اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

Summary

كما برز الزرد قوية في الجسم الحي منصة لشاشات المخدرات النمط الظاهري القائم على التحليل الكيميائي والجيني. هنا ، علينا أن نظهر بسيطة ، طريقة عملية واسعة النطاق لفحص الجزيئات الصغيرة باستخدام الأجنة الزرد.

Abstract

نظرا لحجمها الصغير الجنين ، التطور السريع ، والشفافية ، والخصوبة ، والعديد من أوجه الشبه الجزيئي ، المورفولوجية والفسيولوجية للثدييات ، برز الزرد وقوية

Protocol

1) جمع بيض اسماك الزرد

1. بعد ظهر يوم قبل يوم من الشاشة الكيميائية ، وإعداد 10-20 الدبابات تربية الزرد. ملء كل صهريج ماء من نظام تربية الأحياء المائية. باستخدام صافي الأسماك ، نقل أحد الذكور والإناث البالغين الكبار 1-2 إلى حاوية الداخلية في كل خزان التربية. فصل الأسماك الذكور والإناث من بعضهم البعض مع المفرق. تسمية الأقفاص ووضع غطاء عليها.
2. في صباح يوم من الشاشة ، إزالة فواصل من الدبابات والسماح للتربية الزرد لزميله. على مدى ساعة 1 التالي ، والسماح لسقوط البويضات المخصبة من خلال الشبكة في الجزء السفلي من كل حاوية الداخلية.
3. بعد 1 ساعة ، والعودة مرة أخرى إلى الزرد الكبار صهاريج التخزين الدائمة ، وإزالة الحاوية الداخلية وجمع البيض بنسبة توتير المياه في كل خزان تربية من خلال مصفاة الشاي البلاستيكية.
4. عكس المصفاة على طبق بتري وشطف مصفاة برفق لطرد البيض في صحن بيتري باستخدام زجاجة تحتوي على غسل المتوسطة E3.
5. يجب إزالة كل بويضة غير مخصبة ، والتي تظهر مبهمة ، وذلك باستخدام الماصة البلاستيكية. ينبغي لكل عبر التزاوج العائد حوالي 200 الأجنة.

2) Arraying الأجنة في 96 - جيدا لوحات

1. نقل الأجنة حوالي 5 في المتوسط ​​في كل بئر E3 من لوحة 96 - جيدا باستخدام ماصة باستير الزجاج.
2. بمجرد المحتشدة الأجنة على طبق 96 - جيدا ، وإزالة أكبر قدر من المتوسط ​​E3 النحو المبين ممكن من الآبار باستخدام 12 قناة (3-30 ميكرولتر) ماصة ، مع الحرص على عدم ثقب الجنين. باستخدام ماصة 12 قناة ، وتقديم 250 ميكرولتر المتوسطة E3 تحتوي على الكاناميسين 0.5μg/ml إلى كل بئر في أسرع وقت ممكن حتى لا تسمح للأجنة لتجف.
3. وضع لوحات 96 - جيدا داخل الحاضنة 28.5 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة المرجوة عندما تضاف هذه المركبات.

3) نقل المكتبة جزيء صغير

بينما يمكن نقل مجمع الآلي مع وسائل نقل الروبوتية ، سنقوم بشرح طريقة نقل يدوي.

1. عادة ما يتم توفيره من المكتبات جزيء صغير في شكل 96 - جيدا ، مع كل مجمع المخزنة في DMSO باعتباره المخزون 10 مم. حوالي 60 دقيقة قبل ان يصل الى مرحلة الأجنة عندما المركبات هي التي يمكن ان تضاف ، أذاب العدد المرغوب فيه من جانب 96 لوحات تحتوي على aliquots من جزيئات صغيرة (لوحة المصدر). يحيط علما رقم هوية المسلسل أو غيرها من لوحات المصدر. لتقليل التكثيف على لوحات ، ويمكن أن يحدث الذوبان في غرفة تحتوي على تجفيف Drierite (WA هاموند DRIERITE CO ، زينيا ، OH).
2. تدور باستمرار لفترة وجيزة في جهاز للطرد المركزي لوحات الطاولة مجهزة محول لوحة متعددة أيضا.
3. إزالة الشريط من لوحة الالومنيوم ختم المصدر. باستخدام ماصة 12 قناة ، ويخفف من المركبات الموجودة في لوحة مصدر للتركيز 0.5 ملم (على سبيل المثال ، إذا بدءا aliquots NL 250 من الاسهم 10MM ، إضافة 4.75 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر).
4. عند الأجنة في لوحة 96 - جيدا (لوحة المتلقي) يصل الى مرحلة المطلوبة ، استخدم لمدة 12 قناة (2-20 ميكرولتر) ماصة لنقل المركبات 2.5μL (0.5mM) من لوحات لوحات المصدر إلى المتلقي تحتوي على الأجنة.
5. تسجيل عدد من لوحات تحديد المصدر على لوحات الجنين المتلقية. تغطي لوحات تحتوي على المتلقي الآن الأجنة والمركبات مع الأغطية ، ومزيج بلطف بواسطة لوحات يحوم بلطف ، ووضعها في الحاضنة 28.5 درجة مئوية.
6. تغطي كل لوحة تحتوي على جزيئات صغيرة مصدر غير المستخدمة (0.5 ملم) مع الالومنيوم ختم الشريط ومكان في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل للتخزين.

4) الكشف عن تأثيرات الجزيئات الصغيرة عن طريق التفتيش البصري من الظواهر

1. قبل تنفيذ الشاشة ، ووضع معيار محدد لما من شأنه أن يشكل "ضرب".
2. في بعض الأحيان في عملية التنمية المنشودة ، وإزالة لوحات تحتوي على 96 - جيدا مجمع المعالجة أجنة من الحاضنة ودراسة كل جانب تحت stereomicroscope. لأفضل تصور التغييرات الطفيفة ، مثل التغيرات في نمط الدورة الدموية ، ويمكن استخدام المجهر المرحلة على النقيض المقلوب. يمكن أن تستخدم لفحص المجهري الفلورسنت اضطراب التعبير GFP أو البروتينات DsRed المروج تحت الأنسجة محددة.
3. مسح سريع لوحات 96 - جيدا لأي جيدا في ما لا يقل عن 3 من أصل 5 أجنة يحمل المقررة "ضرب" النمط الظاهري. سجل هوية لوحة ومكان جيد للضرب كل المحتملة.
4. تأكيد ضربة محتملة من إعادة اختبار آثار المجمع في عدة جرعات (1 أم أم 5 ، 10 ميكرومتر وميكرومتر 50). لكل جرعة ، يتم اختبار الأجنة في 10 مل من 0.5 E3 وسائل الاعلام في شكل صفيحة ال 48 أيضا. وينبغي أن توقيت بالإضافة لمجمع إعادة الاختبار تكون مماثلة لفحص الأصلي. وأكد هو ضرب عندما يرد على النمط الظاهري أثارت إعادة الاختبار للcompounد
5. التعرف على مجمع ضرب من قاعدة البيانات من جزيئات صغيرة في المكتبة الكيميائية.

Discussion

عند التخطيط لشاشة الكيميائية الزرد مقرها ، يجب إيلاء اهتمام خاص لمتانة النمط الظاهري قيد النظر ، ومعدل خلفية النمط الظاهري من هذا القبيل. وهذا أمر مهم لا سيما بالنسبة للشاشات المكثفات الكيميائية من النمط الظاهري المستحث. على سبيل المثال ، عن النمط الظاهري التي تسببه...

Materials