Cryopreserving واسترداد خلايا الجذع من الإنسان الكامل باستخدام الضربة القاضية المصل الطاعم خالية استبدال متوسطة

Summary

هذا البروتوكول وصف الإجراء مفصلة لcryopreserving الإنسان الجذع خلايا في وسط ريال خروج المغلوب الحفظ بالتبريد واستعادة هذه الخلايا في كامل مجاني خروج المغلوب الطاعم ريال (KSR - FF) أو المتوسطة المغذية المستندة ريال خروج المغلوب المتوسط.

Abstract

وقد خلق هذا الاكتشاف في 2006 بأن من الممكن إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان والفأر على توليد خلايا الجذع ^1-3 بصفات متشابهة بشكل ملحوظ على الخلايا الجذعية الجنينية مصدرا قيما جديدة من الخلايا المحفزة لاكتشاف المخدرات ، والعلاج الخلوي ، والبحوث الأساسية.

وقد GIBCO سائل الإعلام والكواشف في طليعة أبحاث الخلايا الجذعية المحفزة لسنوات. خروج المغلوب DMEM تستكمل مع تبديل خروج المغلوب المصل هو وسائل الإعلام المفضلة لنمو الخلايا الجذعية الجنينية والثقافة الآن خلية الجذع ^3-9. ويمكن الآن هذا الذهب معيار نظام وسائل الاعلام أن تستخدم لتغذية ثقافة حرة مع إضافة ريال خروج المغلوب عامل النمو كوكتيل.

ES الإنسان التقليدية وأساليب زراعة الخلايا المحفزة تتطلب استخدام الفأرة أو تغذية طبقات الخلايا الليفية الإنسان ، أو تغذية مكيفة المتوسط. هذه الأساليب هي ثقافة كثيفة العمالة ، من الصعب على نطاق وأنه من الصعب الحفاظ على الوركين خلايا غير متمايزة نظرا للظروف غير معروف. وقد وضعت Invitrogen خروج المغلوب عامل نمو كوكتيل ريال من أجل السماح لك الانتقال بسهولة الوركين والثقافات الخلية المغذية لHES خالية مع الحفاظ على استخدامك للريال خروج المغلوب.

Protocol

ملاحظة : للحفاظ على ثقافة ظروف معقمة ، وتتم كافة الإجراءات في هذا البروتوكول على استخدام الممارسات المختبرية التي أجريت معقمة وتحت غطاء تدفق الصفحي.

قبل البدء ، تأكد من أن أية وسيلة إعلامية غير المتوازنة إلى 37 درجة مئوية ، وبالغاز بشكل مناسب.

إعداد أطباق الثقافة Geltrex المغلفة

ملاحظة : انظر الملحق لاستخدام الأطباق CELLstart الثقافة المغلفة.

1. ذوبان الجليد أنبوب واحد من Geltrex (1 مل) ببطء في 2-8 درجة مئوية ، وتمييع 1:100 في 99 مل من خروج المغلوب D-MEM/F-12. مزيج الحل بلطف.
   
   ملاحظة : بعض خطوط الخلايا المحفزة قد يتطلب التخفيف Geltrex مختلفة لتحقيق النمو الأمثل. انظر التذييل لالتخفيفات البديلة.
2. تغطي السطح كله من كل صحن الثقافة مع الحل Geltrex (1 مل عن طبق 35 ملم ، 1.5 مل عن طبق من عيار 60 ملم).
3. ختم كل طبق مع Parafilm لمنع جفاف واحتضان الأطباق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   
   ملاحظة : عند هذه النقطة قد تكون لتخزين الأطباق الثقافة Geltrex المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. ختم كل طبق مع Parafilm لمنع Geltrex من الجفاف.
4. قبل استخدام ونقل الأطباق Geltrex المغلفة إلى غطاء تدفق الصفحي ، والسماح لهم لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 1 ساعة).

إعداد وحدة تغذية متكاملة خالية من ريال خروج المغلوب متوسطة

1. لإعداد 1 مل من 10 ميكروغرام / مل حل جمعية جيل المستقبل الأساسية ، مزيج جو معقم و مطهر المكونات المذكورة أدناه. قسامة الحل وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
   

   جمعية جيل المستقبل الأساسية	10 ميكروغرام
   D - PBS	990μL
   جيش صرب البوسنة 10 ٪	10 ميكرولتر

   
   ملاحظة : يمكن أن تكون بديلا BSA HSA مع ريال أو خروج المغلوب في نفس التركيز.
2. للتحضير 50 ​​مل من 2 الحل Dispase ملغ / مل ، مزيج جو معقم و مطهر المكونات المذكورة أدناه. فلتر تعقيم وتخزين الحل في 4 درجات مئوية لتصل الى 2 أسابيع.

   Dispase	100 ملغ
   D - PBS	50 مل

3. لتحضير 100 مل ريال خروج المغلوب كاملة خالية من الطاعم (KSR - FF) الجمع بين جو معقم و مطهر المكونات المذكورة في الجدول أدناه.
   

   مكون	الأسهم تركيز	التركيز النهائي	حجم
   خروج المغلوب DMEM/F12 (الفئة رقم 12660-012)	--	1X	76.8 مل
   GlutaMAX - I (الفئة رقم 35050-061)	200 ملي	2 ملم	1 مل
   خروج المغلوب ريال (لا Cat.. 10828-028)	--	20 ٪	20 مل
   خروج المغلوب SR - GFC (الفئة رقم A10580 - 01)	50X	1X	2 مل
   bFGF (الفئة رقم PHG0024).	10 ميكروغرام / مل	20 نانوغرام / مل	200 ميكرولتر

   
   قد قمت بتخزين المتوسطة KSR - FF في درجة مئوية لمدة تصل إلى 2-8 أسبوع واحد.
4. قبل لحظات ما قبل equilibrating المتوسط ​​كاملة لدرجة الحرارة والغازات ، إضافة جو معقم و مطهر حجم المطلوب من 2 المركابتويثانول (55 ملي تركيز الأسهم) لتركيز نهائي 0.1 ملم. على سبيل المثال ، لتحضير 100 مل من KSR - FF المتوسطة إضافة ميكرولتر 182 من 55 مم 2 المركابتويثانول (1:550 تمييع) بدلا من ذلك ، قد تضاف 2 المركابتويثانول لإكمال المتوسطة 1X وتخزينها في درجة مئوية لمدة تصل إلى 2-8 أسبوع واحد.

إعداد التجميد / الحفظ بالتبريد متوسطة

وسيلة الحفظ بالتبريد يتكون من اثنين من وسائط الإعلام ؛ متوسطة تجميد وتجمد باء متوسطة وأضافوا إلى الخلايا في أوقات مختلفة ، ويجب أن تبقى منفصلة. هم كل حاجة 50 ٪ من إجمالي حجم متوسط ​​الحفظ بالتبريد. إجمالي حجم متوسط ​​الحفظ بالتبريد المطلوب هو 1 مل لكل فيال أن تكون مجمدة. ويمكن استخدام 90 ٪ من صحن 60mm متموجة hESC لقوارير (2) مصرف hESC في وسائل الحفظ بالتبريد.

إعداد حجم ما يكفي من كل متوسطة التجميد مع 5mL - 2 إضافية لضمان الفائض.

تجميد متوسطة (50 ٪ من الحجم النهائي) :	50 ٪ DMEM/F12	50 ٪ KSR
تجميد باء متوسطة (50 ٪ من الحجم النهائي) :	80 ٪ DMEM/F12	20 ٪ DMSO

على سبيل المثال :

إذا كنت تجميد 20 قارورة من الخلايا ، وسوف تحتاج 20mL متوسطة من الحفظ بالتبريد. إضافة 4mL عن الفائض عن ما مجموعه متوسطة 24mL الحفظ بالتبريد. هذا يعني أنك سوف تحتاج 12mL من تجميد متوسطة (50 ٪ من 24mL) و12mL باء متوسطة التجميد (50 ٪ من 24mL)

تجميد متوسطة (12 مل) :	6 مل DMEM/F12	6 مل KSR
تجميد باء متوسطة (12 مل) :	9.6 مل DMEM/F12	2.4 مل DMSO

التشكيل النهائي للمتوسطة الحفظ بالتبريد هو 65 ٪ DMEM/F12 ، KSR 25 ٪ ، وDMSO 10 ٪.

Cryopreserving iPSCs

1. قبل الدافئة حجم المطلوب من Dispase في حمام ماء C ° 37. الرجوع الى الجدول 1 أدناه للاطلاع على تفاصيل وحدات التخزين المطلوبة.
2. قبل يوازن حجم المطلوب من KSR - FF في 37 دقيقة for15 ° C حمام الماء. الرجوع إلى الجدول 1below للحصول على تفاصيل بشأن الكميات المطلوبة.
3. نضح المتوسط ​​أمضى من السفينة الثقافة باستخدام ماصة ، وشطف الخلايا مرتين مع مد برنامج تلفزيوني.
4. إضافة بلطف قبل تحسنت Dispase حل للسفينة الثقافة (على سبيل المثال ، 1 مل من محلول Dispase في صحن الثقافة من عيار 60 ملم). دوامة السفينة الثقافة معطف سطح الخلية بأكملها.
5. احتضان سفينة الثقافة على 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
6. إزالة السفينة من الحاضنة ، نضح الحل Dispase ، ويغسل بلطف الخلايا مع مد برنامج تلفزيوني.
7. كشط بلطف خلايا قبالة سطح الطبق الثقافة باستخدام مكشطة الخلية ، ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15mL العقيمة.
8. شطف الأطباق الثقافة مرتين مع KSR - FF ، بلطف "رش قبالة" أي الخلايا التي لم منفصلة. تجمع شطف المتوسطة مع الخلايا في الأنبوب 15mL.
9. أنبوب الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لخلايا بيليه.
10. نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية وتخلص منه.
11. يعد وجود كمية كافية من cryovials. مرة واحدة الخلايا على اتصال مع DMSO ، ينبغي aliquoted أنهم والمجمدة خلال 2-3 دقائق.
12. نفض الغبار بلطف الأنبوب ، لإزاحة الكامل لبيليه الخلية من أسفل الأنبوب واعادة تعليق الخلايا في ألف متوسطة التجميد [من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا باستخدام 5 مل ماصة المصلية]. بعد تعليق موحد للكتل ، إضافة حجم مساو باء متوسطة تجميد إليها ، بطريقة حكيمة انخفاض ، في حين يحوم بلطف تعليق الخلية إلى المزيج.
    
    ملاحظة : عند هذه النقطة ، والخلايا على اتصال مع DMSO ، ويجب أن يتم تنفيذ العمل بكفاءة. مرة واحدة الخلايا على اتصال مع DMSO ، ينبغي aliquoted أنهم والمجمدة خلال 2-3 دقائق.
13. قسامة 1 مل من تعليق في كل خلية cryovial.
14. المكان بسرعة قارورة في متجمد السيد [لتجميد بسرعة] وتحويلها إلى -80 درجة مئوية خلال الليل.
15. بعد المبيت في تخزين -80 درجة مئوية ، ونقل الخلايا إلى خزان النتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.

iPSC أذاب فيال والانتعاش الخلية

ملاحظة : يمكن استبدال KSR - FF المتوسطة مع MEF مكيفة KSR المحتوية على ، أو متوسطة KSR للاستخدام مع مغذيات. انظر الملحق للحصول على إرشادات لإعداد وسائل الإعلام.

قبل الدافئة 10ML من KSR - FF المتوسطة في أنبوب 50 مل.

1. يوازن كمية مناسبة من Geltrex المغلفة أطباق لدرجة حرارة الغرفة ونضح أي السائل من الأطباق قبل الطلاء لكخلايا ص.
2. إزالة بعناية hESC (أو iPSC) قنينة من النيتروجين السائل خزان.
3. ذوبان الجليد بسرعة قارورة من الخلايا المجمدة في حمام المياه 37 درجة مئوية ، حتى مجرد قطعة صغيرة مجمدة لا يزال في القارورة.
4. قنينة رذاذ مع 70 ٪ لتطهير الأيزوبروبانول عليها وتحويلها إلى غطاء محرك السيارة الأنسجة الثقافة العقيمة.
5. نقل جو معقم و مطهر محتويات القارورة في أنبوب 15 مل المخروطية باستخدام ماصة 5 مل.
6. شطف فيال مع 1 مل من KSR - FF وإضافة إلى هذا الأنبوب 15 مل الطرد المركزي.
7. ببطء ، إضافة 4 مل من KSR - FF على الخلايا المخروطية في الأنبوب 15mL قطرة من الحكمة. في حين اضاف المتوسط ​​، حرك بلطف أنبوب ذهابا وإيابا لمزج الخلايا. (وهذا يقلل من صدمة التناضحي إلى الخلايا).
8. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل مع تعليق خلية في 1000rpm (200 × ز) لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
9. نضح بعناية وتجاهل طاف دون الإخلال بيليه الخلية.
10. اعادة تعليق الخلية بيليه في مرحلة ما قبل حرارة KSR - FF (مثل الطبق 4mL/60 مم) باستخدام ماصة 5 مل ماصة والخلايا برفق صعودا ونزولا حتى فرقت تماما الخلية بيليه. ومن المتوقع أن بقاء أكبر من 70 ٪ ، ولكن إذا كان بقاء أقل من 70 ٪ ، قد يستغرق وقتا أطول للخلايا للوصول إلى نقطة التقاء.
11. باستخدام ماصة نفسه ، نقل الخلية إلى تعليق الطبق الثقافة Geltrex المغلفة قبل معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة قطرة من الحكمة.
12. مكان الطبق الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية ، مع ترطيب الجو من ثاني أكسيد الكربون ٪ ₀₄ حتي 06 فبراير في الهواء. سفينة بعناية في دوامة من الشمال إلى الجنوب ، من الشرق إلى الغرب إلى نمط توزيع بالتساوي الخلايا.
13. بلطف السوائل تغيير ثقافة طبق لمدة 24 ساعة بعد ذوبان الجليد ، وبعد ذلك يوميا لإزالة الأنقاض والخلية لتوفير المواد الغذائية الطازجة حتى طبق ما يقرب من 70-80 ٪ متموجة. للثقافة واصلت الركض من خلايا الجذع لديك ، لدينا تشير إلى بروتوكول بعنوان "تغذية خالية من الثقافة والركض من خلايا الجذع الإنسان الكامل باستخدام الضربة القاضية تبديل المصل الطاعم خالية المتوسطة"

النتائج المتوقعة

وينبغي أن تكون الخلايا تقريبا 70-80 ٪ متموجة قبل الحفظ بالتبريد. Dispase النتائج الهضم في الشباك حتى وقابلة للطي من المستعمرات على طول هوامش مستعمرة. بعد حصاد الخلايا المجمدة على أنها كتل صغيرة في وسائل الحفظ بالتبريد. بمجرد إذابة القارورة ، وخلايا استرداد ونعلق على طبق قبل المغلفة وكتل صغيرة. أنها تنمو بسرعة مما يؤدي إلى صحن متكدسة في 5-6 أيام.

الجدول 1 -- وحدات التخزين الموصى بها

مكون	35mm الطبق	60mm الطبق	100mm صحن
استكمال خروج المغلوب ريال المتوسطة	2 مل	4 مل	10 مل
Geltrex الحل	1 مل	1.5 مل	4-5 مليلتر
Dispase	0.5 مل	1 مل	3-4 مليلتر
D - PBS للشطف	2 مل	4 مل	10 مل

الرجاء انقر هنا للاطلاع على التذييل .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)
KnockOut Serum Replacement		10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		21985-023
Dispase		17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		14190-144
DMSO, 500mL	JT Baker	JT9224-1
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60 mm Tissue Culture treated dishes
Liquid nitrogen storage tank
Isopropanol freezing containers
1.5 mL Cryovials