Transnuclear الفئران مع الخصوصيات المحددة مسبقا ضد مستقبلات الخلايا T المقوسة الغوندية الحصول عليها عن طريق SCNT

Summary

نظهر هنا التي يمكن استخدامها عبر إعادة برمجة جينية نقل نواة الخلية الجسدية (SCNT) بوصفه أداة لتوليد نماذج الفأر مع محددة مسبقا مستقبلات الخلايا التائية (TCR) الخصوصيات. هذه الفئران transnuclear تعبر عن TCR المقابلة من موضع الذاتية الخاصة بهم تحت سيطرة المروج المحلية.

Abstract

اللمفاويات ، مثل خلايا T ، الخضوع الجينية V تأشب J (D) ، لتوليد مستقبلات مع خصوصية معينة ^1. المعدلة وراثيا عن الفئران ترتيبها مستضد محددة مستقبلات الخلايا التائية (TCR) تم أداة لا غنى عنها لدراسة تطور الخلايا T وظيفة. ومع ذلك ، عادة ما يتم عزل هذه TCRs من خلايا تي ذات الصلة بعد فترة طويلة الأجل ثقافة التالية غالبا تحفيز المستضد المتكررة ، التي لا مفر منها لتحديد الخلايا التائية مع تقارب عالية. التكامل الجينومية عشوائية من TCR α β وسلسلة والتعبير ، من غير الذاتية المروجين يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في مستوى التعبير وحركية.

إعادة برمجة جينية عبر نقل نواة الخلية الجسدية ويوفر أداة لتوليد الخلايا الجذعية الجنينية والفئران من أي خلية من الاهتمام. وبالتالي ، عندما يتم تطبيق SCNT لخلايا تي من التحديد المعروف ، يتم نقل هذه الجينية V (D) لإعادة ترتيب J الخلايا الجذعية الجنينية SCNT - (المجالس) والفئران المستمدة منها ، في حين يتم إعادة تعيين علامات جينية. لقد أظهرنا أنه يمكن استخدام خلايا T مع خصوصيات محددة مسبقا ضد التوكسوبلازما الغوندية لتوليد نماذج الماوس التي تعبر عن TCR مواضع محددة من الذاتية الخاصة بهم ، من دون التعديل الوراثي قدم تجريبيا. السهولة النسبية والسرعة التي يمكن الحصول على نماذج من هذا القبيل transnuclear يبشر بالخير لبناء نماذج الأمراض الأخرى.

Protocol

وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في Kirak وآخرون ، علم 328 (5975) ، 243-248 (2010) .

1. عزل خلايا للمتبرعين

قبل يمكن استخدام خلايا T معينة أو B والخلايا المانحة لتوليد نماذج الماوس transnuclear والفئران المصابة يجب أن يتم مع الممرض في المصالح أو تحصين مع مستضد المصالح. بما أننا قد استخدمت خلايا + CD8 محددة لالغوندية التوكسوبلازما ، فإن بروتوكول الجيل التالي وصف وعزل هذه الخلايا ، وتحتاج إلى أن تتكيف وفقا للمصلحة الشخصية.

1. يتم حقن الأكياس المشتقة من ماوس جناسة الدماغ (حوالي 40) داخل حيز peritoneally BL / 6 × BALB / ج F1 (B6CF1) الفئران ، والتي تمكن كلا من العزلة H - 2 ^(ب) و H - 2 ^د مقيدة CD8 + الخلايا التائية.
2. في ذروة الاستجابة المناعية ، والفأر المصاب الموت الرحيم ، والطحال معزولة ، ووضع في صحن يحتوي على 6 مل من خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العازلة.
3. باستخدام الجانبين متجمد تغطي شرائح اثنين ، هو الأرض بدقة الطحال والمحتضنة في المنطقة العازلة تحلل RBC لمدة 5 دقائق على RT.
4. إضافة 14 مل من برنامج تلفزيوني ، تصفية خلية تعليق من خلال مصفاة الخلية (40 أو 70 ميكرون) في أنبوب 50 مل الصقر وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300g.
5. resuspend على إزالة الخلايا طاف بيليه في برنامج تلفزيوني مل (1) ونقل في أنبوب 1.5 مل إيبندورف. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300g وإزالة طاف بعد ذلك.
6. Resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني في 50 خلية ميكرولتر ، إضافة الأضداد fluorescently المسمى لتحديد نوع الخلية من الفائدة (على سبيل المثال CD3 ، B220 ، CD8 ، وCD4) ، وfluorescently المسمى MHC - I tetramer (MHC - II tetramer لخلايا CD4 T) تحميل مع الببتيد الاهتمام إلى تعليق الخلية واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
7. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني ، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 300 غرام resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني مل 3 ، وتصفية خلية تعليق من خلال مصفاة الخلية (40 أو 70 ميكرون) في أنبوب.
8. أداء FACSorting من خلال وضع بوابات صارم (1B الشكل).

2. بنقل نواة خلية جسدية

هناك بروتوكولات قليلة لنقل نواة الخلية الجسدية. ووصف احد يجعل هنا استخدام البويضات القبض على الطورية - II وهناك حاجة الى تثبيط انقسام الانتصافي الثاني باستخدام مثبط حركة الخلايا باء لذلك الخلايا المانحة التي هي في مرحلة G0/G1.

1. إعداد البويضات
   1. يتم حقن الفئران الإناث BDF1 الخلفية داخل peritoneally 5IU مع الدورة الشهرية في الماوس 5:00 حتي 19:00.
   2. حوالي 47 ساعة في وقت لاحق ، يتم حقن كل فأر داخل peritoneally مع HCG 5IU.
   3. إعداد طبق الثقافة (KSOM - AA تحت قطرات الزيت) للبويضات في اليوم نفسه حقن HCG ووضعها في حاضنة 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO _2. أيضا ، إعداد الإبر اللازمة لSCNT (7μm لاستئصال و 4 5μm أو لنقل النووي لنواة الخلايا اللمفاوية) عن طريق تحميلها مع الزئبق.
   4. الموت ببطء الفئران وعزله عن ناقلة البيضات 13H بعد HCG (8:00 تقريبا). جمع ناقلة البيضات في 1-2 قطرات من HCZB.
   5. واحد تلو الآخر نقل ناقلة البيضات إلى انخفاض تحتوي M2 ث / هيالورونيداز. نك قناة البيض بعناية مع forcep ونقل البويضة ، قزع المعقدة في الانخفاض. بعد كل بويضة - قزع مجمعات تم عزلها ، وحضنت الطبق عند 37 درجة مئوية.
   6. بعد دقيقة 2-5 (الوقت بالضبط يعتمد على مجموعة من هيالورونيداز) جمع البويضات ، ويغسل في HCZB وطبق عليها في KSOM - AA قطرات.
2. قلع البويضات
   1. استخدام غطاء طبق بتري للإعداد لوحة SCNT. إعداد المجهر ، وعلى micromanipulator.
   2. غسل الإبرة قلع (7 ميكرون) في PVP قبل البدء مع قلع.
   3. لاستئصال ، وضع مجموعة من البويضات (10-30) في قطرة من HZCB مع مثبط حركة الخلايا B (5 ميكروغرام / مل). في حين تفرخ (مقدار 5 دقائق) على خط المتابعة البويضات أفقيا.
   4. تأخذ واحدة البويضة ووضعها أمام إبرة القابضة. الإصلاح البويضة إلى الإبرة من خلال تطبيق عقد فراغ. باستخدام إبرة قلع ، بدوره البويضة حتى كروموسوم المعقدة - المغزل (CSC ، غالبا ما تسمى "النواة") هي في موضع الساعة 3.
   5. به بيزو نبض اختراق زونا الشفافة بعناية دون الإضرار البويضة ، مكان افتتاح الإبرة المتاخمة للمغزل الطورية - II وتطبيق فراغ. ينبغي أن "نواة" التحرك ببطء في الإبرة ، والغشاء ينبغي عزل نفسه مرة واحدة يتم إزالته تماما.
   6. نقل البويضات منزوعة النواة مرة أخرى إلى قطرات KSOM - AA ، وغسلها عدة مرات. تكرار هخطوات التنوي مع مجموعة جديدة من البويضات. تستمر حتى يتم منزوعة النواة كل البيض أو حتى حول 11:00.
3. نقل النووي
   1. لنقل النووي ، وتبادل الإبرة قلع (7 ميكرون) بإبرة نقل النووي (4 أو 5 ميكرون) ، وأغسلها مع PVP.
   2. مكان الخلايا اهتمامك (مثل خلايا CD8 + T) إلى انخفاض مع PVP ، ومزيج جيد واحتضان مدة لا تقل عن 10 دقيقة.
   3. وضع مجموعة من البويضات منزوعة النواة (10-30) في قطرة من HCZB مع مثبط حركة الخلايا B (2.5 ميكروغرام / مل). في حين تفرخ (مقدار 5 دقائق) خط المتابعة البويضات أفقيا باستخدام إبرة نقل النووي.
   4. تلتقط خلية المانحة عن تعليق PVP خلية ونضح في وخارجها ، وحتى الغشاء الخارجي انهارت (شظايا من الغشاء والعصارة الخلوية وينبغي أن تكون مرئية). إذا لزم الأمر يمكن أن تطبق بيزو النبض. مرة واحدة وقد تم عزل نواة ، وتحريكه قليلا حتى في الإبرة ، والاستمرار في التقاط النوى حتى يكون لديك 10-30.
   5. الانتقال إلى قطرة تحتوي على البويضات محاذاة منزوعة النواة. إصلاح أحد البويضة إلى الإبرة من خلال تطبيق عقد فراغ. مكان الإبرة نقل النووي (نوى أن يكون بعيدا عن فتح) المتاخمة لزونا الشفافة وتطبيق بيزو النبض حتى الإبرة قد اجتاز الشفافة زونا. تحرك بحذر على نواة واحدة في رأس الإبرة ، ودفع الإبرة في البويضة حتى غيض من الإبرة 03/02 في الداخل. تطبيق الضغط السلبي الصغيرة ، بحيث قليلا من غشاء البويضة في الإبرة.
   6. والخطوة التالية هي حرجة للغاية ، لأن هذا هو الوقت فقط عندما البويضة هو في الواقع "فتح". تطبيق نبضة واحدة من بيزو ، ودفع نواة من الإبرة من خلال تطبيق الضغط الايجابي ، وسحب الإبرة مرة أخرى بعناية بحيث غيض حوالي 1 / 3 في البويضة ، ومن ثم تطبيق الضغط السلبي ومواصلة سحب الإبرة إلى ختم البويضة. كرر هذه الخطوة مع كل بويضة.
   7. بعد كل البويضات من مجموعة تلقت النواة ، يتم غسلها والمثقف في KSOM - AA وسائل الإعلام. كرر هذا الإجراء مع جميع البويضات.
   8. بعد آخر مجموعة تم الثقافات في KSOM - AA مدة لا تقل عن 30 دقيقة ، يتم نقل الأجنة إلى SCNT - قطرات من وسائل الاعلام التنشيط الكالسيوم الخالية تحتوي SrCl2.
   9. بعد 6 ساعات من التنشيط ، يتم تحديد مبلغ pronuclei الزائفة (PPN) إيجابية SCNT - الأجنة. ثم يتم غسل الأجنة والمثقف في KSOM - AA قطرات لعدة أيام إضافية حتى 3.5 وصلت إلى مرحلة الكيسة.
   10. الأدوية أو المواد الكيميائية في الاختيار (مثل Trichostatin A) يمكن أن تضاف إلى تفعيل الثقافة والإعلام.

3.Derivation من الخلايا الجذعية الجنينية

يمكن استخدام blastocysts SCNT إما إلى نقلها إلى شبه الإناث الحوامل (المعروف ايضا باسم الاستنساخ المباشر أو خطوة واحدة) أو لاستخلاص الخلايا الجذعية الجنينية (المعروف ايضا باسم الاستنساخ غير المباشرة خطوة أو اثنتين). نظرا لأنه أكثر كفاءة بكثير لتوليد خلايا ES ، نختار الإجراء على مرحلتين. في حال اهتمام العلماء في مجال الاستنساخ المباشر ، يمكن نقل مباشرة إلى blastocysts الزائفة الإناث الحوامل كما هو موضح في القسم 5.

هناك العديد من البروتوكولات التي تصف اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية. ووصف واحد هنا هو أسلوب قياسي ، والتي تستخدم الخلايا المغذية ، والجنين مصل في ربلة الساق.

1. في اليوم الثاني بعد نقل النووي ، وإعداد لوحة 96 - U - جيدا لاشتقاق خلايا ES.
2. إضافة 100 ميكرولتر الجيلاتين في كل بئر من لوحة 96 - U - جيدا ، واحتضان لمدة لا تقل عن 10 دقيقة ، وإزالته بعد ذلك.
3. يضاف الخلايا المغذية ذوبان الجليد وresuspend في حجم وفقا لمتوسط ​​أجل التنمية المستدامة ، ومعلق الخلايا المغذية مثل أي ما يعادل مساحة 25 سم ² في المتوسط ​​10 مل و 200 ESD ميكرولتر من التعليق في كل خلية من الجيلاتين جيدا في المعاملة.
4. وضع لوحة في حاضنة والثقافة في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO _2.
5. بعد 3.5 يوم ، وينبغي أن تكون الأجنة في مرحلة الكيسة.
6. إعداد طبق العقيمة البكتيرية التي طلي a ES بضع قطرات المتوسطة الخلية وthyrode الحمضية.
7. يتم نقلها أولا blastocysts من قطرات KSOM - AA في قطرات تحتوي الخلية العادية المتوسطة وفاق وغسلها مرتين.
8. نقل بعناية مجموعة من blastocysts (blastocysts 5-10) في قطرة واحدة من thyrode الحمضية وابقاء هناك حتى الشفافة زونا قد حلت.
9. ثم يتم نقل blastocysts إلى انخفاض المتوسط ​​مع وفاق ، وغسلها مرتين ، ثم وضعت في المغلفة التغذية 96 - U - جيدا لوحة (واحد إلى واحد الكيسة أيضا).
10. ثم يتم استزراع الأجنة لمدة 5-7 أيام في حاضنة في 37 ° C CO ، 5 ₂ ٪ من دون إزعاج لهم. وهذا يعطي الوقت لجنينttach إلى الطبقة المغذية ، وعلى شكل ثمرة.
11. إعداد جيد 24 لوحات ، بواسطة مغذيات الطلاء في وسط البيئة والتنمية المستدامة في كل جانب ، على سبيل المثال resuspend ما يعادل 50 وحدة التغذية ² سم في المتوسط ​​12 ملليلتر من أجل التنمية المستدامة ، وإضافة 500 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر.
12. إزالة بعناية وسيلة من أجل التنمية المستدامة لوحة 96 - U - جيدا مع الأجنة ، ويغسل جيدا مرتين مع كل 250 Hepes ميكرولتر (أو برنامج تلفزيوني) ، بإضافة 50 ميكرولتر التربسين واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
13. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات ، حتى ثمرة قد ينهار في تعليق وحيد الخلية ، ونقل إلى لوحة 24 وكذلك في احتضان 37 درجة مئوية ثاني ، و 5 ٪ _2.
14. إذا ESC الاشتقاق كانت ناجحة ، يجب أن تكون مرئية ESC المستعمرات بعد 7-10 أيام.

4.Blastocyst الحقن

حقن blastocysts هي تقنية روتينية لتوليد أي نوع من نموذج الفأر المعدل وراثيا. ومن المهم الإشارة إلى أن حقن blastocysts ونقل لاحقا إلى شبه الإناث الحوامل يجب أن يكون التوقيت جيدا.

1. إناث الفئران مع رئيس الدورة الشهرية وHCG كما هو موضح في القسم 2.1. بعد وضع حقن HCG إناث الفئران مع الفئران الذكور (امرأة واحدة واحدة الماوس الذكور في القفص).
2. في اليوم التالي ، والتحقق من الإناث المقابس. ويحسب هذا النحو 0.5dpc (الجماع أيام آخر).
3. ثم يتم عزل الأجنة المخصبة من قناة البيض كما هو موضح في القسم 2.1 ، والمثقف في KSOM - AA لمدة 3 أيام إضافية.
4. تحضير الخلايا ES يوم حقن الكيسة (3.5dpc).
5. إزالة الخلايا المتوسطة من وفاق ، ويغسل مرتين مع Hepes (أو PBS) ، إضافة التربسين واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
6. خلايا Resuspend trypsinized مع وفاق المتوسط ​​، لوحة في طبق ، واحتضان ل45-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ لتقليل كمية من الخلايا المغذية (الخلايا المغذية التقيد أسرع من خلايا ES).
7. تعليق نقل الخلية من خلال مصفاة الخلية (40 أو 70 ميكرون) في أنبوب ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000rpm.
8. إزالة ، resuspend طاف بيليه خلية في المتوسط ​​500 ES ميكرولتر وتخزينها على الجليد لحين الحاجة إليها.
9. إعداد طبق غطاء البكتيرية العقيمة التي تحتوي على قطرات الطلاء وHCZB PVP.
10. إعداد إبرة عن طريق تحميل 15 ميكرومتر مع الزئبق ، ووضعها في موقف وغسله مع PVP.
11. وضع مجموعة من blastocysts (10-30 blastocysts) إلى انخفاض مع HCZB وإضافة 5-50 خلية ES ميكرولتر تعليق (يعتمد على تركيز) إلى آخر قطرة من HCZB.
12. تلتقط خلايا ES (50-100 الخلايا) مع إبرة الحقن.
13. الانتقال إلى الانخفاض مع blastocysts. محاذاة blastocysts أفقيا ، وإصلاح واحد مع الإبرة من خلال تطبيق عقد فراغ.
14. استخدام إبرة الحقن تحويل الكيسة حتى كتلة الخلية الداخلية (ICM) هو في موضع الساعة 9.
15. مكان إبرة الحقن الخاص في 03:00 ، تأكد من أنه لا توجد الخلايا ES في رأس الإبرة ، وتطبيق بيزو النبض حتى إبرة الحقن يخترق الشفافة زونا والأديم الظاهر الغاذي في blastocoel.
16. الافراج عن الخلايا ES قليلة (5-15 خلايا) ، بحيث الخلايا ES التمسك ICM. تستمر حتى تم حقن جميع blastocysts فريق وفاق مع الخلايا.
17. بعد الانتهاء من مجموعة واحدة من blastocysts ، غسلها مرتين في KSOM - AA ، والاحتفاظ بها في الانخفاض مع KSOM - AA حتى يتم حقن كل blastocysts.

5. نقل الأجنة

نقل الأجنة في شبه الإناث الحوامل تمثل عملية جراحية ، والتي يجب أن يكون نفذت بعناية فائقة وفقا للمبادئ التوجيهية لمعهد الباحث.

1. تخدير الفئران المتلقية للإناث ، حلق الربع السفلي الأيمن ، وتطهيرها.
2. مقص باستخدام فتح الجلد ، وفصل البريتوني من الجلد.
3. تحديد المبيض من خلال الغشاء البريتوني (بقعة حمراء) ، وفتح البريتوني على مقربة من المبيض.
4. باستخدام الملقط ، والاستيلاء على قناة البيض بعناية وسحب الرحم.
5. التقط مجموعة من حوالي 10 blastocysts مع الشعرية متصلة ماصة الفم.
6. الإصلاح الرحم ملقط مع أحد ، لكمة صغيرة بأكملها في ذلك بابرة صغيرة ، وتضاف الشعرية مع blastocysts في تجويف الرحم.
7. الافراج بعناية الأجنة في الرحم ، وإزالة الشعيرات الدموية الخاصة بك.
8. دفع الرحم يعود الى تجويف البطن.
9. تحديد حواف الصفاق وإغلاقه مع غرز قليلة.
10. إغلاق جلد الفأر مع المواد الغذائية قليلة.
11. لآلام ما بعد الجراحة ، ويدير كاربروفين 5 ميكروغرام لكل ميلي غرام من وزن الجسم.

الشكل 1. الجسدية النووي للخليةنقل خلايا تي محددة مسبقا في B6CF1 الخلفية. الأرقام المطلقة والنسبية للأجنة ولدت من خلايا CD8 + T والخلايا الجذعية الجنينية المشتقة من blastocysts SCNT.

الشكل 2. الممثل تحليل تدفق cytometric من الفئران خيالية SCNT حقنوا خلايا جذعية جنينية. والبوابة رقم (في المائة في مجموع الخلايا التائية CD8 +) يدل على وجود خلايا محددة CD8 + T في الفئران خيالية.

Discussion

وقد أظهرت لنا هنا والتي يمكن استخدامها لتوليد فئران SCNT transnuclear من الخلايا التائية مع خصوصية محددة مسبقا. وإن لم يكن هو موضح هنا ، ينبغي أن تكون أيضا قابلة للاستخدام تقنية لتوليد الفئران من خلايا B transnuclear مع خصوصية محددة مسبقا.

شيء واحد مهم هو أن تنظر إلى السلالة والجنس من الماوس ، والذي هو مصاب أو تحصين وتستخدم لعزل الخلايا T أو B من الفائدة. منذ خلايا T و B لديها كفاءة منخفضة للغاية في برمجة عامة ، فإننا نوصي باستخدام الهجينة F1 من النمط الفرداني المطلوب. لأن الخلية المانحة ، كما يحدد الجنس ، ونحن نوصي باستخدام خلايا T أو B من الفئران الذكور. وهذا يعني أن الفئران الذكور فقط خيالية سيحيل TCR BCR أو من خلال germline ، مع الفئران الذكور يجري أسهل وأسرع لتكاثرها.

أخذت معا ، ونحن نعتقد أن إعادة برمجة جينية عبر SCNT يمثل أداة قوية لتوليد نوع جديد من نماذج الماوس ، والتي سوف تكون له ميزة كبيرة للحقل المناعية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Red Blood Cell lysis Buffer	Sigma-Aldrich	R7757
Cell strainer	BD Biosciences	REF 352340
Pregnant Mare Serum (PMS)	Calbiochem	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Calbiochem	230734
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272	Type IV-S
KSOM-AA	EMD Millipore	MR-106-D
HCZB	EMD Millipore	MR-173-D	Customized medium
Ca-free medium for activation	EMD Millipore	MR-174-D	Customized medium
SrCl2	Sigma-Aldrich	255521	100mM = 10x
AlbuMAX I	GIBCO, by Life Technologies	11020-021
PVP	MP Biomedicals	102787	Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	500μg/ml = 100x
Trichostatin A	Sigma-Aldrich	T8552	5mM = 1000x
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5310
Holding needle	Humagen	MPH-SM-30
Injection and transfer needles	Humagen	4-15, 7-15, 15-15
Mouth pipette	Sigma-Aldrich	A5177
Scissors	Fine Science Tools	14088-10	or something similar
Forceps	Fine Science Tools	11251-10	or something similar
Wound Clip Applicator	BD Biosciences	427630
Wound Clips	BD Biosciences	427630
Suture	Ethicon Inc.	K871H
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
FBS	Hyclone	SH30071.03	15%
Penicillin/Streptomycin	Lonza Inc.	17-602E	100x
Glutamin	MP Biomedicals	101806	200mM = 100x
Non-essential Aminoacids	GIBCO, by Life Technologies	11140050	100x
β-Mercapt–thanol	GIBCO, by Life Technologies	21985-023	5μl in 500ml
LIF	EMD Millipore	ESG1106	1000x
MEK inhibitor	Cell Signaling Technology	9900L	For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM)