لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

Summary

القدرة على إنتاج لالجينات المحورة انواع معينة ايليجانس الجينومية باستخدام الحمض النووي التي يحملها fosmids على جاذبية خاصة حيث يتم الاحتفاظ بكافة العناصر التنظيمية المحلية. ووصف هو إجراء بسيط وفعال للانتاج عن طريق الجينات المحورة مع recombineering galK علامة اختيار.

Abstract

ويستخدم على نطاق واسع خلق الحيوانات المعدلة وراثيا في C. ايليجانس البحوث بما في ذلك استخدام البروتينات الانصهار GFP لدراسة نمط التنظيم والتعبير عن الجينات في المصالح أو جيل من تنقية تقارب جنبا إلى جنب (وات) الموسومة إصدارات جينات محددة لتسهيل تنقية بهم. عادة يتم إنشاؤها الجينات المحورة من خلال وضع مروج المنبع من الجين مراسل GFP [كدنا] أو المصالح ، وهذا غالبا ما ينتج عن نمط التعبير التمثيلي. ومع ذلك ، والعناصر الحاسمة لتنظيم الجينات ، مثل عناصر المراقبة في المنطقة 3 'غير مترجمة أو المروجين بديلة ، يمكن أن غاب عن هذا النهج. كذلك يمكن إلا أن يكون متغير واحد درس عادة لصق هذه الوسائل. في المقابل ، فإن استخدام الحمض النووي الجيني الدودة التي يحملها استنساخ الحمض النووي fosmid يتضمن على الأرجح إن لم يكن كل العناصر المتورطة في تنظيم الجينات في الجسم الحي الذي يسمح للمزيد من القدرة على التقاط نمط التعبير الحقيقي والتوقيت. لتسهيل توليد الجينات المحورة باستخدام الحمض النووي fosmid ، ونحن تصف E. القولونية يستند الإجراء recombineering لادخال GFP ، حنفية ، العلامة ، أو سلاسل أخرى ذات اهتمام في أي مكان في الجينات. يستخدم الإجراء الجين كما galK علامة الاختيار لكلا من اختيار الخطوات الإيجابية والسلبية في النتائج التي recombineering في الحصول على التعديل المطلوب بكفاءة عالية. مزيد من البلازميدات تحتوي على الجين galK محاط الأسلحة إلى التماثل GFP يشيع استخدامها والاستفادة من الجينات الانصهار متوفرة مما يقلل من تكلفة oligos بنسبة 50 ٪ عند توليد البروتين GFP أو TAP الانصهار. هذه البلازميدات استخدام النسخ الأصلية R6K ما يحول دون الحاجة إلى واسعة لتنقية المنتج PCR. أخيرا ، علينا أن نظهر أيضا تقنية لدمج علامة UNC - 119 إلى العمود الفقري fosmid الذي يسمح للfosmid حقنه مباشرة أو المقصوفة الديدان لتوليد حيوانات معدلة وراثيا. هذا الفيديو يوضح الإجراءات التي ينطوي عليها توليد التحوير عبر recombineering باستخدام هذا الأسلوب.

Protocol

نظرة عامة

العديد من الجينات المحورة المستخدمة في توليد جيم المعدلة وراثيا ايليجانس تتألف من تسلسل المروج وربما الجينات [كدنا] المستنسخة في واحدة من الناقلات التي تم إنشاؤها بواسطة مختبر الدكتور اندي الحريق ^1. في حين أن هذه الجينات المحورة وغالبا ما تكون ناجحة بالنسبة لإنتاج الجين مراسل GFP أو تعبر عن [كدنا] في نمط المرجوة ، يمكن لهذه الجينات المحورة تفتقر إلى المروجين بديلة ، وعناصر محسن ، و 3 "غير مترجمة المنطقة (UTR) العناصر التي تلعب دورا هاما في السيطرة التعبير الجيني في الجسم الحي ^2. على سبيل المثال ، فإن كلا من الجينات DAF - 12 - 1 وبكلية الآداب ومحسن العناصر الهامة التي تقع خارج المروج القريبة التي كانت ضائعة في المروج يبني ^3،4،5 فقط. مزيد من التحوير يبني العديد من استخدام 3'UTR UNC - 54 الذي يمنع التنظيم من الجينات المناسبة microRNA ^6،7،8. وبالتالي ، فإن توليد الجينات المحورة مع قطاعات كبيرة من الحمض النووي الجينومي الدودة تكون مثالية لالتقاط كل المروجين ، ولصق المتغيرات والعناصر 3 'السيطرة UTR. مؤخرا C. وقد شيدت المكتبة ايليجانس fosmid الذي يتكون من 40 كيلوبايت ~ مناطق من الحمض النووي الجيني ويغطي تقريبا كل من الجينوم. نفذت استخدام الحمض النووي الجيني من قبل هذه الدودة نتائج فحص الحمض النووي في الحيوانات المستنسخة fosmid أكبر القدرة على التقاط نمط التعبير الحقيقي وتوقيت ^{2،8،9،10،11} جينات معينة.

ومع ذلك ، والعمل مع مناطق واسعة من الحمض النووي الجينومي تحديات العملية ، مثل صعوبات كبيرة في استخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية ^12. للتغلب على هذه القيود ، وتقنيات لتعديل fosmids أو الكروموسومات البكتيرية المصطنعة في طريق إعادة التركيب مثلي E. وقد وضعت القولونية وتسمى recombineering ^12،13. Recombineering يسمح للالإدراج السلس للGFP ، وتنقية تقارب جنبا إلى جنب (وات) ، العلامة ، أو سلاسل أخرى ذات أهمية في أي مكان في الجينات التي يحملها جيم fosmid ايليجانس استنساخ ^2،10،14. تأشب مثلي يحدث بين منتج PCR يحيط بها مناطق غليان 50 من التماثل للموقع المستهدف والحمض النووي المستهدف في E. معدلة خصيصا سلالات القولونية.

وقد وصفت لنا مؤخرا إجراء من مرحلتين لتعديل C. fosmids ايليجانس بواسطة recombineering الذي يتضمن ادخال الجين galK في الموقع المطلوب ومن ثم استبدال هذه الجينات مع تسلسل المرجوة ^2. الجين galK بمثابة علامة اختيار فعالة لكلا الخطوات في هذه العملية حيث يمكن تحديده لصالح أو ضد من خلال استخدام متوسط ​​النمو الانتقائي ^15. في المرحلة الأولى من تعديل fosmid ، يتم إدخال هذا الجين galK عبر إعادة التركيب مثلي في الموقع المطلوب ، وتعديل بشكل صحيح fosmids التي حددها اختيار ايجابية نظرا لقدرته على استخدام اللبن كمصدر الكربون ^2،15. في المرحلة الثانية ، يتم استبدال الجينات galK حسب التسلسل المطلوب ، ويتم تحديد fosmids معدلة بشكل صحيح من خلال اختيار السلبية ضد هذا الجين galK من خلال استخدام مشتقات اللبن deoxygalactose السامة التي تقتل البكتيريا galK + ^2،15. ميزة من galK هو قدرة جينة واحدة لاستخدامها في اختيار الخطوات الإيجابية والسلبية ، بدلا من علامات الجينات الأخرى التي منفصلة عن كل خطوة ، والنتائج في الحصول على التعديل المطلوب بكفاءة عالية ^2،15.

لتسهيل تطبيق هذه التقنية لجيم ايليجانس البحوث ، وحققنا العديد من التغييرات على الموارد المتاحة. أولا ، ويشيع استخدام العلامات GFP والمشورة التقنية لتوليد الجينات المحورة الدودة ، التي بنيت لذلك نحن في مناطق غليان 50 من التماثل في كل من هذه العلامات في البلازميدات galK - G و - GT pMOD4 galK pMOD4 التي تشكل مصدر هذا الجين galK ^2. هذه المناطق تسمح لمجموعة واحدة من oligos لاستخدامها في كل من مراحل التعديل fosmid مما يوفر الحاجة إلى نظام المجموعة الثانية من oligos مكلفة نوعا ما. الثانية ، وهذه البلازميدات استخدام النسخ الأصلية R6K ما يحول دون الحاجة إلى هضم الأصل منتج PCR البلازميد أو واسعة لتنقية والوالد البلازميد ليست قادرة على تكرار في البكتيريا المستخدمة لrecombineering ، ويمكن تكرار فقط في سلالات خاصة مثل EC100 ^{2 و 16} (الجدول 1 والجدول 2). أخيرا ، وهي طريقة شائعة لتوليد جيم المعدلة وراثيا ايليجانس هو من خلال استخدام القصف biolistic تليها اختيار الديدان المعدلة وراثيا عن طريق الانقاذ من الطفرة UNC - 119 ^17. لجعل fosmids متوافقة مع القصف ، وضعنا في UNC - 119 pLoxP البلازميد والتي يمكن استخدامها لدمج علامة UNC - 119 إلى العمود الفقري fosmid ^2.

أولا أليغو التصميم

ويمكن أن تدرج مع recombineering تسلسل المطلوب في أي موقع داخل الجين. مواقع شيوعا هي في 'نهاية أو 3' 5 نهاية اعتمادا على المجالات الوظيفية ، المتغيرات صلة ، أو في مرحلة ما بعد التعديلات متعدية مثل الانقسام التي البروتياز. يمكن استخدام البلازميد GFP pMOD4 إنشاؤها بواسطة مختبرنا لادخال والعلم الموسومة GFP في أي موقع كما يتضمن البلازميد كودون البادئ ويفتقر إلى رامزة لمدة 3 "وقف (الشكل 1). في المقابل ، سمة TAP وإصدارات معينة لمدة 5 'و 3' اندماج بسبب الانقسام TEV استخدمت خلال تنقية ^18،19.

1. خطة الموقع من علامة الإدراج داخل الجين. تنظر المروجين بديل ، مجالات وظيفية بديلة ، تشريح ، والتعديلات اللاحقة لمتعدية عند النظر في موقع الإدراج. ويمكن استخدام مواقع مختلفة لإدخال البطاقات جميع ، واحد ، أو بعض الأشكال الإسوية من جين معين. تحديد 50 منطقة غليان المنبع والمصب من نقطة الإدراج.
2. تصميم oligos (الجدول 1). اما مقياس نانومتر 100 -- ويمكن استخدام هلام oligos المنقى أو oligos Ultramer من تقنيات الحمض النووي المتكاملة لهذا الإجراء.
   
   لأداء recombineering galK ، تحتاج إلى تصميم الاشعال galK التماثل مع غليان 50 إلى منطقة المرافقة للموقع المراد تعديلها ونهاية 3 'من هذه المشارع ربط galK الكاسيت ، التي هي موجودة في كل pMOD4 galK - G و pMOD4 galK - GT (الشكل 1). سوف تكون جزئية إلى الأمام 5' ------- ------- 50 سنة مضت تناظر CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA - 3 "واحد عكس ما 5' ------- 50 سنة مضت على التماثل حبلا التكميلية -- ------ TCAGCACTGTCCTGCTCCT - 3 ".
   
   لأداء recombineering galK مع GFP ، تحتاج إلى تصميم pMOD4 galK - G أو pMOD4 الاشعال galK - GT تناظر مع غليان 50 إلى منطقة المرافقة للموقع المراد تعديلها (الشكل 1). تأكد للحفاظ على البروتين الانصهار في الإطار. ويمكن تجاهل ATG اذا شئت. نهاية 3 'من هذه المشارع ربط مناطق تناظر GFP المرافقة كاسيت galK. ملاحظة : أكد codons الأول والأخير من GFP للتدليل على الإطار القراءة. سوف تكون جزئية إلى الأمام 5' ------- 50 سنة مضت تناظر ATG GATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG -3 '3' واحد عكس 5' ------- 50 سنة مضت على التماثل التكميلية ------- حبلا ------- الجهاز المركزي للمحاسبات AGCTTGTGGGCTTTTGTATAG - 3 "
   
   لأداء galK recombineering TAP C الأجل ، تحتاج إلى تصميم pMOD4 galK - GT الاشعال تناظر مع غليان 50 إلى منطقة المرافقة للموقع المراد تعديلها (الشكل 1). تأكد للحفاظ على البروتين الانصهار في الإطار. نهاية 3 'من هذه المشارع ربط مناطق تناظر TAP المرافقة كاسيت galK. ملاحظة : أكد codons الأول والأخير من المشورة التقنية لشرح الإطار القراءة. سوف تكون جزئية إلى الأمام 5' ------- ------ 50 سنة مضت تناظر ATG GAAAAGAGAAGATGGAAAAAG -- -3 "والعكس one 5' ------- 50 سنة مضت على التماثل حبلا التكميلية -- ------ -3 TGACTTCCCCGC GGT "
   
   لأداء galK recombineering TAP N الأجل ، تحتاج إلى تصميم pMOD4 galK - GT الاشعال تناظر مع غليان 50 إلى منطقة المرافقة للموقع المراد تعديلها (الشكل 1). تأكد للحفاظ على البروتين الانصهار في الإطار. نهاية 3 'من هذه المشارع ربط مناطق تناظر TAP المرافقة كاسيت galK. ملاحظة : أكد codons الأول والأخير من المشورة التقنية لشرح الإطار القراءة. سوف تكون جزئية إلى الأمام 5' ------- ------ 50 سنة مضت تناظر ATG GCAGGCCTTGCGC -- -3 "والعكس one 5' ------- 50 سنة مضت على التماثل حبلا التكميلية -- ------ AAG -3 TGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT '
   
   
3. إنشاء مجموعة من oligos المرافقة لPCR في خطوات لاحقة فضلا عن تسلسل fosmid. هذه هي المعايير التي ينبغي oligos PCR ربط ~ 100 غليان المنبع والمصب من موقع الإدراج.

II. Fosmid نقل البكتيريا الى SW016

وfosmids من C. وتقدم المكتبة في ايليجانس fosmid السلالة البكتيرية EPI300 (F - mcrA Δ (MRR - hsdRMS - mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (آرا ، ليو) 7697 galU galK λ - rpsL nupG trfA تونة) (التكنولوجيات الحيوية Epicentre ، ماديسون ، ويسكونسن ) الذي يسمح بزيادة التعبير fosmid أعلاه نسخة واحدة لكل خلية لتحسين غلة خلال تنقية الحمض النووي (الجدول 2). لrecombineering ، فإن الحاجة إلى fosmid يتم تحويلها الى سلالة بكتيرية SW106 (mcrA Δ (MRR - hsdRMS - mcrBC) ΔlacX74 deoR endA1 araD139 Δ (آرا ، ليو) 7697 rpsL recA1 nupG φ80dlacZΔM15 [λc1857 (CRO - bioA) <> تيت ] (CRO - bioA) <> أراك - PBAD ΔgalK لجنة المساواة العرقية) (NCI - فريدريك) سلالة الذي يحمل جينات التوحد λred مثلي تحت السيطرة على درجة الحرارة حساسة λ كاظمة ومحرض أرابينوز recombinase لجنة المساواة العرقية (الجدول 2) ^15.

1. النظام استنساخ الجينات fosmid من الاهتمام (الحكومة الإسرائيلية) من GeneService (كامبريدج ، المملكة المتحدة) باستخدام Wormbالبورصة كدليل. عند اختيار الحيوانات المستنسخة ، نختار منها أن يكون للحكومة العراقية في وسط التسلسل. ربما تلك التي تستبعد الجينات المجاورة يكون من الأفضل لكنه قد يكون من الصعب العثور عليها.
2. ثقافة استنساخ fosmid من الحكومة الإسرائيلية في LB تحتوي على 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول في 37 درجة مئوية.
3. تنمو ثقافة 1،5 مل بين عشية وضحاها من fosmid ، ومصغرة الإعدادية الحمض النووي fosmid باستخدام fosmid Epicentre الإعدادية مجموعة (Epicentre الحيوية ، ماديسون ، ويسكونسن). نحن نتبع البروتوكول البديل هو موضح في التعليمات التي تتضمن إضافة مزيج Riboshredder في خطوة سابقة.
4. تحديد تركيز الحمض النووي fosmid مع معمل.
5. إعداد electrocompetent SW106 الخلايا التي تنمو ثقافة 5 مل بين عشية وضحاها من SW106 في أنبوب الإضافية سقف 14 مل مع مرق LB مع الكلورامفينيكول ميكروغرام / مل 12.5 درجة مئوية في 32
6. تلقيح 1 مل الى 100 مل من LB مع الكلورامفينيكول في قارورة L 2. تنمو البكتيريا SW106 إلى 0،6-0،8 ₆₀₀ OD. لا تسخن للصدمة.
7. resuspend بيليه بواسطة الطرد المركزي في 5000xg لمدة 5 دقائق ، قبل بيليه vortexing لطيف ، وإضافة 50 مل من الجليد الباردة الجلسرين 10 ٪. كرر هذه الخطوة يغسل مرة واحدة.
8. بيليه وSW106 بواسطة الطرد المركزي ولكن جميع نضح ~ 500 ميكرولتر من كل طاف
9. Resuspend الكريات بواسطة vortexing لطيف. تجميد 100 aliquots ميكرولتر في النيتروجين السائل أو على الثلج الجاف ، وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
10. تحويل الحمض النووي في الخلايا fosmid SW106 electrocompetent electroporating بواسطة البكتيريا مع نانوغرام 50 ~ من الحمض النووي باستخدام fosmid 2510 إيبندورف electroporator في 1350 في 0.1 فولت cuvettes الفجوة سم.
11. استعادة البكتيريا في LB مل 1 : 1 ساعة بمعدل 32 درجة مئوية.
12. aliquots على لوحات لوحة LB مع الكلورامفينيكول (12.5 ميكروغرام / مل) ، واحتضان على 32 درجة مئوية خلال الليل.
13. التحقق من وجود الحكومة العراقية التي PCR مستعمرة. تنمو ثقافة 5 مل بين عشية وضحاها في LB مع 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول في 32 درجة مئوية. إضافة 0.5 ميكرولتر من ثقافة إلى تفاعل PCR القياسية مع oligos المرافقة ، وزيادة الأولي 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حضانة لليز البكتيريا قبل PCR.
14. إعداد المخزون الجلسرين للتخزين الطويل الأجل.

III. إدخال الجينات التي galK Recombineering

في المرحلة الأولى من تعديل fosmid ، يتم إدخال هذا الجين في galK fosmid بواسطة تأشب مثلي ، ويتم اختيار fosmids معدلة بشكل صحيح من أجل النمو التي تحتوي على الحد الأدنى من وسائل الاعلام على اللبن كمصدر وحيد للكربون (الشكل 2A). SW106 البكتيريا تنمو ببطء على وسائل الإعلام والحد الأدنى المطلوب من 3-5 أيام لمعرفة المستعمرات.

1. إعداد اجتماعات الأطراف الحد الأدنى من وسائل الاعلام لوحات تحتوي على اللبن 0.2 ٪. اجتماعات الأطراف وسائل الإعلام يتوفر الحد الأدنى من شركة Teknova (هوليستر ، كاليفورنيا) (كتالوج # M2106) ولكن لا تستخدم السكر المدرجة.
   
   اجتماعات الأطراف وسائل الاعلام مع الحد الأدنى من اللبن 0.2 ٪ (1 لتر)
   الأوتوكلاف 15 غراما أجار في 870 مل من الماء
   تبرد إلى 55 درجة مئوية ، وتضيف :

   100 مل	اجتماعات الأطراف الحد الأدنى من وسائل الاعلام 10X
   5 مل	0.2 ملغ / مل د البيوتين (العقيمة تصفيتها)
   4.5 مل	10 ملغ / مل L - يسين (1 ٪ ، يسخن ، ثم يبرد إلى أسفل وتصفيتها العقيمة)
   10 مل	20 ٪ سكر اللبن (تعقيمها)
   1 مل	12.5 ملغ / مل الكلورامفينيكول في EtOH
   2.55 مل	20 ٪ NH 4 الكلورين
   10 مل	0.132 بوتاسيوم ثنائي القاعدة فوسفات M

2. PCR تضخيم pMOD4 galK - G أو pMOD4 galK - GT باستخدام الأشرطة الاشعال مصممة أعلاه. وقد استخدمنا Phusion (نيو إنجلاند Biolabs ، ايبسويتش ، MA) أو GoTaq (Promega ، ماديسون ، ويسكونسن).
3. هلام تنقية الفرقة الناجمة عن ذلك. قياس العائد من قبل جل أو معمل Nanodrop. PCR هذا المنتج جاهز للخطوة 3.14.
4. تطعيم ثقافة بين عشية وضحاها من SW106 الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي في fosmid LB 5 مل مع الكلورامفينيكول (12.5 ميكروغرام / ميكرولتر). تنمو بمعدل 32 درجة مئوية.
5. تعيين تهز حمام مائي إلى 42 درجة مئوية إلى الاحماء مع قارورة 250 مل العقيمة في حامل. استخدام حمام ماء تهز أمر حاسم للحصول على كفاءة عالية.
6. إضافة 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 100 مل من LB والكلورامفينيكول في قارورة L 2. تنمو إلى OD 0،6-0،8. هذا عادة ما يستغرق 3-4 ساعات.
7. نقل 50 مل من SW106 الخلايا إلى قارورة 250 مل والحرارة صدمة في 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة بالضبط. في هز بالحمام المائي عند 100 دورة في الدقيقة اترك البكتيريا المتبقية على 32 درجة مئوية كما uninduced السيطرة.
8. تبريد وبفعل البكتيريا uninduced على الجليد لمدة 10 دقيقة.
9. نقل العينات إلى أنبوبين الطرد المركزي معقمة وبيليه في ~ 5000xg لمدة 5 دقائق.
10. من أجل إيقاف كل من طاف وresuspend الكرية في 1 الجلسرين الجليد الباردة مل 10 ٪ بحلول vortexing اللطيف (أي وضع 3-4).
11. عندما معلق ، إضافة آخر 49 مل من الجليد الباردة الجلسرين 10 ٪ ، وبيليه العينات في 5000 ~XG لمدة 5 دقائق.
12. كرر الخطوة 3.9 ، 3.10 ، و 3.11 ثانية.
13. إزالة كافة طاف بواسطة أنابيب للقلب ، وresuspend الكرية في السائل المتبقي (حوالي 500 ميكرولتر لكل منهما). قسامة إلى 100 عينات ميكرولتر ، وتجميد الثلج الجاف ، وتخزينها في -80 درجة مئوية. هذه هي جيدة لأسابيع أو أشهر. (ونحن هنا وعادة ما يتوقف أداء electroporation في اليوم التالي).
14. Electroporate في المستحث وuninduced SW106 الخلايا مع 150 نانوغرام من الناتج PCR باستخدام 0.1 سم cuvettes الفجوة في electroporator إيبندورف تعيين 2510 في 1350 فولت.
15. استعادة البكتيريا في LB مل 1 في أنبوب 14 مل فالكون. في احتضان 32 درجة مئوية مقابل 4.5 ساعة.
16. بيليه البكتيريا في microfuge 13200 دورة في الدقيقة في مدة 15 ثانية. ومعلق على البكتيريا في M9 ثم غسلها مرتين إزالة أي وسيط الغنية (انظر أدناه للحصول على وصفة).
    • M9 المتوسطة (1 لتر)
    • 6G نا _{2 4} هبو
    • 3G KH ₂ PO ₄
    • 1G NH ₄ الكلورين
    • 0.5g كلوريد الصوديوم
    • الأوتوكلاف
17. بعد غسل الثاني ، تتم إزالة وطاف بيليه معلق في M9 مل 1 قبل الطلاء التخفيفات التسلسلي في M9 (100 ميكرولتر ، 100 ميكرولتر من تخفيف 1:10 م ، و 100 ميكرولتر 1:100) على وسائل الإعلام اجتماعات الأطراف الحد الأدنى.
18. احتضان 3-5 أيام عند 32 درجة مئوية في حاضنة. ملاحظة : كن صبورا وايجابيات الحقيقية تنمو ببطء.
19. a مستعمرات قليلة متتالية على لوحات مؤشر آغار ماكونكي دينار بحريني (# 281810) تستكمل مع اللبن 1 ٪ و 12،5 الكلورامفينيكول ميكروغرام / مل. يجب على جميع المستعمرات التي تظهر بعد الخطوة الأخيرة تكون galK + ، ولكن من أجل التخلص من أي galK -- الملوثات ، فمن المهم الحصول على ، ومشرق واحد المستعمرات الوردي قبل الانتقال إلى الخطوة الثانية. وgalK -- المستعمرات سوف تكون بيضاء / عديم اللون والبكتيريا + galK سيكون مشرقا أحمر / وردي نتيجة لتغير درجة الحموضة الناتجة من اللبن المخمر بعد الحضانة بين عشية وضحاها إلى 32 درجة مئوية.
20. اختيار مستعمرة واحدة وتطعيم رطل 5 مل + الثقافة بين عشية وضحاها الكلورامفينيكول للنمو بنسبة 32 درجة مئوية.
21. تأكيد غرز الجينات galK في المكان المناسب من خلال استخدام PCR oligos المرافقة. إضافة 0.5 ميكرولتر من ثقافة إلى تفاعل PCR القياسية الأولية وزيادة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حضانة لليز البكتيريا. وينبغي upshifted المنتج PCR في الحجم نظرا لوجود الجين galK.
22. إعداد المخزون الجلسرين للتخزين.

رابعا. استبدال galK مع تسلسل العلامات التي Recombineering

في هذه المرحلة يتم استبدال الجينات التي galK تسلسل العلامة المطلوبة ويتم تحديد بشكل صحيح من أجل تعديل fosmids عن طريق الانتقاء الجيني ضد galK من deoxygalactose الغالاكتوز التناظرية السامة (كلب) (الشكل 2B).

1. إعداد اجتماعات الأطراف الحد الأدنى من وسائل الإعلام التي تحتوي على لوحات deoxygalactose 0.2 ٪ (كلب) والجلسرين بنسبة 0.2 ٪. اجتماعات الأطراف وسائل الإعلام يتوفر الحد الأدنى من شركة Teknova (هوليستر ، كاليفورنيا) (كتالوج # M2106) ولكن لا تستخدم السكر المدرجة.
   
   الحد الأدنى من وسائل الإعلام اجتماعات الأطراف مع الكلب 0.2 ٪ والجلسرين (1 لتر)
   الأوتوكلاف 15 غراما أجار في 860 مل من الماء
   تبرد إلى 55 درجة مئوية ، وتضيف :

   100 مل	اجتماعات الأطراف الحد الأدنى من وسائل الاعلام 10X
   5 مل	0.2 ملغ / مل د البيوتين (العقيمة تصفيتها)
   4.5 مل	10 ملغ / مل L - يسين (1 ٪ ، يسخن ، ثم يبرد إلى أسفل وتصفيتها العقيمة)
   10 مل	20 ٪ deoxygalactose (العقيمة تصفيتها)
   10 مل	20 ٪ الجلسرين (تعقيمها)
   1 مل	12.5 ملغ / مل الكلورامفينيكول في EtOH
   2.55 مل	20 ٪ NH 4 الكلورين
   10 مل	0.132 بوتاسيوم ثنائي القاعدة فوسفات M

2. PCR تضخيم أجزاء من العلامة GFP pMOD4 ، pBS1761 (N الأجل وات) ، أو pBS1479 (C الأجل وات) باستخدام oligos نفسها التي استخدمت في الجولة الأولى أو باستخدام أقصر GFP أو المشورة التقنية الخاصة oligos (تسلسل الداخلية في الخطوة 1.2 ). إذا كنت ترغب بجعل بنيات متعددة ، فإنه من المفيد بشكل خاص لاستخدام أقصر oligos كما يمكن استخدام نفس المنتج PCR لكافة بنيات.
3. هلام تنقية المنتج PCR وقياس تركيز جل أو عن طريق القياس الطيفي.
4. ويتسبب توليد uninduced SW106 المختصة تحمل fosmid مع الجين galK إدراج الخطوات التالية 3،4-3،13 أعلاه.
5. Electroporate في المستحث وuninduced SW106 الخلايا مع نانوغرام 100 ~ من الناتج PCR باستخدام 0.1 سم cuvettes الفجوة في electroporator إيبندورف تعيين 2510 في 1350 فولت.
6. في استرداد LB 1 مل في أنبوب الإضافية سقف 14 مل واحتضان شاكر في 32 درجة مئوية مقابل 4.5 ساعة.
7. غسل وإضعاف البكتيريا كما هو الحال في الخطوات و3.16 3.17. لوحة البكتيريا على لوحات تحتوي على الحد الأدنى من وسائل الإعلام اجتماعات الأطراف 0.2 ٪ 2 - ديوكسي الجالاكتوز (كلب) والجلسرين بنسبة 0.2 ٪.
8. في احتضان 32 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.
9. تستخدم أربع مستعمرات لجعل 5 ملبين عشية وضحاها الثقافات في LB مع 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول. تستخدم هذه المستعمرة لPCR على النحو الوارد أعلاه لتأكيد أن تم إدراج كاسيت. علينا استخدام كل من أقصر GFP / TAP oligos محددة وoligos المرافقة للتدليل على إدراج الحق وموقع الحق. GFP هو ~ 800 سنة مضت ، والمشورة التقنية ~ 550 سنة مضت حين galK إلى 1.4 كيلوبايت.
10. إعداد المخزون الجلسرين.

خامسا إضافة UNC 119 مورثة بواسطة لجنة المساواة العرقية ، loxP التوحد

وسيلة مشتركة لتوليد حيوانات معدلة وراثيا مع fosmids المعدلة من خلال استخدام القصف biolistic. هذا الأسلوب يستخدم جزيئات الذهب الحمض النووي DNA المغلفة لأعرض fosmid في C. ايليجانس. وعادة ما يتم تحديدها عن طريق الحيوانات المعدلة وراثيا إنقاذ متحولة UNC - 119 مع التحوير UNC - 119. في هذه الخطوة ، يضاف - 119 UNC الجين إلى العمود الفقري fosmid في رابطة الدول المستقلة من قبل لجنة المساواة العرقية ، loxP التوحد مع pLoxP UNC - 119 البلازميد (الشكل 2C).

1. إعداد المختصة SW106 البكتيريا تحمل fosmid تعديل من الخطوة 4.9 باستخدام الخطوات 2،5-2،9. ولا تحاول حثه على 42 درجة مئوية.
2. Electroporate مع 50 نانوغرام. pLoxP UNC - 119 من الإعدادية مصغرة باستخدام 0.1 سم cuvettes الفجوة في electroporator إيبندورف 2510 التي حددت في 1350 فولت.
3. استعادة تحتوي على البكتيريا في LB أرابينوز 0.1 ٪ لمدة 1 ساعة على 32 درجة مئوية.
4. aliquots صفيحة تحتوي على لوحات LB 50μg/mL الأمبيسيلين و 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول. في احتضان 32 درجة مئوية خلال الليل. الذي يختار لدمج pLoxP UNC - 119 في fosmid.
5. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها في LB 50μg/mL تحتوي على أمبيسلين و12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول. لاستخدام 0.5 ميكرولتر PCR التحقق من وجود هذا الجين UNC - 119 مع قيادة الأمم المتحدة F - 119 (5' - CAAATCCGTGACCTCGACAC - 3 ") وUNC - 119 R (5' - CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG - 3') oligos (الجدول 1).
6. جعل المخزون من الجلسرين fosmid النهائي.

سادسا. اعداد كبيرة مقياس Fosmid

لتسهيل الحصول على كميات أكبر من الحمض النووي fosmid اللازمة للقصف ، في هذه الخطوة يتم نقل fosmid للبكتيريا EPI300. هذه السلالة لديه القدرة على زيادة عدد نسخ fosmid لزيادة الغلة خلال إعداد الحمض النووي.

1. تنمو ثقافة 5 مل بين عشية وضحاها من البكتيريا من الخطوة التي تحتوي على 5.5 في LB الأمبيسيلين والكلورامفينيكول في 32 درجة مئوية. استخدام Epicentre fosmid الإعدادية عدة لعزل fosmid من 1.5 مل من الثقافة.
2. Electroporate ~ 50 نانوغرام في استخدام البكتيريا EPI300 0.1 سم cuvettes الفجوة في electroporator إيبندورف تعيين 2510 في 1350 فولت. يمكن شراؤها من البكتيريا EPI300 الحيوية Epicentre (ماديسون ، ويسكونسن).
3. استعادة البكتيريا في LB لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. أغار على لوحة aliquots LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل و 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول.
4. تنمو وتحفز هذه البكتيريا تحتوي على EPI300 fosmid تعديلها باستخدام الإرشادات المرفقة. إن ثقافة يسببها إعطاء 50 مل> 10 ميكروغرام من الحمض النووي fosmid المنقى. تنقية fosmid مع عدة Epicentre fosmid الإعدادية.

سابعا. قصف

1. استخدام 10 ميكروغرام. من الحمض النووي لقصف fosmid سلالة دودة DP38 كما هو موضح (D. Hochbaum ، فيرغسون ألف وألف فيشر ، إن الرب ، في الصحافة).

ثامنا. ممثل النتائج

ويلاحظ وبشكل روتيني تعديل fosmids عبر recombineering قوية ومعدلات نجاح 90 ٪> في خطوة سلبية اختيار ^2. كما يأخذ هذا البروتوكول ~ 2 أسابيع لإتمام الأمر الذي يجعل من إعداد الجينات المحورة سريع نسبيا. البروتوكول كما حوكم من قبل مختبرات أخرى مع نجاح ^20.

أليغو	تسلسل
C - F مصطلح TAP	ATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG
C - R مصطلح TAP	GGTTGACTTCCCCGC
FLAG - F GFP	ATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG
FLAG - R GFP	CAAAGCTTGTGGGCTTTTGTATAG
N الأجل TAP F	ATGGCAGGCCTTGCGC
N الأجل TAP R	AAGTGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT
galK F	CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA
galK R	TCAGCACTGTCCTGCTCCT
UNC F - 119	CAAATCCGTGACCTCGACAC
UNC R - 119	CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG

الجدول 1. [أليغنوكليوتيد] تستخدم لPCR.

البلازميدات	مصدر	متوفرة في
Fosmid استنساخ	Geneservice المحدودة.	Geneservice
pGalK	15	NCI - فريدريك
pMOD4 - RT - G	2	Addgene
pMOD4 galK - G -
pMOD4 galK - GT -
pLoxP - UNC - 119
pMOD4 - GFP
بكتيريا
SW106	15	NCI - فريدريك
EPI300	التكنولوجيات الحيوية Epicentre	Epicentre
EC100D البير - 116

الجدول 2. الانفعال وتوافر النواقل.

الشكل 1.
رسم تخطيطي لpMOD4 galK - G - ، وpMOD4 - GT - galK ، pMOD4 GFP ، pLoxP - UNC - 119
والبلازميد pMOD4 galk - G - تتكون من الكاسيت galK (أسود) يحيط بها 50 منطقة النوكليوتيدات متطابقة إلى 5 'و 3' تنتهي من FLAG (براون) - GFP (الأخضر) ، بينما pMOD _{4 - galK - GT} يتكون من galK الكاسيت يحيط بها كل من المناطق تناظر العلم GFP و 50 مناطق النوكليوتيدات متطابقة إلى 5 'و 3' نهايات الطرفية وN - C - محطة وات (الأزرق والبرتقالي ، على التوالي). pMOD4 - FLAG - GFP تتكون من الكاسيت GFP الكامل مع البطاقات FLAG على بعد 5 'وpLoxP UNC - 119 يتكون من UNC - 119 تسلسل الجينوم (الأرجواني) في موقع يحتوي على البلازميد loxP. جميع البلازميدات الاستفادة من R6K المستندة pMOD4 (الحمراء) العمود الفقري الذي هو قادر على تكرار في SW106.

الشكل 2.
نظرة عامة على عملية recombineering galK
الشكل 2A - 2C أرقام منفصلة تبين الخطوات والوقت الذي يتطلبه recombineering باستخدام galK الكاسيت. هذه هي الأرقام نفسها التي يتم دمجها في 2D الشكل ، ولكنها لم تقدم بشكل منفصل عن الوضوح وسهولة القراءة. يتم تعديل لأول مرة عن fosmid الفائدة في إجراء من خطوتين يتضمن ادراج الكاسيت galK يحيط بها 50 منطقة من التماثل إلى غليان GFP - FLAG أو المشورة التقنية (الشكل 2A) ، يليه استبدال هذا الكاسيت التي GFP - FLAG أو TAP ( الشكل 2B). في وقت لاحق يتم إدراج علامة UNC - 119 للاستخدام في توليد الحيوانات المعدلة وراثيا في موقع LoxP على العمود الفقري fosmid (الشكل 2C).
2D الرقم يبين الشكل المدمج الداخلي recombineering galK.
المخطط الداخلي recombineering galK كما هو موضح في أعلاه بما في ذلك الوقت اللازم لكل خطوة من دمج الشكل 2A - 2C.

2A الرقم. galk والإدراج في recombineering galk.

الرقم 2B. العلامة (GFP / وات) الإدراج في recombineering galk.

الشكل 2C. إضافة UNC - 119.

الرقم 2D ، ونظرة عامة للدمج recombineering galk.

Discussion

توليد الجينات المحورة من fosmids يقدم فائدة الاحتفاظ بجميع العناصر المروج الأصلي ، متغيرات لصق ، و 3 "العناصر UTR التنظيمية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى بناء التحوير الذي هو أكثر تعبيرا عن نمط التعبير الأصلي ، أو بناء على التحوير وظيفية عندما تفشل الأساليب الأخرى ^5. يمكن ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FosmidMAX kit	Epicentre Biotechnologies	FMAX046
GoTaq	Promega Corp.	M7122
MOPS Media	TEKnova, Inc.	M2120
0.132 M Potassium phosphate solution	TEKnova, Inc.	M2102
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750
2-deoxygalactose	Sigma-Aldrich	D4407
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Phusion DNA polymerase	New England Biolabs	F-530S
MacConkey agar base	BD Biosciences	281810
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3131
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S5136
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025
Bacto Agar	BD Biosciences	214010