غراميسيدين القائم على الفحص الإسفار ؛ لتحديد الجزيئات الصغيرة المحتملة لتعديل خصائص طبقة ثنائية الدهن

Summary

نحن نقدم سريع مضان مقايسة على أساس أن يراقب معدل التبريد مضان كمقياس للنشاط قناة غراميسيدين. وتستخدم القنوات غراميسيدين ومحولات القوة الجزيئية لمراقبة التغيرات في خصائص طبقة ثنائية المادة الدهنية كما لمست من البروتينات التي تغطي طبقة ثنائية.

Abstract

العديد من الأدوية والجزيئات الصغيرة الأخرى المستخدمة لتعديل الوظيفة البيولوجية هي التي amphiphiles كثف في واجهة طبقة ثنائية / حل ، وبالتالي تغيير خصائص طبقة ثنائية المادة الدهنية. هذا أمر مهم لأن تقترن بنشاط بروتينات غشاء لطبقة ثنائية المضيف عن طريق التفاعلات مسعور. التغييرات في خصائص طبقة ثنائية الغشاء يغير بالتالي وظيفة البروتين ، الذي يوفر وسيلة غير مباشرة لamphiphiles لتعديل وظيفة البروتين وآلية ممكنة ل"خارج الهدف" آثار المخدرات. وضعنا مسبقا مقايسة الكهربية للكشف عن تغيرات في خصائص طبقة ثنائية الدهن باستخدام قنوات غراميسيدين الخطي كما تحقيقات ^3،12. قنوات غراميسيدين هي بروتينات صغيرة تشكلت بواسطة ثنائي transbilayer مفارز من غير إجراء اثنين. فهي حساسة للتغيرات في البيئة الغشاء ، مما يجعل منهم تحقيقات قوية لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية المادة الدهنية كما لمست من البروتينات التي تغطي طبقة ثنائية. علينا أن نظهر الآن فحص مضان للكشف عن تغيرات في خصائص طبقة ثنائية باستخدام قنوات نفس التحقيقات. يستند هذا الفحص على قياس الوقت أثناء التبريد مضان من fluorophore محملة حويصلات unilamellar كبير بسبب دخول من خلال القنوات فاكهه تقضي غراميسيدين. نستخدم مضان مؤشر / فاكهه تقضي الزوج aminonaphthalene 8 - 1 - ،3،6 trisulfonate (النمل) / TL ⁺ التي استخدمت بنجاح في سائر المقايسات تبريد ^5،13 مضان. TL ⁺ تتخلل طبقة ثنائية الدهن ببطء ^{8 ولكن} يمر بسهولة من خلال إجراء قنوات غراميسيدين ^1،14. الأسلوب هو تحجيم ومناسبة لكلا الدراستين الآلي والفرز الفائق الإنتاجية من جزيئات صغيرة لإقلاق - طبقة ثنائية ، وإمكانات "خارج الهدف" ، والآثار. نجد أن النتائج باستخدام هذا الأسلوب في اتفاق جيد مع النتائج السابقة الكهربية ^12.

Protocol

1. توليد النمل مليئة الليبوزومات

1. في يوم 1 ، إزالة المذيبات العضوية من الدهون.
2. إزالة الشحوم من الثلاجة واتركها لتتوازن درجة حرارة الغرفة.
3. إضافة 0.6 مل من 25 ملغ / مل (1،2 - dierucoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine) من المادة الدهنية في حل الكلوروفورم إلى قارورة سعة 25 مل أسفل الجولة.
4. تدوير القارورة باستمرار بينما التجفيف تحت النيتروجين ، وحتى جميع كلوروفورم تبخرت ورقيقة بيضاء من المعاطف الدهون في النصف السفلي من القارورة كلها.
5. الجافة في ظل فراغ dessicator بين عشية وضحاها.

1. في يوم 2 ، وإعداد العينة مع fluorophore التي سيتم دمجها في الحويصلات.
2. ترطيب في 100 ملي NANO _{3 ​​و} 25 ملي النمل (نا الملح) ، 10 HEPES ملم. استخدام HNO ₃ أو هيدروكسيد الصوديوم لتعديل درجة الحموضة إلى 7.0. كل جزيء النمل قد نا 2 ⁺ ، ليصبح المجموع 150 مم ^[+ نا]. إضافة 1.671 مل المنحل بالكهرباء للحصول على تعليق الدهون 10 ملم.
3. ووقف دوامة Parafilm بدقة.
4. حماية عينة من الضوء مع احباط والسماح لها عمر في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.

1. في يوم 3 ، وجعل unilamellar حويصلات كبيرة وإزالة كافة fluorophore من خارج الحويصلات.
2. يصوتن لل1 دقيقة في sonicator المنخفض للطاقة.
3. تجميد أذاب نموذج 5-6 مرات ، كل مرة مع 5 دقائق على الثلج الجاف والحار في 5 دقائق (~ 50 درجة مئوية) المياه.
4. بثق تعليق الدهون باستخدام أفانتي مصغرة الطارد. إعداد مصغرة الطارد مع فلتر ميكرون البولي 0.1 و يدعم مرشح (انظر دليل الطارد للتفاصيل). بثق تعليق ذهابا وإيابا 21 مرة بحيث ينتهي التعليق على حقنة المعاكس. عندما دفعات متعددة مقذوف ، ونتذكر دائما لتحميل عينات مع حقنة واحدة. خلال قذف ينبغي للتعليق غائم الدهون الأولي تصبح شفافة تقريبا (سيكون لا يزال الصفراء بسبب fluorophore النمل). إذا قذف فجأة يصبح أكثر سهولة وأقل ضغطا وهناك حاجة للتحرك من خلال التصفية ، قد تمزق التصفية ، وسوف تحتاج إلى استبداله.
5. إزالة النمل الخارجية عن طريق تشغيل نظام التعليق مقذوف على عمود تحلية PD - 10 باستخدام بروتوكول الجاذبية. يوازن العمود مع 20-30 مل من نا العازلة (140 ملي NANO _{3 ​​و} 10 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 7.0 ، تذكر استخدام HNO ₃ أو هيدروكسيد الصوديوم لتعديل درجة الحموضة). إضافة 1.5 مل من الدهون مقذوف التعليق على العمود والسماح لها تتسرب فيها إحضار إجمالي حجم العينة إلى 2.5 مل وذلك بإضافة 1 مل نا العازلة. بعد دمج تماما عازلة داخل عمود وليس هناك ما هو تسرب ، وأزل الليبوزومات مع 3 مل من نا العازلة وجمع العينة الناتجة عن ذلك. النمل الناتجة تملأ LUV محلول المخزون يجب أن تحتوي على حوالي 4-5 ملي الدهون وشفافة تظهر أبيض حليبي. حماية عينة من الضوء مع احباط.
6. إذا لم يتم استخدام محلول المخزون على الفور ، وتخزين حتى 13 درجة مئوية لمدة أقصاها 7 أيام. تحذير : لا تجميد أو تبريد حل الدهون السائلة تحت درجة حرارة التحول إلى مرحلة الكريستال (~ 12 درجة مئوية) ، حيث سيؤدي ذلك إلى تدمير الحويصلات النزاهة "وfluorophore سوف يتسرب.

2. مزيج محلول الإسفار

1. قبل 24 ساعة من الاستخدام ، وتمييع الليبوزومات مع احتضان غراميسيدين (عند درجة 13). موازنة من غراميسيدين بين الحويصلات monolayers الدهون "الداخلي والخارجي هي عملية بطيئة وتتطلب حضانة طويلة.
2. دوامة بدقة سوف النمل مليئة LUV محلول المخزون كما LUVs لديها كثافة> 1 غرام / مليلتر والرواسب بالتالي في الحلول.
3. مزيج من النمل مليئة LUV 1:20 الأسهم في نا العازلة. مزيج جميع الليبوزومات لاستخدامها في يوم واحد من التجارب معا في قارورة واحدة لتعزيز التوحيد العينة.
4. فصل 3 / 4 من الليبوزومات وإضافة إلى 260 نانومتر غراميسيدين قبل مخففة في DMSO (500 ميكروغرام / مل).
5. إلى ما تبقى من 1 / 4 إضافة نفس الحجم من DMSO (بدون غراميسيدين) للحفاظ على تركيز المذيب ثابت في جميع العينات.

3. إعداد الصك الإسفار

1. نستخدم التطبيقية Photophysics SX.20 توقف تدفق مقياس التألق الطيفي مع التحكم في درجة الحرارة لقياس معدل تبريد مضان.
2. بدوره على الصكوك ساعة قبل الموعد المحدد للسماح لالاحماء. المكونات هي : الكمبيوتر ، وحدة التحكم الإلكتروني ، والمياه ، حمام (سواء برودة وسخان) ، مصباح الكهرباء وخزان النتروجين.
3. إعداد ظروف التسجيل باستخدام برنامج SX المؤيدة للبيانات.
4. تعيين الطول الموجي الإثارة مستوحد اللون إلى 352 نانومتر ، وفتحات لعرض الشق الإثارة إلى 1 / 1.
5. استخدام λ = 455 نانومتر عالية تمرير مرشح لتسجيل الانبعاثات.
6. استخدام "امسك ضغط" الإعداد ، والتي تمكن أداة للحفاظ على ضغط النيتروجين أثناء التسجيل ، وبالتالي يمنع التذبذبات الضغط (والتحف تسجيل) خلال الألف القليلة الأولى.
7. مجموعة "تيلي "إلى 1 ق و" النقاط "إلى 5000.
8. استخدام مربع تكرار وضبط عدد من تكرار ، وعادة ما نستخدم 9 و 13 ليكرر العازلة ويمتد فاكهه تقضي ، على التوالي.
9. يجب تعيين درجة حرارة مياه الاستحمام إلى 25 درجة مئوية ، وينبغي رصد درجة الحرارة في البرنامج SX.
10. تعيين حجم محرك إلى 120 ميكرولتر ، وهذا يعني أنه في كل مرة يتم تشغيل الأداة عينة ، فإنه يمزج 60 ميكرولتر من كل من المحاقن اثنين. مع هذا الإعداد فعالا ، وهو حجم 120 ميكرولتر يعطي الوقت ميتة ≈ 1،2 مللي.
11. ضبط الجهد العالي (كسب) على كشف مضان لإخراج النمل - الحويصلية ليكون حوالي 8. لمزيج تجريبي القياسية يجب أن يكون كسب 400-420 خامسا بعض الأدوية الفلورسنت ، بحيث يمكن أن تشبع إشارة مضان. في هذه الحالات ، ينبغي أن انخفضت أرباح / الجهد.
12. دائما تحميل العينة الفلورسنت في اليسار والمحاقن العازلة / فاكهه تقضي في المحقنة الحق. تأكد من دوامة شاملة في جميع العينات التي تحتوي على الليبوزومات قبل التحميل ، ويكون على علم بأن LUVs مع مرور الوقت سوف يستقر في المحقنة.

4. القيام بتجربة

1. بإعداد نموذج النمل محملة LUVs إما مذيب او المركب ، وتحميلها في مقياس التألق الطيفي مشفوعة إما نا المحايدة او فاكهه تقضي الثاليوم. (50 ملي TlNO ₊₃ أن 94 ملم نانو ₊₃ 10 ملم باتجاه HEPES الرقم الهيدروجيني 7،0).
2. استخدام 1.5 مل مخففة النمل - LUV الحل ، مع أو بدون غراميسيدين ، الذي أعد في اليوم السابق.
3. إضافة المجمع في التركيز المطلوب أو المذيب للضوابط. حفاظ على تركيز المذيب إلى أدنى حد ممكن وثابت عبر كافة العينات. فإن تركيزات تحتاج إلى تعديل مع أي مركب (غير معروف) جديدة لتحقيق المطلوب الاستجابة للجرعة النطاق. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 25 في الظلام درجة مئوية.
4. دوامة من LUV العينة وتحميل إلى المحقنة اليسار. تحميل نا العازلة أو الثاليوم فاكهه تقضي ، في حقنة الحق.
5. إزالة فقاعات الهواء بدقة من كلا عينات عن طريق دفع المحاقن ذهابا وإيابا.
6. تأكد من أن يتم تحميل كل من المحاقن بالتساوي قبل اغلاق الصمامات. وسوف تحميل غير متكافئة نتيجة الاختلاط في مرحلة ما قبل حلول قبل أن تصل إلى غرفة تسجيل.
7. بالنسبة للعينة الأولى ، سجل مضان مع نا العازلة ، كرر 4 مرات ، وضبط الجهد العالي (كسب) ، حسب الاقتضاء ، وكرر 5 مرات.
8. للعينات المتبقية ، يكرر 9 سجل مع نا العازلة.
9. استبدال نا العازلة مع فاكهه تقضي TL - 13 ، وسجل يكرر.
10. الشطف بالماء وتواصل مع عينة المقبل. والضوابط التي نستخدمها مع العينات : لا غراميسيدين مع والمذيبات ، وليس غراميسيدين مع تركيز مركب القصوى ، مع كل من غراميسيدين ومذيب.

5. تحليل البيانات

1. نقل النتائج إلى الحاسوب التحليل. قراءة جميع البيانات في MATLAB لتحليل. لكل عينة ، وقراءة في المخزن المؤقت للجميع ، ويكرر فاكهه تقضي ، باستثناء الأربعة الأولى في كل حالة ، كما تحتوي تلك التحف الاختلاط. على افتراض حجم محرك من 120 ميكرولتر يستغرق أقل من أربع لقطات واضحة تماما من الخليط السابق من أنابيب توقف التدفق.
2. يجب أن يكرر العازلة للعينات جميع تكون مشابهة جدا. إذا كان هناك تحول كبير في إشارة مضان ، الذي يعتمد على تركيز مركب ، ثم قد يكون المجمع نفسه الفلورسنت وأنه قد يكون من الضروري لأول طرح هذا إشارة إضافية مضان قبل تطبيع العينات.
3. انتقل يدويا من خلال وإزالة آثار "سيئة" ويكرر : يكرر تحتوي على مسامير أو الانحرافات من متعدد exponentiality بسبب الاختلاط التحف و / أو الفقاعات.
4. تطبيع يكرر فاكهه تقضي على متوسط ​​قيمة بدءا من يكرر العازلة عن كل عينة. الجمع بين متوسطات جميع العينات إلى واحد رسم بياني لالتصور.
5. وينبغي تسجيلها مع عدم وجود آثار غراميسيدين تكون جميعها متشابهة تقريبا ، وتظهر أي التبريد ومضان ، قد يكون هناك انخفاض بطيء في إشارة مضان بسبب بطء تسرب الثاليوم ⁺ من خلال طبقة ثنائية حويصلات 8. إذا كانت العينة مع أي غراميسيدين والتعديل لا يظهر تبريد كبيرة ، ثم تدهورت الحويصلات وينبغي ألا تستخدم كذلك. إذا كانت العينات مع عدم وجود غراميسيدين ولكن مع التعديل تظهر تبريد كبيرة ، ثم معدل يشوش على طبقة ثنائية الحويصلات إلى حد أنه يسمح للfluorophore أو فاكهه تقضي على عبور طبقة ثنائية.
6. إذا كان المركب يغير خصائص طبقة ثنائية المادة الدهنية ، كما لمست من خلال قنوات غراميسيدين ، سيتم تغيير دوام التألق واضح.
7. لكل عينة ، وامتدت الأسي يصلح مثلا ⁴⁾ إلى 200-100 مللي الأول من منحنى التبريد مضان تطبيع لليكرر الفرد ومعدل ⁴محسوبة على أساس 2 مللي ثانية. وتحسب المتوسطات والانحرافات المعيارية لعينة معينة من يكرر كل فرد.
8. أخيرا ، وتحديد التغير النسبي في معدل إخماد طريق تطبيع أقرب إلى نموذج التحكم في الوقت الذي لا غراميسيدين والتعديل.

6. ممثل النتائج

الشكل 1 : والضروريات للمقايسة إخماد المستندة إلى مضان للكشف عن تغيرات في خصائص طبقة ثنائية المادة الدهنية أعلى اليسار : والتكبير في حويصلة على دهن واحد مع النمل زائد ₃ NANO في الداخل ونانو ₃ زائد ₃ TlNO في الخارج. أعلى اليمين : إشارة مضان سجلت به (النموذج الأعلى إلى الأسفل) النمل حويصلات مليئة دون فاكهه تقضي ، مع فاكهه تقضي ، مع فاكهه تقضي وقبل مخدر مع غراميسيدين نانومتر 87 و 260 و 780. القاع : تمثيل تخطيطي للغرفة توقف تدفق الخلط.

الشكل 2 : لقطة شاشة من برنامج SX المؤيدة للبيانات توضح اللوحات المختلفة المشار إليها في وصف الإعداد التجريبية.

الشكل 3 : قرارات متعددة من تكرار الإشارة مضان من النمل محملة LUVs مع نا العازلة مستثناة دائما يكرر الأربعة الأولى ، كما أنها تحتوي على التحف الاختلاط. الأنبوب الذي يربط بين الحقن العينة إلى الخلية خلط لها حجم محدد ، وبالتالي سوف يكرر القليلة الأولى تعطينا قراءة ما كان سابقا في أنابيب : لتكرار 1 و 2 ، وبعض مزيج من الماء وعينة لتكرار 3 المياه ، في الغالب لتكرار نموذج 4 ، وعينة لمجرد تكرار المتبقية.

الشكل 4 : تم تكرار قرارات متعددة من الإشارة مضان من النمل محملة LUVs مع نا العازلة ومع TL - فاكهه تقضي إزالة الأربعة الأولى من كل من يكرر شروطه. بالإضافة إلى ذلك ، لقياسات TL - فاكهه تقضي ، كرر 8 يحتاج إلى إزالتها بسبب القطع الأثرية ، وفقاعات الهواء على الأرجح.

. الشكل 5 : تأثير كبخاخات (كاب) على مسار وقت التبريد النمل مضان (A) إشارة مضان تطبيع أكثر من 1 ثانية ، نقاط رمادية تدل النتائج من جميع يكرر (ن> 5 في حالة) ؛ خطوط حمراء للدلالة على متوسط ​​جميع يكرر. (ب) وأول 100 مللي ، نقاط رمادية تدل النتائج من تكرار واحد لكل حالة ، ويتم مد خطوط حمراء يناسب الأسي (2 -- 100 مللي ثانية) ليكرر تلك. الخط الأزرق يدل على مرقط 2 مللي العلامة ، في الوقت الذي يتم تحديد معدل التبريد. في كلا وألف باء التتبع يظهر أعلى النتائج في غياب الثاليوم ⁺ ؛ المقبلين اثار تظهر النتائج في غياب GA ، مع الثاليوم ± ⁺ كاب ، وآثار انخفاض four تظهر النتائج مع 260 نانومتر وGA ⁺ TL ، حيث الأرقام دلالة [كاب] في ميكرومتر. معدلات التبريد لرسملة ميكرومتر 0 ، 10 ، 30 و 90 ، على النحو الذي يحدده معدل امتدت من الأسي ، هي 36 ± 6 و 69 ± 6 و 8 و 85 ± 247 ± 27 (يعني ± SD ، ن> 8) ، على التوالي.

Discussion

لقد أثبتنا سريع مضان على أساس مقايسة لتحديد إمكانية تعديل طبقة ثنائية المخدرات وamphiphiles الصغيرة الأخرى. المركبات التي تعديل خصائص طبقة ثنائية من المحتمل أن يغير وظيفة البروتين الغشاء بطريقة غير مباشرة غير محددة ، قد يسهم في "خارج الهدف" آثار المخدرات. في مقايسة ي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTS	Invitrogen	A-350
gramicidin	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
Mini-Extruder kit	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
PD-10 Desalting column	Sigma-Aldrich	54805