية 500/cm ² على الخلايا الدبقية متكدسة في المتوسط ​​Neurobasal تحتوي على 2 ٪ B27 و2.5S NGF (50ng/mL).
5. ويمكن تسجيل نمو الخلايا العصبية والتصاق الخلايا الدبقية على neurite وتحليلها في نقاط زمنية مختلفة بواسطة برنامج تحليل الصور وكيمياء سيتولوجية مناعية باستخدام الأجسام المضادة نوع من الخلايا المحددة.

4. ممثل النتائج

1. زراعة الخلايا الدبقية : بعد الغرس وسوف تصبح الخلايا الدبقية متموجة حوالي 20 يوما. تحت microsc النقيض من المرحلةمكتب مستشار رئيس الوزراء ، تم التعرف عليه بسهولة أن مختلف المجموعات السكانية الفرعية الخلايا الدبقية المورفولوجية المختلفة شكلت الأساسات نمط النمو والخلايا النجمية GFAP إيجابية شكلت أكثر من 90 ٪ كما هو مبين من خلال تقنية immuocytochemisty (الشكل 1 ، الشكل 2).
2. وأظهرت الخلايا العصبية DRG في أسلوب لدينا ، بعد 72 ساعة FUDR العلاج ، ونقاء من الخلايا العصبية DRG سيصل عالية مثل 99 ٪ في غضون 6 أيام ، morphologies فريدة من نوعها والتي ترتفع فيها كثافة نمو neurite (الشكل 3 الشكل 4) : DRG الخلايا العصبية الثقافة.
3. الخلية الدبقية والخلايا العصبية coculture : DRG الخلايا العصبية الالتصاق وثمرة neurite حدث بسهولة على الخلايا الدبقية في غضون 4 ساعات بعد الغرس والملاحظات بعناية أظهرت أن تأثرت التصاق الخلايا العصبية والنمو neurite بواسطة الخلية الدبقية المجموعات السكانية الفرعية الخاصة التي شكلت الأساسات نمط النمو ، يمكن التعرف بسهولة على هذا تحت المجهر النقيض من مرحلة وكيمياء سيتولوجية مناعية (الشكل 5 الشكل 6).

الشكل 1. مورفولوجيا الخلايا الدبقية متموجة. كانت مطلية الخلايا الدبقية القشرية على ساترة المغلفة متعدد الليزين وتربيتها لمدة 20 يوما ، لاحظ نمط النمو مختلفة من الخلايا الدبقية ، الخلايا على الجانب الأيسر رتبت بطريقة المشعة.

الشكل 2. الخلايا الدبقية متموجة صفها الدبقية الضد لييفي الحمضية (GFAP) البروتين. ملاحظة الترتيب يشع من الخلايا (الحمراء) GFAP إيجابي على الجانب الأيمن.

الشكل 3. نمت الخلايا العصبية العقد الجذرية الظهرية في المختبر من دون علاج FUDR. الخلايا الملوثة شكلت خلفية DRG الخلايا العصبية ".

الشكل 4. نمت الخلايا العصبية العقد الجذرية الظهرية في المختبر بعد العلاج FUDR. تم القضاء على الخلايا الخلفية تلويث تماما.

الشكل 5. العقد الجذرية الظهرية الخلايا العصبية المزروعة في الخلايا الدبقية ، وقد تحول دون التصاق الخلايا العصبية والنمو neurite على خلايا تشع رتبت ومحدودة على الخلايا الدبقية الجانب الأيمن.

الشكل 6. وكان العقد الجذرية الظهرية الخلايا العصبية المتزايدة على الخلايا الدبقية التي المسمى neurofilament الأضداد ، وقد تحول دون وneurite (الأخضر) على الترتيب يشع الخلايا الدبقية الجانب الأيسر ومحدودة على الجانب الأيمن ، وصفت جميع الخلايا الدبقية التي الضد GFAP (الحمراء).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد صمم هذا البروتوكول التجربة للوصول إلى هدفين لدراسة الخلايا الدبقية ، وتأثير عدم التجانس نجمية خصوصا على التصاق الخلايا العصبية والنمو neurite. وكان الهدف الأول هو الحفاظ على تجانس نجمية قدر الإمكان ، في هذه التجربة ، مختلطة متموجة ثقافة الخلية الدبقية النجمية أغنت ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM(high glucose)	Invitrogen	10313-039
L15 medium	Invitrogen	11415-114
FBS	Invitrogen	10437-077
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
poly-lysine	Sigma-Aldrich	P4832	culture grade
NGF(2.5S)	Invitrogen	13257-019
B27 supplyment	Invitrogen	17504-044
0.25% trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503
neurofilament antibody	Abcam	ab24575