وDecellularization Recellularization الأكباد من الجامعة

Summary

decellularization التروية هو تقنية جديدة لإنتاج السقالات الكبد كله أن يحتفظ تكوين الجهاز في المصفوفة خارج الخلية والمعمارية المصغرة. هنا ، وصفت طريقة إعداد السقالات الجهاز بأكمله باستخدام decellularization نضح وإعادة تعمير لاحقة مع خلايا الكبد. يمكن أن تتولد ترقيع الكبد الوظيفية وزرع باستخدام هذه التقنية.

Abstract

الكبد هو جهاز معقد الذي يتطلب نضح المستمر لتسليم المواد الغذائية والأوكسجين وإزالة النفايات من أجل البقاء على قيد الحياة ^1. جهود لإعادة أو تقليد المجهرية الكبد مع أسس النهج حتى باستخدام هندسة الأنسجة وتقنيات التصنيع الدقيق لم تكن ناجحة حتى الآن لهذا التحدي بتصميم. بالإضافة إلى ذلك ، كانت محدودة الحيوية الاصطناعية المستخدمة لإنشاء السقالات لتطبيقات هندسة الأنسجة في الكبد إحداث تجديد وإصلاح الأنسجة في جزء كبير منه بسبب عدم وجود الحافز خلية محددة وملزمة من شأنها أن تحفز الخلايا السليمة وظائف ^2. وقد وجدت الأم الأنسجة Decellularized الأوعية الدموية مثل ³ و ⁴ على الجلد من ناحية أخرى العديد من التطبيقات في هندسة الأنسجة ، وقدمت حلا عمليا لبعض التحديات. ميزة المصفوفة decellularized الأصلي هو أنه يحتفظ ، إلى حد ما ، وتكوين الأصلي ، والمجهرية ، وبالتالي تعزيز ارتباط الخلية واعادة التنظيم ^5.

في هذا العمل الذي نقوم وصف الطرق لأداء نضح - decellularization في الكبد ، مثل أن حصلت على حالها bioscaffold الكبد الذي يحتفظ بنية الأوعية الدموية الرئيسية. علاوة على ذلك ، نحن تصف هذه الأساليب لrecellularize bioscaffolds مع خلايا الكبد الأولية الكبار ، وخلق طعم الكبد وظيفية في المختبر ، والوصول إلى السفينة اللازمة لزرعها في الجسم الحي.

Protocol

1. الكبد Decellularization

1. حصاد كبد الفئران مع إقناء ؛ إدخال القنية الوريد البابي باستخدام القسطرة وعيار 18. مغادرة السفلي والوريد الأجوف العلوي مفتوحا. الحفاظ على جهاز رطب في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في طبق بتري 10 سم.
2. اقامة نظام الارواء التي تتكون من خزان 8 ليتر ، ومضخة تمعجية فخ الفقاعة.
3. ملء نظام الارواء مع الفوسفات مخزنة المالحة وابقائه قيد التشغيل لمدة 10 دقيقة. شغل برنامج تلفزيوني في طبق بتري 10 سم ، وخفض معدل تدفق الفوسفات مخزنة المالحة إلى 1 مل / دقيقة.
4. نقل الكبد بعناية لحصاد الفوسفات مخزنة المالحة مملوءة طبق بتري 10 سم.
5. تواصل مع نضح PBS بين عشية وضحاها.
6. بدء نضح مع 0.01 ٪ (W / V) سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS) في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
7. يروي مع برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة.
8. كرر الخطوات من 1.6 و 1.7 مرة ثلاث زيادة الوقت نضح SDS إلى 10 دقائق و 15 و 20 في كل مرة.
9. مع استمرار التروية 0.01 ٪ (W / V) SDS لمدة 24 ساعة.
10. تواصل نضح بنسبة 0.1 ٪ (W / V) SDS لمدة 24 ساعة.
11. يروي مع 0.2 ٪ (W / V) SDS لمدة 3 ساعات.
12. يروي مع 0.5 ٪ (W / V) SDS لمدة 3 ساعات.
13. يروي مع الماء المقطر لمدة 15 دقيقة.
14. يروي مع 1 ٪ (W / V) تريتون X - 100 في الماء المقطر لمدة 30 دقيقة لإزالة أي الأحماض النووية ملزمة.
15. لغسل الكبد decellularized المصفوفة (DLM) ، يروي مع برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة.
16. اختياري : يقطع كل ما عدا فصوص الفص المتوسط.
17. تخزين DLM في طبق بتري نظيفة ومختومة غارقة في برنامج تلفزيوني في 4 درجة ^مئوية حتى جاهزة للاستخدام (الشكل 1).
18. لتعقيم DLM : 1) DLM فلوش في برنامج تلفزيوني مع العقيمة التي تحتوي على 0.1 ٪ (V / V) حمض البيروكسي و 4 ٪ (V / V) الايثانول واحتضان لمدة 3 ساعات في 4 ^درجة مئوية. 2) غسل العقيمة مع 2 مرات في برنامج تلفزيوني. 3) اغسلي مع برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 2 ٪ البنسلين الستربتوميسين ، جنتاميسين 10ug / مل ، و 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين باء الكبد decellularized مخزن في نفس الحل في 4 درجة ^مئوية حتى جاهزة للاستخدام للتجارب recellularization.

2. Recellularization من Decellularized الكبد ماتريكس

1. اقامة نظام الارواء التي تتكون من غرفة التروية ، ومضخة وتحوي فخ فقاعة تحت ظروف معقمة. ملء نظام الارواء مع 200 مل من المتوسط ​​الثقافة ، على سبيل المثال ارتفاع DMEM الجلوكوز (سيغما) ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني (Hyclone ،) ، و 100 مل يو ^-1 البنسلين ، و 100 ميكروغرام مل ^-1 الستربتوميسين (Invitrogen).
2. وضع مصفوفة الكبد decellularized في غرفة نضح وتوصيل DLM إلى نظام الارواء عن طريق الوريد البابي قنية في حين يتم تشغيل المضخة في 5 مل / دقيقة لتجنب تشكيل أي فقاعات هواء.
3. تسمح نضح من المتوسط ​​من خلال DLM لمدة 30 دقيقة.
4. عزل خلايا الكبد الأولية من الفئران البالغين مع بقاء ما لا يقل عن 90 ٪.
5. وقف التدفق في نظام الارواء وحقن خلايا الكبد ببطء 50000000 (1-3 مل في المتوسط ​​الثقافة) في نظام الارواء عن طريق فخ الفقاعة.
6. بدء تدفق في 10 مل / دقيقة ، وإعادة توزيع والمتوسطة لمدة 10 دقيقة.
7. كرر الخطوات من 2.5 و 2.6 حتى يتم تقديم ما مجموعه 200 مليون خلية في DLM (الشكل 2) ^6.
8. بمجرد perfused كافة الخلايا في DLM ، وجمع سائل الإرواء إلى أربعة أنابيب الطرد المركزي 50 مل و 600 دورة في الدقيقة في اجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة. تجاهل supernatants وجمع الكرات في أنبوب واحد. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء من خلال استبعاد التريبان الأزرق لتحديد كفاءة البذر.

3. الثقافة في المختبر من الكسب غير المشروع الكبد Recellularized

1. اقامة نظام الارواء التي تتكون من غرفة التروية ، ومضخة تمعجية ، ومكساج فخ فقاعة تحت ظروف معقمة (الشكل 3). ملء نظام الارواء مع 50 مل من مستنبت ، على سبيل المثال ، E ويليامز (سيغما) ، و 5 ٪ مصل بقري جنيني (Hyclone ،) ، و 0.5 مل يو الأنسولين ^-1 (ايلي ليلي) ، و 20 نانوغرام مل ^-1 EGF (Invitrogen) و 14 نانوغرام الجلوكاجون ^-1 مل (بيدفورد مختبرات) ، و 7.5 ميكروغرام هيدروكورتيزون ^-1 مل (فارماسيا) ، و 100 مل يو البنسلين ^-1 ، و 100 ميكروغرام مل ^-1 الستربتوميسين (Invitrogen).
2. وضع طعم الكبد recellularized في غرفة نضح وتوصيل DLM إلى نظام الارواء عن طريق الوريد البابي قنية في حين يشغل مضخة في 5 مل / دقيقة لتجنب تشكيل أي فقاعات هواء.
3. إغلاق جو معقم و مطهر للغرفة نضح وختم بإحكام لتفادي أي تسرب خلال الثقافة.
4. نقل نظام الارواء إلى أن حاضنة هو 37 ^درجة مئوية ، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 10 ٪ ₍₂₎ وزيادة معدل تدفق نضح إلى 15 مل / دقيقة.
5. توصيل مكساج إلى 95 ٪ O ₂ و 5 ٪ CO ₂ خزان الغاز المخلوط وضبط معدل تدفق الغاز إلى 0.5 لتر / دقيقة. وينبغي تحقيق هذا ضغط الأكسجين الجزئي للapproximately 400 مم زئبق.
6. قد تستمر ثقافة تصل إلى 10 يوما مع التغيرات اليومية متوسطة الثقافة. قد يكون أخذ عينات المتوسط ​​اليومي للثقافة مراقبة وظائف الكبد من الكسب غير المشروع مثل اليوريا والزلال ومجموع إفراز الحامض المراري. في نهاية الفترة الثقافة ، قد يتم أخذ عينات من الكبد recellularized الكسب غير المشروع للتحليل الجزيئي والنسيجية.

4. ممثل النتائج :

وdecellularization كاملة من كبد الفئران تستغرق حوالي 72 ساعة باستخدام بروتوكول صفها. المصفوفة الناتجة يحتفظ بنسبة 100 ٪ من الكولاجين لييفي ، و 50 ٪ من الجليكوزامينوجليكان و 5 ٪ فقط من الحمض النووي للكبد الأم (الجدول 1) ^6. هو الحفاظ على بنية الأوعية الدموية من المصفوفة كما يتضح من التآكل الصب والتحليل المجهري الإلكترون المسح الضوئي (الشكل 4) ^6. وجود معمارية الأوعية الدموية داخل DLM يسهل إعادة تعمير مع الخلايا مع كفاءة 96 ٪ ونضح لاحقة للثقافة في المختبر. قد يكون مثقف والكسب غير المشروع الكبد recellularized تصل إلى 10 أيام في المختبر ، ويعرض وظائف الكبد السليم كما أكدت عبر اليوريا والزلال ومجموع إفراز حامض الصفراء (الشكل 5) ^6.

Decellularized الشكل 1. مصفوفة الكبد في نهاية عملية decellularization. (أ) في الكبد كله (ب) بعد استئصال الفص المتوسط.

الشكل 2. تمثيل تخطيطي لrecellularization من DLM.

الشكل 3. الإرواء إعداد النظام للثقافة في المختبر من الكسب غير المشروع recellularized الكبد.

الشكل 4. يتم الاحتفاظ بنية الاوعية الدموية الدقيقة في مصفوفة decellularized الكبد. صور يلقي تآكل أ) الكبد طبيعية ب) الكبد decellularized ، الأوعية الدموية (الأزرق) بوابة (أحمر) وريدي. مسح الصور من المجهر الإلكتروني DLM ج) سفينة ، د) ويضم القسم القناة الصفراوية مثل السفن الصغيرة (الأسهم) ، والحانات مقياس (أ ، ب) 5 ملم (ج ، د) 20 ميكرون.

الشكل 5. ظائف الكبد محددة من الكسب غير المشروع خلال الكبد recellularized في الثقافة نضح المختبر. إفراز) الزلال (ع = 0.5249) ، ب) إنتاج اليوريا (ع = 0.5271) و ج) إفراز الحامض المراري مجموع (ع = 0.0114). وقد تم التحليل الإحصائي للفرق بين التجربة ومراقبة على مدى 10 د الثقافة من خلال اختبار فريدمان في = 0.01. أشرطة الخطأ تمثل SEM (ن = 3).

	الطازجة يفيرا	Decellularized الكبد المصفوفة	ف القيم	٪ من الكبد الطازج
	ن = 4	ن = 8
الكولاجين	0.07 ± 0.01	0.08 ± 0.03	0.56	114 ٪
(ملغ في الكبد ز)
الجليكوزامينوجليكان	73.1 ± 6.7	34.2 ± 2.9	0،004	47 ٪
(ملغ في الكبد ز)
الحمض النووي	14.9 ± 5.6	0.44 ± 0.08	3.3 10 -5	2.9 ٪
(ملغ في الكبد ز)

الجدول 1. تكوين البيوكيميائية للمصفوفة الكبد decellularized مقارنة الكبد الأصلي.
^وتمثل القيم كما يعني ± SEM

Discussion

الأسلوب decellularization نضح الموصوفة هنا تنتج كل سقالة الكبد يحتوي على نفس الهيكل الإجمالي والمعمارية المصغرة الأوعية الدموية للكبد الأم. السقالة لديه تكوين المصفوفة خارج الخلية مماثل للكبد الأم. الأسلوب recellularization يحقق إعادة تعمير السقالة مع الخلايا في الكفاءة العالية و?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149