الاستقراء والتقييم من فئة التوحد التبديل في تنقية خلايا الفئران B

Summary

عقب التعرض لمستضد ، مجموعات سكانية فرعية من الخلايا باء يمكنهم الخضوع لعملية إعادة التركيب المعروفة باسم الطبقة التبديل (CSR) لإنتاج الأجسام المضادة مع وظائف isotypes المستجيب متميزة. بروتوكول المبينة في هذا التقرير يشرح كيف يمكن أن يتسبب المسؤولية الاجتماعية للشركات وتحليلها في المختبر لأغراض الدراسة وظيفة الخلايا باء.

Abstract

الحصانة الخلطية هي فرع من فروع الجهاز المناعي التي تحتفظ بها الخلايا البائية وتوسطت من خلال إفراز الأجسام المضادة. عند تنشيط خلايا B ، بموضع المناعي يخضع لسلسلة من التعديلات الوراثية لتغيير القدرة ملزمة وظيفة المستجيب يفرز الأجسام المضادة. ومن ابرز هذه العملية من خلال إعادة التركيب الجيني حدث المعروفة باسم التهجين تبديل فئة (CSR) التي يتم فيها استبدال الضد الغلوبولين المناعي isotype الافتراضي لأحد IgG و IgA ، أو إيج. كل isotype تمتلك وظائف متميزة المستجيب مما يجعل المسؤولية الاجتماعية للشركات حاسما في الحفاظ على الحصانة.

وتوسطت تنويع موضع المناعي من سيتيدين انزيم نازعة أمين التنشيط التي يسببها (AID). شريط فيديو التخطيطي اصفا هذه العملية بالتفصيل على شبكة الإنترنت (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). عادة يتم دراسة النشاط المعونة ومسار المسؤولية الاجتماعية للشركات في تقييم وظيفة الخلايا باء والحصانة الخلطية في الفئران. بروتوكول المبينة في هذا التقرير وسيلة لعزل الخلايا B من الطحال الفئران والتحفيز لاحقة مع lipopolysaccharide البكتيرية (LPS) للحث على التحول إلى فئة IgG3 (على الضد isotypes الأخرى أنظر الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام صبغة الفلورسنت تلوين الخلية Carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) لمراقبة تقسيم خلية من خلايا حفز ، وهي عملية حاسمة لisotype التبديل ^{1 و 2.}

تنظيم المساعدات والآلية التي يحدث المسؤولية الاجتماعية للشركات لا تزال غير واضحة ، وبالتالي في فحوصات المختبر تبديل فئة توفر طريقة موثوق بها لاختبار هذه العمليات في نماذج الماوس المختلفة. كانت هذه المقايسات التي سبق استخدامها في سياق نقص الجينات باستخدام الفئران بالضربة القاضية ^3. وعلاوة على ذلك ، يمكن التبديل في المختبر من خلايا B يسبقه تنبيغ الفيروسية لتعديل التعبير الجيني بواسطة الحمض النووي الريبي ضربة قاضية أو التحوير التعبير ^4-6. أثرت البيانات من هذه الأنواع من التجارب فهمنا للنشاط AID ، القرار من ردود الفعل المسؤولية الاجتماعية للشركات ، والأجسام المضادة التي تتوسط فيها الحصانة في الماوس.

Protocol

الخطوة الأولى : عزل خلايا B الطحال عبر تخصيب المغناطيسي

1. وينبغي أن الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسابيع فئران التجارب لضمان النضج التام للنظام المناعي.
2. الموت ببطء الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم ونقع في الايثانول 70 ٪. إزالة الطحال جراحيا عن طريق شق طريق الجلد والعضلات من hypochondrium الأيسر من البطن وقطع عليه في ثلاث قطع كبيرة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). التأكد من أن كل الأدوات والكواشف ومعقمة.
3. استخدام المطاط في نهاية المكبس من المحاقن 1 مل ، برفق الهريس والطحال من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني. تأكد من استخدام اقتراح دفع بدلا من الحركة وطحن طحن قد تؤدي إلى تمزق الخلايا أكبر (أي تكاثر).
4. تدور باستمرار في الخلايا لا يزيد عن 350 جرام لمدة 5 دقائق وresuspend وبيليه في برنامج تلفزيوني. عد الخلايا باستخدام معلق عدادة الكريات.
5. يعد الوقف من الخلايا 1x10 ⁸ / مل في برنامج تلفزيوني مع 5 ٪ مصل الفئران العادية في معقمة 5 مل أنبوب البوليسترين مع قبعة (حجم أقصى 2 مل في أنبوب).
6. إضافة 50 ميكرولتر من EasySep ماوس اختيار السلبية كوكتيل B التخصيب خلية لكل مليلتر من الخلايا. ماصة الخليط ، وكأب للأنابيب ، ووضعه في البراد لمدة 15 دقيقة.
7. إضافة 100 ميكرولتر اختيار البيوتين EasySep كوكتيل لكل مليلتر من الخلايا. ماصة الخليط ، وكأب للأنابيب ، ووضعه في البراد لمدة 15 دقيقة.
8. إضافة 100 ميكرولتر من النانوية المغناطيسية EasySep (ضمان النانوية تمتزج جيدا ، والحل هو متجانسة) لكل مليلتر من الخلايا. ماصة الخليط ، وكأب للأنابيب ، ووضعه في البراد لمدة 5 دقائق.
9. أعلى الحل ل2.5mL مع برنامج تلفزيوني وتجري في المغناطيس EasySep لمدة 5 دقائق. عكس المغناطيس وأنبوب بسرعة وتصب في أنبوب البوليسترين جديدة. لا تهزه أنبوب كما سيتم تحديد الخلايا مغناطيسيا ملزمة سلبا على جدران الأنبوب.
10. وذلك لزيادة نقاء التعليق الخلية ، قد يتم إعادة إدراج أنبوب إلى المغناطيس لمدة 5 دقائق إضافية ، وسكب في أنبوب جديد. هذا قد خفض إجمالي الانتعاش الخلية.
11. ويمكن تقييم B نقاء خلية تحليل تدفق cytometric علامات B سطح الخلية. بعد تخصيب ، ونحن نرى دائما نقاء من الخلايا> 95 ٪ ايجابي B220.

الخطوة الثانية : CFSE تلوين الخلية

1. Resuspend الخلايا المعزولة في برنامج تلفزيوني الدافئة تستكمل مع المصل البقري بنسبة 0.1 ٪ عند تركيز الألبومين النهائي 1 × ⁶ 10 خلايا لكل مليلتر.
2. إعداد محلول المخزون من 5mM CFSE (مخفف في سلفوكسيد ثنائي ميثيل العقيمة) وإضافة 2μL لكل مليلتر من الخلايا في الأنبوب. التركيز النهائي لل10μM هو الأمثل لتلطيخ من الخلايا باء الابتدائي.
3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في الظلام (ملاحظة : CFSE خفيفة حساسة ويجب أن تبقى في الظلام عندما يكون ذلك ممكنا).
4. إخماد صمة عار عن طريق إضافة حجم مساو من مصل العجل البقري إلى خلاياك وتفرخ على الجليد لمدة 5 دقائق.
5. غسل الخلايا التي تحتل المرتبة الاولى تصل الأنابيب مع الثقافة المتوسطة (انظر الخطوة الثالثة للصفة) والطرد المركزي في 350 غرام. علما أنه يجب أن يضاف ما لا يقل عن 5 مرات ما يعادل حجم وسائل الإعلام للتصدي لزوجة من المصل البقري والعجل للخلايا لانتاج بيليه.
6. غسل الخلايا أكثر مرتين في المتوسط ​​الثقافة. الخلايا هي الآن جاهزة للتحفيز.

الخطوة الثالثة : تحفيز الخلية مع LPS

1. إعداد المختبر الخاص في الخلية B مستنبت من خلال استكمال RPMI 1640 مع 10 ٪ مصل العجل الجنين و 50 ميكرومتر / β - المركابتويثانول.
2. إعداد المتوسطة التحفيز الخاص بإضافة LPS بتركيز نهائي 50μg/mL. قسامة 125 ميكرولتر من التحفيز المتوسطة في كل جانب من قاع مسطح 96 - جيدا وحة زراعة الأنسجة.
3. تحضير الخلايا B CFSE الملطخة في مستنبت دون LPS بتركيز نهائي قدره 3.2 × 10 ⁶ خلية / مل. إضافة 125 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى الآبار التي تحتوي على التحفيز والمتوسطة الخاص الخليط بواسطة pipetting بلطف.
4. كل بئر يحتوي الآن على 10 ⁵ 4 × الخلايا في تركيز LPS النهائية من 25 ميكروغرام / مل. وهذا يوفر المستويات المثلى من تكاثر الخلايا والتحول الطبقي ، على الرغم من التعديلات التي قد تكون لهذه القيم كما هو مطلوب.
5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ لمدة 72 إلى 96 ساعة. بعد 48 ساعة ، ومجموعات كبيرة الخلايا المتكاثرة B تكون مرئية بوضوح تحت المجهر.

رابعا الخطوة : تحليل تدفق cytometric التحول الطبقي

1. عندما كنت على استعداد للنظر في تبديل الطبقة ، وإزالة الخلايا الخاصة بك من ظروف ثقافتهم وغسلها مرتين في 1 مل من تلطيخ العازلة (PBS مع 2 ٪ مصل العجل البقري).
2. لمنع غير محددة تلوين الأجسام المضادة لخلايا الخاص بك ، بيليه الخلايا من خلال الدوران عليهم في 350 غرام وincubaالشركة المصرية للاتصالات لهم في 100μL من تلطيخ العازلة مع 5 ٪ مصل الفأر العادي و1μg الخلايا per106 FcBlock لمدة 15 دقيقة على الجليد. يجب أن يتم تنفيذ حظر خلية على الجليد.
3. دون غسل خلايا الجسم ، إضافة 1μg في الخلايا ⁶ 10 من الأضداد المضادة الموسومة fluorescently IgG3 الماوس وتسمح للخلايا لصبغ لمدة 30 دقيقة على الجليد.
4. غسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي ، ومرتين في resuspend 200-300 ميكرولتر من تلطيخ العازلة. الخلايا على استعداد الآن للتقييم من قبل التدفق الخلوي.
5. هو متحمس بشكل أمثل في CFSE 492 نانومتر (بواسطة ليزر أيون الأرجون) وتنبعث في 517 نانومتر. الطيف الإثارة وانبعاث الجسم المضاد IgG3 يعتمد على صبغة الفلورسنت المتقارن لها.

ممثل النتائج

بعد تخصيب المغناطيسي ، ينبغي تعليق خلية تبدو وكأنها متجانسة من السكان الخلايا تمييزه دائرية صغيرة (الشكل 1A). بعد 48-72 ساعة من التحفيز ، ومجموعات معزولة من تضخم الخلايا المتكاثرة تكون مرئية بشكل واضح (الشكل 1B). وهناك نسبة كبيرة من الخلايا غير الصغيرة وتتكاثر تظهر حبيبات لأنها تخضع لموت الخلايا المبرمج.

يمكن عادة يتم الكشف عن المسؤولية الاجتماعية للشركات على أعلى المستويات بين 72 و 96 ساعة بعد التحفيز قبل معظم الخلايا تموت ^7. في هذه المرحلة ، يجب أن خضعت لعدد من الخلايا الانقسامات الخلوية مع تبديل الخلايا التي تظهر في الخلية في وقت لاحق ابنة السكان. ويمكن رؤية تدفق مؤامرة ممثل cytometric التخفيف CFSE والتعبير سطح IgG3 بعد 96 ساعة من التحفيز LPS في الشكل 2.

الجدول 1. Isotype التبديل الكوكتيلات. ملاحظة : قيم تركيز المنشطات هي توصيات فقط. قد يكون من الضروري المعايرة.

المطلوب Isotype	التحفيز كوكتيل
IgG1and إيج	LPS (25μg/mL) و IL - 4 (10 نانوغرام / مل)
IgG1and إيج	مكافحة CD40 (10μg/mL) و IL - 4 (10 نانوغرام / مل)
IgG2a	LPS (25μg/mL) ، والإنترفيرون γ (10 نانوغرام / مل)
وIgG2b IgG3	LPS (25μg/mL)
ايغا	LPS (25μg/mL) ، TGF - β (2 نانوغرام / مل) و IL - 5 (1.5 نانوغرام / مل)

الشكل 1. عزل وLPS تحفيز خلايا B الطحال. (أ) المخصب مغناطيسيا خلايا B الطحال قبل التحفيز LPS. (ب) بعد 48 ساعة من التحفيز مع 25 ميكروغرام / مل من LPS. وتعتبر الخلايا المتكاثرة في شكل مجموعات من الخلايا خلفية التفجير وأفكارك.

الشكل 2. الانتشار وإعادة التركيب الطبقي التبديل بعد 96 ساعة. (أ) لحفز تخفيف CFSE LPS الخلايا بعد 96 ساعة في الثقافة. كل مستقل يمثل الذروة في التخفيف مضان CFSE المقابلة لانقسام الخلايا المستقلة. (ب) IgG3 التعبير تبين ظهور السكان IgG3 إيجابية بعد عدة جولات من انقسام الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

بروتوكول المبينة أعلاه يوفر الفحص القياسية لتحليل التعبير AID وظيفة خلال تبديل طبقة من الخلايا الأولية باء الفئران. هذا البروتوكول يستخدم LPS البكتيرية للحث على التحول من الغلوبولين المناعي لIgG3 ، على الرغم من أن تتمكن من إجراء تعديلات على وسائل الإعلام للحث على تحفيز ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate Buffered Saline	GIBCO, by Life Technologies	14190
EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19754
Polystyrene tubes	BD Biosciences	352058
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34554
Bovine Calf Serum	Hyclone	SH30072.03
RPMI 1640 Culture Medium	GIBCO, by Life Technologies	11875
Lipopolysaccharides from Escherichia coli	Sigma-Aldrich	L6529
β-mercapt–thanol	GIBCO, by Life Technologies	21985
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03
Normal Mouse Serum	Jackson ImmunoResearch	011-000
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
Rat Anti-Mouse IgG3	BD Biosciences	553401