نموذج الفأر من في الرحم زراعة

Summary

نموذج فأرة في الرحم زرع أداة متعددة الاستعمالات التي يمكن استخدامها لدراسة التطبيقات المحتملة السريرية لزرع الخلايا الجذعية والعلاج الجيني في الجنين. في هذا البروتوكول ، نقدم مقاربة عامة لأداء هذه التقنية

Abstract

زرع الخلايا الجذعية والفيروسات في الرحم لديها امكانات هائلة لعلاج الاضطرابات الخلقية في الجنين البشري. على سبيل المثال ، في زرع الرحم (IUT) من الخلايا الجذعية المكونة للدم قد استخدمت بنجاح لعلاج المرضى الذين يعانون من نقص المناعة الشديد مجتمعة ^1،2 ، وفي ظروف أخرى عديدة ، ومع ذلك ، فقد حاولت دون نجاح الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا. ³ ونظرا لهذه النتائج المختلطة ، وتوافر نموذج غير بشرية فعالة لدراسة العواقب البيولوجية لزرع الخلايا الجذعية والعلاج الجيني أمر بالغ الأهمية لدفع عجلة هذا المجال. وقد استخدمنا وغيرهم من طراز الماوس الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا لدراسة العوامل التي تؤثر في نجاح engraftment في الرحم المزروع الخلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران البرية على حد سواء من نوع ^4-7 وأولئك الذين يعانون من الأمراض الوراثية. ^8،9 البيئة الجنين كما يوفر مزايا كبيرة لل نجاح العلاج الجيني في الرحم. على سبيل المثال ، أدى تسليم ¹⁰ الفيروسة الغدانية ، الغدة المرتبطة الفيروسية ¹⁰ ، ¹¹ فيروسات ، وناقلات lentiviral ^12،13 في الجنين في تنبيغ الأجهزة متعددة بعيدة من موقع الحقن مع التعبير الجيني على المدى الطويل. في الرحم ولذا قد يكون العلاج الجيني تعتبر استراتيجية العلاج المحتمل للاضطرابات جين واحد مثل ضمور العضلات أو التليف الكيسي. ميزة أخرى محتملة من الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا هي القدرة على تحفيز جهاز المناعة على التسامح مستضد معين. كما رأينا في الفئران مع الهيموفيليا ، وإدخال عامل التاسع في وقت مبكر من نتائج التنمية في التسامح لهذا البروتين ^(14).

بالإضافة إلى استخدامه في التحقيق العلاجات البشرية المحتملة ، يمكن للنموذج الفأر من الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا أن تكون أداة قوية لدراسة المسائل الأساسية في بيولوجيا الخلايا الجذعية والتنموية. على سبيل المثال ، يمكن للمرء تقديم مختلف الجزيئات الصغيرة للحث أو منع محددة التعبير الجيني في مراحل الحمل ومعرفة التعامل مع المسارات التنموية. ويمكن تقييم أثر هذه التعديلات في timepoints المختلفة بعد الزرع الأولي. علاوة على ذلك ، يمكن للمرء أن زرع الخلايا المحفزة أو نسب محددة السلف في البيئة لدراسة الأجنة الجذعية تمايز الخلايا المضيفة في بيئة غير المشع وغير قلق.

قدمت نموذج الفأر من الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا بالفعل أفكارا عديدة داخل مجالات علم المناعة ، والتنموية ، وبيولوجيا الخلايا الجذعية. في هذا البروتوكول القائم على الفيديو ، ونحن وصف نهج خطوة بخطوة لأداء الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا في الأجنة الماوس والخطوط العريضة للخطوات حاسمة والمزالق المحتملة لهذه التقنية.

Protocol

1. إعداد حقن الماصات

1. معايرة مجتذب ماصة مثل هذا الفصل بين ماصة الزجاج يحدث في غضون 15 ثانية (انظر تعليمات الشركة الصانعة فيما يتعلق المعايرة). سوف ماصة لديها تفتق حيث يفصل.
2. قطع نهاية ماصة مثل هذه المسافة من بداية تفتق إلى نهاية ماصة غير ل1.04cm 1.05cm. طول ماصة يتناسب عكسيا مع عيار فتحة ماصة. أن ندرك أن صنع أطول ماصة النتائج أيضا في الطرف الأضعف التي هي أكثر عرضة للكسر خلال الحقن.
3. الخطوة المقبلة في جعل ماصة هو خلق شطبة السلس شحذ طرف على عجلة الماس شحذ. في وقت قطع ماصة إلى الحجم المناسب ، وغالبا ما ماصة فواصل مع شطبة الطبيعية في طرفها الذي يجب أن تستخدم عند وضع ماصة على عجلة القيادة. أثناء هذه العملية ، فمن المهم للراحة بلطف ماصة على عجلة وشحذ دوريا إعادة تقييم للتأكد من ماصة لمس تزال عجلة (كما شطبة يصبح أكثر سلاسة ، سوف تفقد الاتصال مع شحذ عجلة).
4. مرة واحدة في شطبة ناعمة ، لا بد من شحذ غيض ماصة (الشكل 1). رفع ماصة بحيث لم يعد لمس عجلة شحذ ، تناوب عليها من قبل في اتجاه عقارب الساعة 10-50 درجة ، ووضع الظهر ماصة على عجلة دوارة شحذ لمدة 10 ثواني ~. سحب ماصة من العجلة وشحذ الآن فحص الحافة. هذه الخطوة تحتاج عادة إلى تكرارها مع تعديلات صغيرة عدة لإنشاء حافة حادة. إذا وضعت على حافته ماصة لفترة طويلة جدا ، هو أكثر عرضة لتطوير سطح متفاوتة (الشكل 1). بعد الانتهاء من جانب واحد ، يمكنك أن تنتقل إلى شحذ حافة المعاكس بتكرار الخطوات المذكورة أعلاه.
5. استخدام علامة دائمة لرسم خط كفافي كل 4mm بدءا حيث تفتق يبدأ من ماصة. هذه الخطوط الفاصلة تتوافق مع حجم 5uL.

2. زرع في الرحم

1. بعد إعداد المادة عن طريق الحقن (الخلايا على سبيل المثال ، فيروس ، الخ) يمكنك إعداد للحقن. نستخدم microinjector متصلة الهواء المضغوط مع الإعدادات التالية : (ضبط الضغط : 60-80 رطل المدخلات ، وملء 40 رطل ، وضخ 8-12 رطل في البوصة المربعة ، والتوازن 0 رطل في البوصة المربعة ، وعقد 0 رطل ؛ الوقت حقن 100 مللي ثانية).
2. ماصة لتعقيم الحقن ، وتنظيفه مرتين مع EtOH 70 ٪ تليها مرتين مع 1X PBS العقيمة. كما غيض من ماصة لا يزال هشا للغاية ، ونحن لا ننصح التعقيم وماصات الحقن.
3. يمكن إما أن يتم ذلك باستخدام حقن loupes التكبير 2.5X - الإصدار 3.5x أو مجهر تشريح. إعداد منطقتك الداخلي ببطانية الاحتباس الحراري ، والإضاءة ، والأدوات الجراحية اللازمة.
4. تخدير الحوامل الماوس (نستخدم isoflurane والأكسجين تسليمها عن طريق وحدة التخدير تدفق مستمر). ضع الماوس على وسادة التدفئة في موقف ضعيف ويلصق كل طرف مع الشريط لتأمين الماوس في المكان.
5. مقطع الفراء. ثم ، وارتداء القفازات الجراحية المعقمة ، الإعدادية في البطن مع 10 ٪ بوفيدون اليود ، تليها الكحول ، وحقن مسكنة من هذا القبيل كما البوبرينورفين.
6. جعل شق 1cm في أسفل البطن (الجانب الأكثر أدنى من شق ينبغي حوالي 1cm متفوقة على introitus). شق الجلد واللفافة و. يجب الحرص على عدم إيذاء أعضاء البطن (الأمعاء والمثانة) والتي هي على الفور تحت طبقة رقيقة من اللفافة.
7. باستخدام قطعة قطن ، وتمتد برفق لفافة وتسليم الرحم الحامل من خلال شق. احصاء عدد الأجنة التي يتم أولا تحديد المبيضين الأيمن والأيسر للتأكد من تصور الرحم بأكمله. مكان الرحم مرة أخرى في تجويف البطن قبل المتابعة بحيث تظل دافئة الأجنة أثناء التحضير للحقن.
8. وضع حجم مناسب من المواد اللازمة لعدد من الأجنة كنت تخطط لحقن. بينما شغل الإبرة مع عينتك ، فمن المهم للحفاظ على الحافة submersed ماصة لتجنب الشفط عينتك في أنابيب microinjector. منذ الخلايا عادة في حجم صغير ، ونحن عادة مكان لهم في microfuge الصغيرة (مثلا : 0.5mL) أنبوب أو مباشرة على قطعة من Parafilm لتكون قادرة على ملء الإبرة دون كسر غيض ماصة.
9. عقد بلطف كل الجنين والتعرف على جزء من الجنين كنت تخطط لحقن (الكبد على سبيل المثال ، التجويف البريتوني ، الساق ، الخ). مع الإبهام والسبابة ، يجب تثبيت الجنين داخل التجويف الذي يحيط بالجنين بحيث لا تدور في حين يتم تنفيذ عملية الحقن. من المهم الاستمرار على الجنين بحزم كاف لتحقيق الاستقرار في ذلك حتى الآن بما فيه الكفاية بلطف لتجنب الإضرار بها.
10. إدراج ماصة بعناية من خلال الرحم ، سلى ، وجلد الجنين ، وإلى الجهاز الهدف. إذا ماصة حاد ، ينبغي أن يمر بسهولة من خلال هذه الأنسجة. إذا غيض ماصة غير مملة ، كنت واي ليرة لبنانية خيام إشعار الرحم والأغشية الأمنيوسي. حقن حجم المطلوب في كل الجنين. لا بد من أن يكون ثابتا تحركاتك خلال وقت الإدراج ، والحقن ، والانسحاب من ماصة.
11. مرة واحدة يتم حقن حجم المطلوب ، سحب ماصة بعناية. إذا فعلت بشكل صحيح ، يجب أن المواد التي لم يتسرب من التجويف الذي يحيط بالجنين أو الرحم. إذا تم إنشاء حفرة كبيرة في السلى ، والتي يمكن للمرء أن يتعرف عن تسرب السائل الذي يحيط بالجنين ، ثم يعرض للخطر بقاء. أخيرا ، من أجل الدراسات التي تنطوي على حصاد ما بعد الولادة ، يجب على جميع الأجنة تلقي حقن مثالية من الناحية الفنية ، حيث لا يوجد وسيلة لتمييز الأجنة وحقن uninjected بعد الولادة.
12. إذا كنت تنفذ عمليات الحقن في كبد الجنين ، قد ترى في بعض الأحيان الدم في الطرف ماصة بعد سحب هذا ، فإنه يؤكد كنت في الموضع الصحيح ، وينبغي ألا تؤثر على بقاء. إذا كان أداء الحقن داخل الصفاق ، وتهدف أقل قليلا من كبد الجنين. لحقن العضلي ، قد وضع الجنين لتحديد الورك والفخذ وحقن العضلة الألوية. أخيرا ، من أجل حقن داخل البطيني ، فمن السهل أن نرى خيوط الاكليلية لتوجيه ماصة للهدف المناسب. لهذه الحقن ، ويطلب من ماصات عيار أكبر قليلا لاختراق الجمجمة دون كسر ماصة.
13. المقبل ، بعناية مكان الرحم مرة أخرى إلى تجويف البطن. تأكد من عدم الملتوية على نفسها أو حول إمداد الأوعية الدموية. تقديم برنامج تلفزيوني من 1mL 1X العقيمة في التجويف البريتوني الأم لاستبدال أي السوائل التي فقدت أثناء العملية. إغلاق شق في 2 طبقات مع خياطة مضفر امتصاص 5-0 (مثلا : Vicryl). أولا إغلاق اللفافة دون إصابة الأمعاء أو المثانة الكامنة ، ومن ثم إغلاق الجلد.
14. في هذا الوقت ، يمكن أن تدار بعد الإجراء أدوية لتسكين الألم. عودة إلى حقن كل أنثى في قفص الفردية الخاصة ، ووضع القفص على بطانية الاحتباس الحراري. رصد الماوس حتى يصبح في وضع مستقيم. وضع الفراش في قفص ووضع الماوس في منطقة هادئة من الماوس المرفق حيث انه لا ينبغي ان ينزعج (أي عدم تنظيف القفص) حتى عدة أيام بعد الولادة. والتقليل من أي ضغط إضافي للحيوان تقليل فرص العمل قبل الأوان.
15. بمجرد الانتهاء من حقن نظيفة ماصة الخاص مرتين مع 1X PBS معقمة وEtOH مع 70 ٪ مرة واحدة.
16. ينبغي التقيد الإناث حقن يومية لضمان انهم يتماثلون للشفاء من الإجراء دون صعوبة. ينبغي رصد شق للعلامات ، والتهاب تورم ، وفصل الجرح ، وغيرها من العدوى. يمكن إعطاء المسكنات بعد العملية حسب الحاجة.

3. ممثل النتائج :

بقاء الأجنة حقن لمدة التسليم هي العامل الرئيسي الذي يحد من تحقيق النجاح مع هذه التقنية. اعتمادا على حقن المواد وسلالة تستخدم الماوس ، يمكن أن تختلف معدلات البقاء على قيد الحياة. بصفة عامة ، ينبغي أن حقن الخلايا المكونة للدم في البرية من نوع الفئران في E14 ينتج ما لا يقل عن 50 ٪ يعيشون المولد الجراء. ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة ممكنة بالاعتماد على الجوانب الفنية على حد سواء من الحقن ، وكذلك الخصائص لدى الفئران التي حقنت.

التقليل من الصدمة إلى الرحم والأغشية السلوية هو الجانب الأكثر أهمية التقنية لهذا البروتوكول. حادة ، وذات العيار الصغير ماصات الصدمات في الرحم نتيجة الحد الأدنى من خلال الحقن. نحن لا نوصي باستخدام إبر الحقن وفقا لمعايير الكفاءة من الإبر الجاهزة كبير جدا وسيؤدي في حفرة كبيرة في الرحم. وضعت اليد حقن الزجاج الماصات هي إلا إبر عيار الصغيرة التي يمكن استخدامها في عمليات الحقن في الرحم. تقنية جراحية دقيقة ودقيقة ، بما في ذلك التعامل مع طيف من الرحم ومخدر قصير أمر حاسم أيضا من أجل تحقيق النتائج المثلى.

يمكن أن خصائص معينة من الفئران المستفيدة مثل الخلفية الوراثية ، وعمر الحمل ، وحجم القمامة تؤثر أيضا على البقاء على قيد الحياة. سلالات معينة من الفئران هم أكثر عرضة للعمالة المبكرة وفقدان الحمل اعتمادا على خلفيتهم الجينية. الحيوانات المعدلة وراثيا ¹⁵ بعيوب العضلات أو الاعصاب يمكن أن يكون ضعف القدرة على تقديم الأجنة عن طريق المهبل بعد خضوعه لالبطن خط الوسط ⁸ إناث الحوامل وهذه قد تتطلب التسليم من قبل قيصرية. وقد وجدنا أيضا أن عمر الحمل في وقت الحقن يمكن أن تؤثر على قدرتها على البقاء. الأجنة التي تقل أعمارهم عن 12 يوما الجنينية وانخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة من كبار السن الأجنة. أخيرا ، وجدنا أن حجم القمامة كبيرة (> 10 الأجنة) تميل إلى أن ارتفاع معدلات سقوط الجنين بعد الحقن. الاهتمام بالجوانب التقنية على حد سواء من هذه التقنية والخصائص التي تنفرد بها الفئران يمكن حقنها تعظيم بقاء الأجنة المحقونة.

ve_content "> وعندما يتم تنفيذ هذه الأساليب بشكل صحيح ، يمكن للمرء أن يتوقع أن تتعرض الأجنة لجميع المواد المحقونة. مماثلة لوضع ما بعد الولادة ، إلا أن التنفيذ الناجح للخلايا أو الفيروسات في الرحم لا يؤدي دائما في engraftment الخلية المانحة أو الجين التعبير ، على التوالي. engraftment للخلايا الجذعية ، على سبيل المثال ، تعتمد على عدة عوامل مثل جرعة ومصدر للخلايا المزروعة. وبالمثل ، فإن نجاح تنبيغ الفيروسية ، في جزء منه ، والتي تحددها نوع من ناقلات الفيروسية المستخدمة. يجب على المرء فهم العوامل العديدة التي تؤثر البقاء الجرو ، engraftment الخلوية ، وتنبيغ الفيروسية لتحقيق النجاح مع هذا البروتوكول.

الشكل 1. مخطط تصور سليم لشحذ ماصات الحقن (الخطوة 1.4)

Discussion

أكثر من 50 عاما مضت ، بيلينجهام ، برنت ، ومدور المستخدمة في زرع الرحم في الفئران للحث على التسامح في مأمن من البروتينات الخارجية ^(16). ومنذ ذلك الوقت ، وقد استخدمت عدة تنويعات من هذه التقنية لمعالجة مسائل في علم المناعة وبيولوجيا الخلايا الجذعية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipettes	Kimble Chase	71900-100
Pipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-30
Microinjector	Narishige International	IM-300
Pipette sharpener	Sutter Instrument Co.	Model BV-10