النظائر مستقرة من التنميط التمويه الاستقلابية المتوسطة في مرحلة تطوير والكبار انواع معينة ايليجانس</em

Summary

يوصف التنميط النظائر مستقرة التحليل اللوني للغاز الكتلة الطيفي لتدفق الاستقلابية المتوسطة في الديدان الخيطية انواع معينة ايليجانس. وترد تفاصيل أساليب تقييم تخصيب النظائر في ثاني أكسيد الكربون والأحماض العضوية ، والأحماض الأمينية بعد التعرض النظير إما أثناء تطوير أغار على لوحات أو أثناء مرحلة البلوغ في الثقافة السائل.

Abstract

وقد سمحت التنميط النظائر مستقرة طويلة التحقيقات الحساسة من عواقب الطفرات الوراثية الاستقلابية و / أو علاجات دوائية في النماذج الخلوية والثدييات. هنا ، نحن تصف الأساليب التفصيلية لأداء التنميط النظائر المستقرة لعملية التمثيل الغذائي وتدفق وسيط الأيض في الخيطية ، ايليجانس انواع معينة. يتم وصف أساليب التنميط دودة كاملة مجانا الأحماض الأمينية ، وصفت ثاني أكسيد الكربون ، الأحماض العضوية المسمى ، والأحماض الأمينية المسمى في الحيوانات المعرضة لنظائر مستقرة سواء من التنمية في وقت مبكر على لوحات نمو الديدان الخيطية آغار وسائل الإعلام أو بداية وصغار البالغين في حين تتعرض لعلاجات دوائية مختلفة في الثقافة السائل. كميا والأحماض الأمينية الحرة بحلول عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) في aliquots دودة كاملة في استخراج حمض البيركلوريك 4 ٪. المسمى C - ¹³ عالميا الجلوكوز أو 1،6 -- ¹³ C - ₂ يستخدم الجلوكوز والسلائف والنظائر المستقرة التي تسمى الكربون التي تتبعها مطياف الكتلة في ثاني أكسيد الكربون (سواء في الغلاف الجوي والمنحلة) وكذلك في الأيضات يدل على تدفق من خلال تحلل ، والتمثيل الغذائي بيروفات ، ودورة حمض الكربوكسيليك. وشملت النتائج ممثل لإظهار آثار التعرض الوقت النظير ، ومختلف بروتوكولات تبادل المعلومات البكتيرية ، والطرق البديلة لانقطاع في الدودة الخيطية من النوع البري ، فضلا عن مدى قريب التأسيس النظائر في الميتوكوندريا معقدة الديدان الطافرة الثالث (ISP - 1 (qm150) ) نسبة إلى البرية من نوع الديدان. تطبيق التنميط النظائر مستقرة في الديدان الخيطية المعيشة يوفر قدرة الرواية على التحقيق على مستوى كل الحيوانات تعديلات الأيض في الوقت الحقيقي التي هي سبب الاضطرابات الجينية الفردية و / أو علاجات دوائية.

Protocol

البروتوكول : التنميط النظائر المستقرة من خلال وسيط الأيض C. ايليجانس التنمية على لوحات NGM.

* ملاحظة : يمكن تخصيب النظائر المستقرة يقاس بنجاح في الشباب من السكان البالغين الخيطية عقب التعرض النظائر (إما مع عالميا المسمى الجلوكوز C ¹³ أو 1،6 -- ¹³ C - ₂ الجلوكوز) بداية إما في مجال التنمية أو في أوائل مرحلة البلوغ المبكر. هذا البروتوكول يسهل رصد المتزامنة للصحة الحيوانية ، والتنمية ، والنمو على مستوى لوحات نمو الديدان الخيطية (NGM) وسائط الإعلام ، وهو ما لا يتحقق بسهولة كما في الثقافة السائل.

1. إعداد أطباق بتري 100 ملم مع 10 مل من وسائط النمو الخيطية (NGM) ، في أسلوب القياسية. ¹
2. لوحات NGM مع انتشار E. OP50 القولونية ⁽¹⁾ والسماح ليجف بين عشية وضحاها.
3. إضافة 500 ميكرولتر من 200 ملي 1،6 -- ¹³ م ₂ الجلوكوز (لتحقيق تركيز النهائي من 10 ملي على لوحة NGM) بشكل موحد على طبق من ذهب. السماح ليجف بين عشية وضحاها.
4. التبييض حامل الديدان البالغة ^1. استعادت لوحة البيض على لوحات NGM دون البكتيريا أو 1،6 -- ¹³ م ₂ الجلوكوز. احتضان عند 20 درجة مئوية خلال الليل.
5. في اليوم التالي ، نقل مظلل ، L1 اعتقال اليرقات على لوحات NGM سابقا مع انتشار 1،6 -- ¹³ ₂ - C و E. الجلوكوز OP50 القولونية (لكل خطوة # 2 أعلاه). تنمو الديدان إلى مرحلة الشباب البالغين (48-72 ساعة ، اعتمادا على سلالة) ، والديدان مع الرعاية لا يتضورون جوعا.
6. جمع متزامن ، في اليوم الأول من الديدان البالغة الشباب مع لوحات مل 3-4 بصل س.
7. غسل الديدان في 50 مل من بصل S. في 50 مل من أنابيب فالكون. السماح لتكوير الديدان عن طريق الجاذبية لمدة 5 دقائق. طاف لإزالة 5 مل ~. تكرار غسل كميات أكبر من مرتين.
8. ويقدر عدد الدودة عن طريق العد three 100 aliquots ميكرولتر ^2. ضبط تركيز الدودة إلى 1000 الديدان / مل من القاعدية س.
9. ماصة 1 مل (1000 الديدان) في أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي من البلاستيك.
10. إضافة 69 ميكرولتر من 60 ٪ تحتوي على PCA الداخلية القياسية (ε أمينوكابرويك حامض) إلى التركيز النهائي للPCA 4 ٪ و 200 μmol القياسية الداخلية.
11. اسمحوا الديدان تسوية دقيقة بواسطة الجاذبية 5 ×. إزالة وحفظ طاف في أنبوب آخر.
12. طحن عينات الدودة باستخدام البلاستيك الخالط (المدقة Kontes بيليه) وحفر مزودة بمحركات (Kontes موتور المدقة بيليه لاسلكية) لمدة 15 ثانية. تأكيد اختلال البصر دودة بواسطة المجهر الضوئي. كرر إذا لزم الأمر.
13. نقل طاف من الخطوة رقم 11 لتتحد مع جناسة من الخطوة رقم 12.
14. أجهزة الطرد المركزي في 2250 دورة في الدقيقة العينة (1300 x ج) لمدة 5 دقائق.
15. طاف لنقل الطازجة 7 مل أنبوب زجاجي. حفظ بيليه لفحص تركيز البروتين ، على النحو المفصل في الخطوة رقم 20 ، وأدناه.
16. عينات تتراوح درجة الحموضة (حيادية) 7-8 باستخدام 4N KOH.
17. الطرد المركزي عينات تحييدها في 7 مل أنبوب زجاجي في 2250 دورة في الدقيقة (1300 x ج) لمدة 5 دقائق لإزالة الأملاح.
18. طاف لنقل الطازجة 7 مل أنبوب زجاجي.
19. تحضير العينات لتحييد المستقلب الكميات من قبل :
    1. عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) : فصل 50 ميكرولتر من العينة تحييدها عن طريق الحقن المباشر في هبلك. يتم تنفيذ مجانا الكميات من الأحماض الأمينية التي HPLC (فاريان) باستخدام العمود قبل derivatization مع الكشف س phthalaldehyde ونيون ، كما هو موضح سابقا ^3-4.
    2. اللوني للغاز / قياس الطيف الكتلي (GC / MS) : تفضلي مع استخراج عينات المتبقية تحييد باستخدام راتنج التبادل الأيوني (بيو راد) لGC / MS تقرير لتخصيب النظائر في الأحماض الأمينية والأحماض العضوية ، وعلى النحو المفصل في بروتوكول D.
20. إضافة 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم 1N لتكوير البروتين المتبقية (من الخطوة رقم 15) في 7 مل أنبوب زجاجي.
21. احتضان هيدروكسيد الصوديوم معاملة عينة البروتين في درجة حرارة الغرفة في حين تناوب (Labnet الدوار LabRoller *) بين عشية وضحاها حتى المنحل.
22. استخدام 75-100 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم المعاملة البروتين لتحديد تركيز البروتين بالطرق العادية (DC الفحص البروتين ، بيو راد).

بروتوكول باء التنميط النظائر المستقرة في استقلاب الوسيط في C. ايليجانس البالغين الشباب في الثقافة السائل.

* ملاحظة : يمكن دراسة الآثار العلاجية على تدفق الاستقلابية المتوسطة في الديدان الخيطية الكبار التالية النظائر بداية التعرض في اليوم الأول من البيض سواء على لوحات NGM (انظر البروتوكول ألف ، أعلاه) ، أو في الثقافة السائل. نحن نفضل النهج الأخير إلى تحقيق أقصى قدر من الفعالية من حيث التكلفة من النظائر مستقرة والدوائية استخدام عامل.

1. تمييع متزامن ، أول يوم وضع البيض البالغين الشباب في S. القاعدية التي تحتوي على الكوليسترول 0.0005 ٪ (التي تم الحصول عليها عن طريق إضافة 0.5 مل من الكولسترول بنسبة 1 ٪ (الذائبة في الايثانول 95 ٪) ل1L س بصل) إلى 2000 لكل 500 ميكرولتر الحيوانات.
2. اقامة ~ 4 مل ثقافة إجمالي حجم (ق) في 25 مليلتر قوارير مخروطي ، على النحو التالي :

   العلاج :	NONE	"العقار"
   س بصل مع الكوليسترول	3020 ميكرولتر	UL 3020 -- "دواء" حجم
   النظائر مستقرة (1،6 -- 13 C - 2 الجلوكوز)	80 ميكرولتر	80 ميكرولتر
   K12 E. القولونية (OD 660 2،5-3)	400 ميكرولتر	400 ميكرولتر
   الديدان الكبار الصغار (2000)	500 ميكرولتر	500 ميكرولتر
   دواء (تركيز المطلوب)	--	على النحو المرغوب فيه

3. غطاء قوارير مع احباط. هزة قوارير لمدة 24 ساعة في 220 دورة في الدقيقة في 20 درجة مئوية المحتضنة منصة شاكر.
4. تأكد من عدم قوارير مغلقة تماما ، كما هو مطلوب لتدفق الأكسجين وسيط الأيضية الناتجة عن وضع العلامات على الأيضات الخيطية الذاتية.
5. غسل الديدان بإضافة 4 حجم ثقافة مل إلى 46 مل من S. القاعدية في أنبوب 50 مل من البلاستيك مخروطي. السماح لتكوير الديدان عن طريق الجاذبية لمدة 5 دقائق. شفط فراغ طاف وصولا الى ما زال ~ 5 مل. تكرار غسل إعادة تعبئتها بواسطة أنبوب مرتين أكثر من 50 مل مع القاعدية س.
6. تركز الديدان الديدان التي ابتلعها 1000 / مل في أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي من البلاستيك.
7. إضافة 69 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 60 ٪ (PCA) و 2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر القياسي الداخلي (ε أمينوكابرويك حامض) لتحقيق تركيز النهائي للمعيار 200 μmol الداخلية وPCA 4 ٪.
8. تحضير العينات وخطوات في # 11-22 ألف في بروتوكول

بروتوكول C - 1. رصد استخدام النظائر المشعة في الديدان الكبار على لوحات الكربون عن طريق تتبع المسمى في ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي والمنحل.

* ملاحظة : لما كانت هناك بروتوكولات وطرق التفصيل B لرصد إدماج النظير في الأيضات الحرة داخل الديدان أكثر من 2-3 أيام للتنمية أو يوم 1 من حياة البالغين ، على التوالي ، تأكيدا صارخا لنجاح وحركية إدماج النظائر خلال دورة زمنية قصيرة لا يمكن أن يتحقق (أي دقيقة إلى ساعة) من قبل التسمية في رصد ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي (CO ₂₎ أفرج عنه من الديدان أو الواردة في ثاني أكسيد الكربون المذاب في استخراج دودة. ويمكن تغذية البكتيريا الحية أو لقتل الديدان عندما نمت على لوحات (بروتوكول C - 1). البكتيريا وليس من الضروري التعرض للنظائر قصيرة الأجل من الديدان في الثقافة السائل (بروتوكول C - 2).

1. إعداد أطباق بتري 100 ملم مع 10 مل من آغار NGM. انتشرت لوحات NGM مع E. OP50 إما مباشرة أو الأشعة فوق البنفسجية ، قتل القولونية (كما هو موضح في الشكل 1). السماح لوحات لتجف بين عشية وضحاها.
2. إضافة 500 ميكرولتر من 200 ملي 1،6 المسمى C - ¹³ - ₂ الجلوكوز لوحات OP50 NGM الانتشار (لتركيز النظير النهائية من 10 ملي على لوحة NGM). السماح لوحات لتجف بين عشية وضحاها.
3. الحصول على متزامن ، أول يوم وضع البيض ، وانتشار الديدان الشباب البالغين نمت على لوحات أجار NGM فقط مع E. OP50 القولونية.
4. نقل 1000 الديدان البالغة الشباب لوحات تجريبية آغار NGM تحتوي على النظائر مستقرة وهاء. القولونية (كما أعد الخطوات لكل # 1-2 ، أعلاه).
5. لوحة مكان NGM التجريبية (بدون غطاء) في غرفة زجاجية مخصصة مزودة محبس 3 - طريقة جيدة للسماح مغلقة لأخذ العينات ودقة الجو الاستبدال. الختم على الفور مع القرص غرف زجاجية شفافة بصريا. التماس حيث تغطي الزجاج القرص يجلس على لوحة مع الشحوم عالية لفراغ الختم. وقت قياسي "0 الوقت".
6. عينة 10 مل من الغلاف الجوي من الغرفة الزجاجية بنسبة 3 في اتجاه ومحبس مع حقنة مل 20 في 30 دقيقة و 60 و 90 و 120. نقل كل عينة في الغلاف الجوي إلى ما قبل 10 مل أعدت سدادة مطاطية تصدرت أنبوب زجاجي يحتوي على 1 مل من NaHCO 1 مم ₃ في هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N أنه تم الفراغ مختومة.
7. ضخ 10 مل من الهواء الخلفي في كل غرفة من خلال الزجاج 3 محبس طريقة استخدام حقنة مل 20. إغلاق محبس إلى الغرفة بعد أخذ العينات / إعادة إعطاء الجو وقبل استئناف الحضانة بين نقاط جمع الوقت.
8. وتصدرت ضخ 100 ميليلتر من حمض الفوسفوريك 20 ٪ عن طريق سدادة سدادة مطاطية في 10 مل أنبوب زجاجي يحتوي الغلاف الجوي CO ₂ العينة.
9. إزالة 2 مل من الغلاف الجوي ، وحقنه في 12 مل أنابيب لصناعة السيارات في العينات الأزرق العلوي قبل مليئة الهليوم لقياس الغلاف الجوي ₂ CO.
10. تحليل "في الغلاف الجوي CO ₂ عينات" من خلال مطياف الكتلة الغاز نسبة (ThermoQuest Finnigan دلتا بلس).
11. غرف زجاجية مفتوحة بعد ساعتين النظائر فترة حضانة المرض وجمع عينات من كل الغلاف الجوي.
12. غسل الديدان الخروج من لوحات NGM استخدام 3 مل من القاعدية س.
13. غسل الديدان في 50 مل س. القاعدية في 50 مل من أنابيب فالكون. تكرار غسل مرتين أخريين.
14. التركيز على الديدان الديدان 1000 ~ / مل في 7 مل أنبوب زجاجي جولة القاع (ق).
15. فراغ أنبوب زجاجي الختم مع سدادة مطاطية.
16. إضافة 100 ميكرولترمن حمض الفوسفوريك 20 ٪ عن طريق حقنة مع سدادة مطاطية للافراج عن حل CO _2.
17. إزالة 2 مل من الجو وضخها في 12 مل من أنابيب التلقائي العينات الأزرق العلوي قبل مليئة الهليوم لقياس المنحل ₂ CO.
18. تحليل "حل CO ₂ عينات" من خلال مطياف الكتلة الغاز نسبة (ThermoQuest Finnigan دلتا بلس).

البديل بروتوكول (C - 2) : استخدام النظائر المشعة في رصد الديدان البالغة في الثقافة عن طريق تتبع الكربون السائل المسمى في ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي والمنحل.

1. الحصول أولا متزامن يوم وضع البيض ، والديدان الشباب البالغين نمت على لوحات أجار NGM مع انتشار E. OP50 القولونية.
2. غسل الديدان في 50 مل من القاعدية S. في 50 مل من أنابيب فالكون. السماح لتكوير الديدان عن طريق الجاذبية لمدة 5 دقائق. طاف لإزالة 5 مل ~. كرر يغسل أكثر مرتين.
3. نقل الشاب البالغ 1000 الديدان في 1 مل س. القاعدية إلى 10 مل أنبوب زجاجي جولة القاع. إضافة 10.1 ميكرولتر من الأسهم M - 1 من عالميا المسمى C - ¹³ الجلوكوز إلى 1 مل من الديدان لتحقيق تركيز النهائي من 10 ملم.
4. الأوكسجين في الجولة أنبوب زجاجي القاع الديدان والتي تحتوي على النظائر من خلال تبادل الغلاف الجوي مع تدفق 100 ٪ في أنبوب الأكسجين مفتوحة لمدة 2 دقيقة. على الفور إغلاق أنبوب مع سدادة مطاطية.
5. هزة أنابيب تجريبية في 20 درجة مئوية شاكر منصة المحتضنة في 220 دورة في الدقيقة. سجل بدءا وقت "0 الوقت".
6. عينة 5 مل من الغلاف الجوي من 10 مل أنبوب زجاجي جولة القاع باستخدام حقنة 10 مل و 25 إبرة قياس من خلال سدادة مطاطية في الدقائق 30 ، 60 ، 90 و 120.
7. وتصدرت الغلاف الجوي نقل كل عينة إلى سدادة مطاطية معدة سلفا ، و 10 مل أنبوب زجاجي يحتوي على 1 مل من 1 ملم NaHCO ₃ في هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N أنه تم الفراغ مختومة.
8. ضخ 5 مل من الهواء في كل مرة أنبوب زجاجي الجولة التجريبية القاع تحتوي على الديدان والنظائر من خلال سدادة مطاطية تستخدم الحقنة 10 مل و 25 إبرة قياس.
9. استئناف حضانة التجريبية 10 مل أنابيب زجاجية تحتوي على جولة القاع الديدان والنظائر التي تهتز في 220 دورة في الدقيقة وقت جمع بين نقاط.
10. وتصدرت ضخ 100 ميليلتر من حمض الفوسفوريك 20 ٪ عن طريق سدادة في الغلاف الجوي تحتوي على سدادة مطاطية 10 مل أنبوب زجاجي.
11. إزالة 2 مل من الجو وضخها في 12 مل من أنابيب التلقائي العينات الأزرق العلوي قبل مليئة الهليوم لقياس الغلاف الجوي ₂ CO.
12. تحليل "في الغلاف الجوي CO ₂ عينات" من خلال مطياف الكتلة الغاز نسبة (ThermoQuest Finnigan دلتا بلس).
13. في نهاية الفترة التجريبية ، وغسل الديدان في 50 مل س. القاعدية في 50 مل أنبوب فالكون. بيليه الدودة تسمح لتشكيل بواسطة الجاذبية. شفط فراغ طاف وصولا الى ما زال ~ 5 مل. تكرار الغسيل لأكثر مرتين في 50 مل من القاعدية س.
14. التركيز على الديدان الديدان 1000 ~ / مل في 7 مل أنبوب زجاجي جولة القاع. إضافة سدادة مطاطية وفراغ أنبوب الختم. إضافة 100 ميليلتر من حمض الفوسفوريك 20 ٪ باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة قياس 25 عن طريق سدادة مطاطية لإطلاق ثاني أكسيد الكربون الذائب الدودة _2.
15. 2 مل إزالة الغلاف الجوي ويحقن 12 مل أنابيب لصناعة السيارات في العينات الأزرق العلوي قبل مليئة الهليوم لقياس المنحل ₂ CO.
16. تحليل "حل CO ₂ عينات" من خلال مطياف الكتلة الغاز نسبة (ThermoQuest Finnigan دلتا بلس).

بروتوكول دال تصنيع تحييد عينات من البروتوكولات A و B لحمض أميني والعضوي تحليل الطيف اللوني بواسطة حامض / كتلة الغاز.

1. حبة التحضير :
   1. إضافة 1 N حمض الهيدروكلوريك على كل من حج حج 1 و 50 حبات منفصلة في الأكواب 1L.
   2. يحرك كل قارورة لمدة 30 دقيقة مع مغناطيسي.
   3. تغسل حبات مع الماء منزوع الأيونات حتى 10 مرات من الرقم الهيدروجيني الغسيل متساوون في درجة حموضة الماء.
2. العمود التحضير :
   1. إدراج المكونات القطن فقط فوق أضيق جزء من غيض ماصة باستور.
   2. إضافة حبات المحملة على كل واحد من عمودين لكل عينة ، وملء كل ثلث تقريبا من ارتفاع العمود. AG1 استخدام الخرز لاستخراج الحمض العضوي. AG50 استخدام الخرز لاستخراج الحمض الأميني.
3. عينة التحميل :
   1. إضافة 500 ميليلتر من العينة إلى العمود مع حبات AG1 المشحونة. لم يضف شيئا إلى نموذج (انظر بروتوكول ، الخطوة # 19B) قبل التقدم بطلب لاستخراج العمود AG1 الأحماض العضوية ، وإذا كان النموذج هو بالفعل في الرقم الهيدروجيني محايدة.
   2. إضافة 1 مل من HCL N 0.1 إلى العينة المتبقية قبل تطبيقه على العمود AG50 لاستخراج الأحماض الأمينية.
   3. عينات تسمح لتشغيل تماما من خلال الأعمدة.
   4. يغسل بالماء العمود 10 مرات الغسيل حتى تكون محايدة (7-8 نطاق الحموضة).
   5. أزل الأعمدة لالعذبة ، وصفت قوارير الزجاج 4 مل العينة :
      1. لاستخراج حمض عضوي ، إضافة 3mL من حمض الهيدروكلوريك N 3 إلى AG1 العمود. هذا يسمح تحليل النظائر من اليورانيوم في عدد من الكربونات المسمى بين 3 أنواع الكربون (اكتات) ، والأنواع 4 - الكربون (اسبارتاتي ، سكسينات ، مالات)5 - الكربون الأنواع (غلوتامات) ، و 6 أنواع من الكربون (سترات).
      2. لاستخراج حمض أميني : إضافة 3mL من 4 N NH ₄ OH إلى AG50 العمود. هذا يسمح تحليل النظائر من اليورانيوم في عدد من الكربونات المسمى بين 3 أنواع الكربون (ألانين) و 5 الكربون الأنواع (الجلوتامين).
   6. ضع قارورة العينة في المبخر الثالث Reacti برنامج عمل فيينتيان ، بين عشية وضحاها حتى تجف.

هاء Derivitization نموذج الضبط وآلة لقياس الطيف الكتلي

إضافة 50 ميكرولتر من أسيتونتريل و 50 ميكرولتر ن ميثيل NT - butyldimethylsilyl trifluoroacetamide (MTBSTFA) إلى كل قارورة العينة. تغطية ، ومزيج احتضان لمدة 30 دقيقة في 60 درجة مئوية. حقن 1-2 ميكرولتر لكل عينة في مطياف اللوني / قداس الغاز (GC / MS).

F. تحليل النتائج

1. الكمي للقمم الأحماض الأمينية. ويتم احتساب الكميات من كل الأحماض الأمينية عن طريق التحليل HPLC باستخدام مساحة كل النسبي الذروة إلى أن المعيار الداخلي.
2. حساب تخصيب النظائر. ويحسب لتخصيب النظائر مستقرة في اكسل (مايكروسوفت) عن كل نوع من الأنواع وفقا للمعادلة التالية : نسبة الزيادة اتوم ، تصحيح (APE) = (R _SA - R _ش) * 100 / [(R _SA - R _ش) +100] ، حيث R _SA -- نسبة العينة _وش R -- نسبة قياسية.
3. فروق ذات دلالة إحصائية بين تقييم تخصيب العينة. ويستخدم الطالب اختبار t لتقييم أهمية الأحماض الأمينية والاختلاف النسبي بين النظائر العينات.

الممثل النتائج :

والنظائر مستقرة جيدا دمجها الديدان الشباب البالغين ، كما يتضح من الكربون المسمى قياس ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي في ₂ و ثاني أكسيد الكربون الذائب الدودة 2. في تغذية الديدان تعيش إما قتل أو الأشعة فوق البنفسجية المشع ، OP50 E. القولونية ، كانت نسبة ثاني أكسيد الكربون من ^{13 _2-12} CO ₂ أكبر في حل جزء دودة ₂ ثاني أكسيد الكربون بالنسبة للصدر في الغلاف الجوي ₂ (الشكل 1). تغذية الديدان الحية أو قتل OP50 E. لم القولونية لا يغير كثيرا من قياس ^{13 _2-12} ثاني أكسيد الكربون ₂ النسبة في استخراج دودة غسلها (انظر بروتوكول C1).

زيادة التعرض لفترات طويلة للنظائر مستقرة من الفترة المبكرة اليرقات تخصيب النظائر في الأيضات وسيط. تصحيح نسبة الزيادة ذرات الكربون في تحديد المسمى الأيضات سيط الديدان من الشباب البالغين من النوع البري كان أكبر في جميع أنواع الغلوتامات عندما كانت تتغذى الديدان عالميا المسمى تغذية ¹³ C - الجلوكوز وتعيش البكتيريا في جميع أنحاء التطور النسبي للحيوانات تعامل بالمثل البكتيريا المسماة لمدة 48 ساعات فقط بعد الوصول إلى مرحلة وضع البيض البالغين (الشكل 2).

تأثير المقاصة مرات على تخصيب النظائر. بغض النظر عن التعرض timecourse ، كانت "تطهير" جميع الحيوانات نمت على لوحات من النظائر قبل إعداد المصب لGC / MS التحليلات. وقد أجريت مقارنة بين بروتوكولات تبادل المعلومات كما هو مبين في الشكل 2 ، بما في ذلك تغذية الديدان لمدة 2 ساعة على لوحات أجار NGM انتشار بكتيريا جديدة مع العيش من دون النظائر أو تتغذى على لوحات أجار NGM دون البكتيريا لمدة 2 ساعة ، وتتغذى على لوحات أجار NGM دون البكتيريا ل إما 2 أو 6 ساعات. بغض النظر عن التعرض النظائر بالطبع ، لم يلاحظ أي اختلاف كبير في تخصيب النظائر في الأيضات وسيط من الشباب البالغين استخراج دودة بأكملها عندما تم تطهير الحيوانات على لوحات من دون البكتيريا لساعات إما 2 أو 6. على النقيض من ذلك ، لوحظ أقل تخصيب النظائر في الأيضات سيطا في وقت لاحق عندما كانت الحيوانات تطهيرها "من النظائر الزائدة التي تتغذى على البكتيريا غير المسماة لمدة ساعتين. ومع ذلك ، وزيادة تخصيب اليورانيوم في +3 ، +4 ، و+5 الأنواع كان واضحا عندما تعرضوا لديدان النظير من الفترة اليرقات في وقت مبكر. ولذلك ، تم تحديد بروتوكول تبادل المعلومات المثلى لإزالة الديدان التالية تكون الحضانة على لوحات NGM مع انتشار النظائر مستقرة والبكتيريا عن طريق حضانة لاحقة لمدة 2 ساعة على لوحات NGM unspread. من المذكرة ، وكانت تغسل الديدان نمت في الثقافة السائل واضحة من النظائر والبكتيريا في ثلاثة مجلدات من القاعدية S. (انظر البروتوكول باء) ؛ GC / MS تحليل الغسيل لم تظهر أي تخصيب كبيرة من النظائر غسل الثالثة.

أسفرت دودة طحن تخصيب القصوى في الأيضات وسيط. لتحسين التخصيب في المئة في أعقاب الظروف الأيضات سيط معاملة مماثلة ، وقدم مقارنة بين عينات الدودة تعطلت بسبب صوتنة وحدها أو صوتنة زائد طحن. الشكل 3 يبين أن الديدان تعطلت عقب التعرض النظائر التي كان صوتنة زائد طحن تخصيب النظائر أكبر من العينات التي عطلت فقط صوتنة. هذه البيانات تشير الى ان تعطلت أكثر الكسور شبه العضوي من قبل الطحن بواسطة صوتنة. وكشفت دراسات لاحقة وحدها دون طحن sonicatio ن كان كافيا لتحقيق أقصى قدر من تخصيب النظائر (لا تظهر البيانات).

كله دودة التعرض تصاريح تحليل النظائر الأيضية الوسيطة تدفق الطريق. تغذية الديدان تعيش مع السلائف النظائر المستقرة سواء خلال التنمية (بروتوكول ، الشكل 4A) أو في بداية مرحلة الحيوانات الكبار (بروتوكول B ، الشكل 4B) يسمح تحليل النظائر الحساسة لتخصيب بين الأيضات يدل على تدفق من خلال تحلل (اكتات ، الألانين) ، البيروفات الأيض (الألانين) ، ودورة حمض الكربوكسيليك (سترات ، مالات ، سكسينات ، اسبارتاتي ، الغلوتامات ، والجلوتامين). عالميا المسمى C - ¹³ يوفر الجلوكوز العلامات قوية من جميع الأنواع الكربون ، في حين ان الاستفادة من 1،6 -- ¹³ C - ₂ الجلوكوز تراخيص العلامات القوية فقط في كل الأنواع +1 المستقلب. ويمكن تمييز هذه التقنية بحساسية من الخلافات البرية من نوع الدودة الوسيط بين التمويه الأيضية الميتوكوندريا سلالات متحولة سلسلة التنفسي ، مثل مجمع التنفسي الميتوكوندريا الثالث متحولة الوحيدات سلسلة ISP - 1 (qm150). الشكل 5 يوضح حجم الاختلافات التي لوحظت في التسمية المطلقة بين ISP - 1 (qm150) والديدان N2 كل يتعرضون لمدة 24 ساعة إلى 1،6 -- ¹³ C - ₂ الجلوكوز في السائل مع ثقافة E. K12 البكتيريا القولونية من اليوم الأول لوضع البيض مرحلة الشباب البالغين (البروتوكول باء). دراسات إضافية النظائر المستقرة في مجموعة من الديدان الطافرة الميتوكوندريا لا تزال جارية.

الشكل 1. وكان ¹³ عالميا المسمى C - الجلوكوز النظائر مستقرة جيدا دمجها الديدان الشباب البالغين ¹³ CO ₂ : ¹² نسبة ثاني أكسيد الكربون ₂ (الذرات الزائدة في المئة (APE) ، تصحيح) في الديدان (N2) من النوع البري بعد ساعتين التغذية عالميا المسمى C - ¹³ و ¹³ الجلوكوز إما للأشعة فوق البنفسجية أو قتل البكتيريا تعيش OP50 على لوحات (بروتوكول C1) ، وكان جيم إدماجها الأيضات دودة قوية بعد ساعتين من التعرض للنظائر. أشرطة زرقاء وحمراء تدل تخصيب النظائر النسبي في المرحلة الغازية ("الغلاف الجوي CO _2") والطور السائل ("دودة CO _2") ، على التوالي.

الشكل 2. زيادة التعرض لفترات طويلة النظير من الفترة المبكرة واليرقات في وقت لاحق "تطهير" الديدان على لوحات أجار NGM البكتيريا دون تخصيب النظائر في الغلوتامات خالية من الديدان الشباب البالغين. يظهر تخصيب النظائر في الأنواع الغلوتامات للديدان تتغذى على لوحات أجار مع NGM عالميا المسمى ، ¹³ C - الجلوكوز وOP50 البكتيريا إما خلال مراحل تطوره من مرحلة L1 اليرقات خلال مرحلة الشباب البالغين 959 خلية ("L1" ، انظر بروتوكول) ، أو 48 ساعة عند بداية الديدان وصلت في اليوم الأول من وضع البيض الشباب المرحلة الكبار ("يا"). X - المحور يشير إلى مجموع عدد ذرات الكربون في كل الأنواع المسماة الغلوتامات. العمودي يشير إلى تخصيب في المئة (ذرات تصحيح في الفائض (القرد)). أشرطة خضراء تشير الديدان مسح عقب التعرض النظائر عن طريق تغذية OP50 E. القولونية دون النظير على لوحات NGM لمدة ساعتين قبل PCA الاستخراج. أشرطة زرقاء ورمادية تشير الديدان مسح عقب التعرض النظير على لوحات NGM دون البكتيريا أو النظير لمدة سنتين أو ست ساعات ، على التوالي ، قبل استخراج محكمة التحكيم الدائمة.

الشكل 3. تعطيل طحن الغلال التي الديدان تخصيب النظائر القصوى في الأيضات دودة وسيط. في المئة من تخصيب الكربون المقاسة في الأنواع البرية في سيترات +1 من نوع الديدان المعالجة لمدة 24 ساعة في الثقافة السائل مع 1،6 -- ¹³ C - ₂ الجلوكوز دون البكتيريا (بروتوكول باء). أشرطة سوداء ورمادية تشير الديدان التي تعطلت قبل صوتنة فقط أو صوتنة وطحن ، على التوالي. تخصيب النظائر بعد التعرض ل1،6 -- ¹³ C ويتم تقييم أفضل ₂ - الجلوكوز في الأيضات صفت على واحد الكربون. في المقابل ، هو المخصب التسمية في جميع الأنواع كل المستقلب عندما عالميا المسمى - ¹³ - C ويستخدم الجلوكوز.

الشكل 4. ممثل النتائج توضح مدى تخصيب النظائر في الأيضات سيط دودة الإشارية للتحلل من خلال التمويه ، والتمثيل الغذائي بيروفات ، ودورة حمض الكربوكسيليك. تقرر تصحيح الزائدة في المئة الذرات (القرد) في الديدان الكبار الصغار (N2 بريستول) من النوع البري التالية 1 ، ^6-13 C - ₂ الجلوكوز التعرض إما (أ) من خلال تطوير المرحلة L1 على لوحات (بروتوكول) ، أو (ب) التي تبدأ في اليوم الأول من وضع البيض وصغار البالغين لمدة 24 ساعة في الثقافة السائل (بروتوكول ب) . أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري فيها بيانات موثوقة من ثلاثة نظائر البيولوجية يتطابق كانت متاحة.

= "jove_content">
الشكل 5. الكميات المطلقة من الأحماض الأمينية الأحماض الأمينية من الأنواع البرية في المستقلب من نوع الدودة والميتوكوندريا سلالات متحولة. وقد حسبت التسمية المطلقة في كل الأنواع من أربعة الأحماض الأمينية بضرب HPLC التي تحددها التركيز الخالي من الأحماض الأمينية (nmol / ملغ من البروتين الدودة) التي تتجاوز المئة تصحيح الذرات (APE) لكل الأنواع. القضبان الرمادية والسوداء تشير إلى البرية من نوع (بريستول N2) والميتوكوندريا الوحيدات السلالات الثالث متحولة المعقدة (ISP - 1 (qm150)) ، على التوالي. تشير الأشرطة متوسط ​​تكرار التجارب الثلاث البيولوجية لكل سلالة.

Discussion

تطبيق مطياف الكتلة لقياس وفرة النظائر في الأيضات سيط يوفر صورة تفصيلية رائعة من التغيرات الحيوية الهامة ^5. هنا ، لقد قدمنا ​​بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لاستغلال هذه المنهجية حساسة للغاية ومحددة لتقييم تدفق سيط الأيض في نموذج حيواني تنوعا وراثيا ، C. ايليجانس. في الواقع ، وتغذية الحيوانات التي تعيش مع النظائر مستقرة المسمى السلائف الأيضية (مثل C - ¹³ الجلوكوز) تصاريح البصيرة الرواية إلى التمويه وسيط المسار الأيضي عند قياس تخصيب النظائر في الأيضات المصب. قمنا بتطوير منهجية موثوقة للحصول على تحليل دقيق للتدفق من خلال تحلل ، والتمثيل الغذائي بيروفات ، ودورة حمض الكربوكسيليك. ويمكن تحقيق ذلك في كل من الحيوانات التي تتغذى من النظائر مستقرة المراحل المبكرة التنموية اليرقات أو يبدأ في فترة ما بعد الإنقسامية الكبار. ويمكن دراسة تخصيب النظائر في الأنواع المختلفة المستقلب بالتزامن مع دودة كاملة مجانا التنميط الأحماض الأمينية التي كتبها عالية الأداء اللوني السائل ، كما هو موضح سابقا ⁴ ، لتحديد تخصيب النظائر المطلقة في أنواع مختلفة من ألانين خال من الديدان ، اسبارتاتي ، الغلوتامات ، والجلوتامين. في الواقع ، ويتم الحصول على أنماط ثابتة لتخصيب النظائر عند قياس الأحماض الأمينية والأحماض العضوية في analytes aliquots من 1000 إلى 2000 الديدان الصغيرة متزامن الكبار. هذه المنهجية يمكن أن تميز بحساسية تدفق غير طبيعي وسيط في سلالات الميتوكوندريا النووي القائم على الجينات الطافرة المتعلقة البرية من نوع الديدان.

هذا الأسلوب يحمل قيمة للتحقيق تغييرات في مسارات تدفق البيوكيميائية محددة ذات صلة الأخطاء الشائعة في استقلاب خلقي. على وجه الخصوص ، والاستفادة من الجلوكوز المسمى مع النظائر مستقرة يبلغ تدفق الكربون من خلال المسارات الأيضية المركزية ذات الصلة لأمراض الميتوكوندريا. في الواقع ، تشير البيانات المتوفرة لدينا تطبيق هذه المنهجية يمكن أن تميز بحساسية تدفق غير طبيعي وسيط في جين المستندة الميتوكوندريا النووية سلالة الثالث معقدة متحولة الوحيدات (ISP - 1 (qm150)) نسبة إلى البرية من نوع الديدان.

من المهم أن ندرك أنه منذ اكتمال التعرض النظائر على مدى فترة من واحد إلى عدة أيام ، وتخصيب النظائر كميا يمثل "حالة ثابتة" قيمة التخصيب بدلا من قياس تدفق على مدى فترة محددة من الزمن كما قد يتم تحديدها في الخلية المستندة إلى النماذج تتعرض لالنظير لمدة دقيقة إلى ساعة. آخر المحتملة الحد من تدفق مسار التحقيق على مدى تطور النيماتودا يتعلق اختلاف أطوال نمو اليرقات التي تحدث في سلالات متحولة معينة. على سبيل المثال ، لا يعرف العديد من الطفرات الميتوكوندريا شديدة لسبب الاعتقال في المرحلة الثالثة اليرقات (L3) ^6. وبالتالي ، قد دمج تحليل النظائر فقط في الحيوانات التي تعيش إلى سن البلوغ لا تكون ممثلة للسكان متحولة بأكمله. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذه المنهجية لتقييم إدماج النظائر في الأيضات الوسيط في مرحلة اليرقات محددة (مثل L2) بدلا من انتظار الحيوانات للوصول الى مرحلة البلوغ. وبالمثل ، قد غيرت الحيوانات التي تدخل في مرحلة اليرقات البديلة المعروفة باسم dauer المرجح بدرجة كبيرة (على الأرجح أقل من ذلك) الأيضية التدفق النسبي للحيوانات الذين المتابعة مباشرة من خلال مراحل اليرقات الأربعة. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ دراسة في المستقبل لتقييم التأسيس مباشرة النظائر في الحيوانات مرحلة dauer من خلفيات وراثية مختلفة. تعريض الحيوانات لنظائر مستقرة لفترة زمنية محددة (هنا ، و 24 إلى 48 ساعة) بداية الحيوانات مرة واحدة وصلت إلى مرحلة الشباب البالغين (B كما هو مفصل في البروتوكول) يزيل أثر التنموية فترات متفاوتة. في حين أن ¹³ C - الجلوكوز باستجواب فقط تحلل ، والتمثيل الغذائي البيروفات وتدفق دورة حمض الكربوكسيليك ، يمكن استشفاف يحتمل النظائر الأخرى المقررة لاستجواب البيوكيميائية تدفق المسار من خلال مسارات أخرى ذات أهمية في الديدان الخيطية. على سبيل المثال ، قد تكون استخدمت ¹⁵ N - جليكاين لتقييم دوران حامض أميني في الديدان الخيطية.

آخر قيود محتملة لهذا النهج هو مستوى حساسية الكشف المستقلب. تجربتنا تشير مطلوبة بحد أدنى من 500 الديدان الخيطية البالغين الشباب لتحديد بنجاح إدماج النظائر بالطرق HPLC و GC / MS يعملون هنا. استخدام الأدوات مع قدر أكبر من الحساسية ، مثل فائقة الأداء اللوني السائل (UPLC) ، قد تتيح المزيد من خفض عدد الحيوانات التي تمت دراستها ، على الرغم من أننا نتوقع هذا من غير المحتمل أن تسمح الكميات موثوقة من الأيضات ودمج النظائر في المستقلب الأنواع من الديدان واحد. درسنا السكان دودة من 1000 حيوان في التجربة ، والتي وجدنا لكشف موثوق الأيضات فرة منخفضة في كل سلالة. ومع ذلك ، لا يمكن إلا بعض الأيضات ، مثل GABA ، يمكن قياسها كميا ، يعتمد عليه في أعداد أكبر بكثير من الديدان الخيطية ، بناء على أمر من1x10 ⁶ الحيوانات ^4.

باختصار ، النظائر المستقرة يوفر التنميط غير الغازية وآمنة (غير المشعة) النهج الذي لطالما استخدمت لدراسة أخطاء في استقلاب خلقي. تطبيق هذه المنهجية إلى C. ايليجانس يوفر قدرة الرواية على التحقيق في الجسم الحي ، في الوقت الحقيقي ، والتعديلات الأيضية التي تحدث على مستوى كل الحيوانات ، والتي قد تنجم عن الاضطرابات الجينية الفردية و / أو التعرض للعوامل الدوائية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. basal		1 - page 59	Protocols A and B
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8503	Protocol B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocols A and C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocol B
NGM agar	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	Protocols A, B, and C
13C glucose (universally labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	Protocol A and C
13C glucose (1,6 labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	Protocol B
60% Perchloric acid (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	Protocols A and B
ε-aminocaproic acid (Internal Standard)	Sigma-Aldrich	A-2504	Protocols A and B
MTBSTFA	Regis	270243	Protocol E
Acetonitrile	Regis	270010	Protocol E
AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin	Bio-Rad	140-1441	Protocols A and B (organic acid extraction)
AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin	Bio-Rad	142-1441	Protocols A and B (amino acid extraction)
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	Protocol C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	Protocol C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol A
0.1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	Protocol D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	Protocols A and B
Deionized water	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	Protocol D
Helium	Airgas	24001364	Protocol C2
SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope	Nikon Instruments	NI MNA41000	Protocols A, B, and C
pH meter	Fisher Scientific	S68167	Protocols A and B
Table top centrifuge - 5804R	Eppendorf	05-400-93	Protocols A and B
Incubated platform shaker	New Brunswick Scientific	M1324-0004	Protocol B
Mini LabRoller Rotator	Labnet International	H-5500	Protocols A and B
Pestles	Kontes Corp	K749520-0090	Protocols A and B
Drill	Kontes Corp	K749540-0000	Protocols A and B
1 L glass beaker	Fisher Scientific	02-539P
1 L Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-368
25 mL Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-356	Protocol B
7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6431	Protocols A, B, and C1,C2
10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6430	Protocol C2
Blue top tubes	Labco	438B
50 ml conical plastic tubes	Falcon BD	14-959-49A	All protocols
1.5 ml microfuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320	Protocols A and B
Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	Protocols C1 and C2
25 gauge needles	Fisher Scientific	22-253-131	Protocols C1 and C2
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550	Protocol D
Pasteur pipettes	VWR international	14673-043	Protocol D
60mm Petri dishes	VWR international	25373-085	Protocol C
Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock	Custom Made		Protocol C
Optically transparent glass plate	Custom Made		Protocol C
Reacti-Vap III Evaporator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	Protocol D
Cotton	VWR international	14224-516	Protocol D
High Vacuum Grease	Dow Corning	1597418	Protocol C1
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-18	Protocol B
Timer	ISC Bioexpress	T-2504-5	Protocol C
Gas-Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Protocol D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	Protocol D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	Protocol D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	Protocol D