شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

Summary

يصف هذا البروتوكول شاشة إنتاجية عالية للنشاط cellulolytic من مكتبة metagenomic أعرب في القولونية. الشاشة هو حل قائم ومؤتمتة للغاية ، ويستخدم واحد في 384 وعاء الكيمياء microplates جيدا مع قراءات النهائي باعتبارها قياس الامتصاصية.

Abstract

السليلوز ، المصدر الأكثر وفرة من الكربون العضوي على كوكب الأرض ، واسعة النطاق التطبيقات الصناعية ، مع التركيز على زيادة إنتاج الوقود الحيوي ^1. الطرق الكيميائية لتعديل أو تتحلل السليلوز تتطلب عادة الأحماض القوية ودرجات الحرارة المرتفعة. على هذا النحو ، أصبحت الطرق الأنزيمية بارز في عملية التحويل البيولوجي. في حين أن تحديد السليلوزات نشطة من العزلات البكتيرية والفطرية كانت فعالة الى حد ما ، فإن الغالبية العظمى من الميكروبات في الطبيعة مقاومة زراعة المختبر. الجينومية البيئية ، والمعروف أيضا باسم metagenomic النهج ، وفحص وعدا كبيرا في سد الفجوة زراعة في البحث عن الانزيمات التحويل البيولوجي الرواية. استعادت النهج بنجاح الفحص Metagenomic السليلوزات الرواية من بيئات متنوعة مثل التربة ² ، ³ الجاموس الكرش والأمعاء النمل الأبيض الخلفيتين ، ⁴ باستخدام لوحات كربوكسي ميثيل سلولوز آغار (CMC) ملطخة صبغ أحمر الكونغو (على أساس أسلوب Teather والخشب ^5). ومع ذلك ، يقتصر على الأسلوب CMC في الإنتاجية ، وليس الكمية ويظهر إشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء ^6. وقد ذكرت وسائل أخرى ^7،8 لكن كل استخدام لوحة أغار على أساس الفحص ، وهو غير مرغوب فيه لالفرز الفائق الإنتاجية الكبيرة المكتبات الجينومية إدراج هنا نقدم حلا يستند إلى الشاشة لنشاط سلولاز باستخدام نيتروفينول مولد اللون (DNP) - cellobioside الركيزة ^9. تم استنساخ لدينا في المكتبة نسخة pCC1 fosmid السيطرة على زيادة حساسية الفحص من خلال تحريض عدد النسخ ^10. ويستخدم أسلوب واحد في وعاء الكيمياء 384 جيدا microplates مع قراءات النهائية على النحو المنصوص عليه قياس الامتصاصية. هذه هي الكمية قراءات وحساسة والآلي مع سرعة تصل إلى 384 لوحات 100X جيدا يوميا باستخدام معالج السائل والقارئ لوحة المرفقة مع نظام التكديس.

Protocol

قبل البدء في هذا البروتوكول ، وسوف تحتاج مكتبتك metagenomic المخزنة في شكل 384 صفيحة جيدا. في دراستنا ، استخدمنا نسخة السيطرة pCC1 ناقلات fosmid في تركيبة مع TransforMax بالعاثية T1 المقاوم EPI300 ^R - T1 E. الخلايا القولونية كمضيف مكتبة ومخزن لوحات لدينا في ¹¹ -80 درجة مئوية.

1. تكرار لوحات المكتبة Metagenomic

1. تذويب لوحات تحتوي المكتبة على 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا ، أو حتى يتم إذابة جميع الآبار.
2. استخدام ميزة ضوء الأشعة فوق البنفسجية في تعقيم لتعقيم qPix2 الروبوت لمدة 15 دقيقة.
3. تحضير مرق LB مع الكلورامفينيكول بتركيز نهائي 12.5ug/mL وأرابينوز في 100ug/mL في زجاجة الكاشف 500mL. وسوف تستخدم كل لوحة 20mL تقريبا ، بالإضافة إلى إجراء 50mL إضافية للسماح لحجم القتلى.
4. إعداد qFill3 وتعليمات الشركة الصانعة في زجاجة مع وسائل الاعلام التابعة لمشعب عبر أنابيب معقمة. البرنامج الذي لكمية مناسبة من وسائل الإعلام ، وتعيين لملء حجم 45uL في كل بئر.
5. تطهير الهواء من الأنابيب المتعددة وباستخدام ميزة تطهير الروبوت حتى وسائل الاعلام المرئية والقادمة من كل طرف من الجوانب.
6. ملء العدد المرغوب فيه من لوحات مع وسائل الاعلام LB باستخدام qFill3. كل لوحة يستغرق نحو 20 ثانية لملء الفراغ.
7. تحميل لوحات لوحات ومكتبة جديدة في المناطق المناسبة للروبوت qPix2. ملء حمامات التنظيف مع الكواشف المناسبة ؛ 2 ٪ Micro90 في الحمام الخلفي ، وتعقيمها الماء المقطر في الحمام المتوسطة ، و 80 ٪ من الإيثانول في الحمام الجبهة.
8. استخدام "تكرار" برنامج qPix2. في البرنامج ، حدد المناسبة الرأس ، وعدد وأنواع لوحات لوحات المصدر والوجهة. كذلك وضعت على رأس لتنظيف بين replications ، وعادة 6 دورات في كل الحمام بما فيه الكفاية. قدرة الجهاز هو 10 لوحات في كل مرة ، ويستغرق حوالي 15 دقيقة لتكرار كل منهم برأس دبوس 384 (أو ما يقرب من 50 دقيقة مع رئيس دبوس 96).
   ملاحظة : لا يوجد خيار "تحريك المصدر" أو "تحريك الوجهة". فمن المستحسن عدم استخدام هذه الخيارات والمشاكل التي حدثت في السابق مع الروبوت لدينا استخدامها.
9. مرة واحدة يتم نسخ لوحات ، وتنمو على لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في مربع الرطوبة. لأننا الأمر الذي أدى إلى ارتفاع في عدد النسخ fosmid مع اضافة أرابينوز ، واستنساخ تميل إلى النمو أبطأ من التي يسببها عدم استنساخ. عودة لوحات المكتبة ل-80 درجة مئوية.
   ملاحظة : الحضانة في مربع يضمن تبخر الرطوبة وسائل الاعلام لا تحدث في الآبار على حافة الصفائح ، والحفاظ على بيئة موحدة لجميع الآبار.
10. تنظيف qFill3 الروبوت من خلال تطهير المياه لأول مرة مع (~ 50mL) ثم 80 ٪ من الإيثانول (~ 50mL). تفكيك المكونات ، وتنظيف وتعقيم الزجاجة ، الغطاء ، وأنابيب مغلفة بورق الألمنيوم.

2. قياس نمو E. القولونية المستنسخون

1. إزالة لوحات من 37 درجة مئوية الحاضنة. وإزالة جانبا الأغطية وألواح مكان على منصة التحميل مجلة المتوفرة مع RapidStak ، بحد أقصى قدره 25 لوحات.
   ملاحظة : لوحة في اسفل كومة من سيكون أول واحد يجب أن تقرأ. تأكد من أن تتبع من أجل من لوحات ، والبرنامج لا يسجل هذا.
2. إزالة مجلة واحدة من Stak السريع ، تأكد من أنه فارغ ، ودفعها إلى المكدس لوحات يجب أن تقرأ. الاستيلاء عليها من قبل التعامل معها ، ويجب على جميع لوحات يتم تحميلها في المجلة. تحميل المجلة في RapidStak.
   ملاحظة : مجلة لديه برغي صغير في الزاوية التي تشير الزاوية الآبار A1 من لوحات يجب أن تذهب. والمجلة الوحيدة في جبل RapidStak في اتجاه واحد.
3. فتح البرنامج RE SkanIt على الكمبيوتر متصلا الآلات. حدد "الدورة الجديدة" وتسميته بشكل مناسب. اختر "طابق سفلي كورنينج 384 جيدا لوحة" كنوع لوحة.
4. في مجال "تخطيط لوحة" ، حدد "معالج" الزر ، واختر إضافة إلى 384 لوحة المجهولة لديك.
5. في المنطقة "البروتوكول" ، حدد "حسنا حلقة" الخيار ، والدخول في 384 بئرا. وسوف "حسنا حلقة" أيقونة تظهر في شجرة التدفق على الجانب الأيسر من الشاشة. حدد رمز وانقر لإضافة "قياس مضوائية". تعيين إلى قراءة في ل 600Nm.
6. حفظ البروتوكول الخاص مع اسم فريد ، وأغلق البرنامج RE SkanIt.
7. على الكمبيوتر ، افتح برنامج PolaraRS.
8. على الصفحة الرئيسية وسوف يكون هناك جدول إدراج الصكوك متصلا الجهاز RapidStak. ينبغي أن يكون VarioSkan على الجانب الأيسر من هذا الجدول. تحت عنوان VarioSkan ، سيكون هناك اثنين من وصلات "؛ RunSession" و "احتضان". انقر على "RunSession" الخيار.
9. ستظهر نافذة جديدة ، في إطار الفحص ، تظهر مع مخطط انسيابي في الوسط. حدد "RunSession" البند (يجب أن يكون البند الوحيد الحاضر). على الجانب الأيمن من الشاشة القائمة المنسدلةوسوف تظهر. العثور على اسم RE الخاص SkanIt حفظ تشغيلها في هذه القائمة.
   ملاحظة : يبدو أن هناك أي ترتيب منطقي لهذه القائمة. انها ليست الأبجدي ، أو تاريخ الاضافة ، أو تتصل على الكمبيوتر حيث يتم حفظها على البروتوكول. هذا يعني أنك يجب أن ننظر من خلال البروتوكولات الجميع أمام الحقائق الخاصة بك ، والذي هو الألم.
10. انقر مرة واحدة قمت بتحديد البروتوكول الخاص بك ، في الزاوية اليمنى العليا "تشغيل هذا الاختبار".
11. سوف يظهر مربع يطفو على السطح ، يطلب منك للدلالة التي مجلة لاستخدامها كمصدر ، والتي مجلة فارغ. انخفاض مربع على الشاشة يناظر مجلة الجبهة. [اختياري : ويطلب منك إدخال عدد من لوحات حملت لتحديد تقدير لكمية الوقت الذي ستستغرقه. هذا التقدير هو عادة بعيدا.]
12. ضمان رفض كل من وRapidStak VarioSkan المعنية ، ثم اضغط على "موافق".
13. سيتم تلقائيا تحميل RapidStak لوحات الخاص في قارئ لوحة ، والسماح لقياسات مستمرة لوحات. لقراءة لوحات تأخذ ما يقرب من 25 50 دقيقة.
    ملاحظة : من المستحسن لمراقبة التحميل طبق لأول مرة في VarioSkan لضمان التوافق السليم للآلات. إذا لم يتم تحميل RapidStak القارئ وحة صحيح ، واستخدام "وقفة هذا الاختبار" الموجود في الزاوية العليا اليمنى من نافذة PolaraRS.
14. وبمجرد الانتهاء من قراءة كل VarioSkan لوحات ، وإزالة مجلة الكامل ووضعه على منصة التحميل مجلة. ارفع المستطيل الخارجي للمنصة ، ومجلة ينبغي إيقاف الشريحة ، وترك لوحات واقفا في كومة في الوسط. استبدال لوحات لالأغطية المناسبة.

3. إضافة إلى كل ميكس الفحص بلايت

1. إعداد مقايسة باستخدام مزيج الأسهم 10X ج ابحث مزيج من تحلل (10 ٪ تريتون X - 100 ، RIS 100mM ، 10MM EDTA) في 50mM العازلة اسيتات البوتاسيوم عند pH 5.5. إعداد المخزون تصل إلى الركيزة DNP - cellobioside 75mg/mL في DMSO ، والتأكد من يذوب تماما الركيزة. إضافة DNP - cellobioside حل لخلط الأوراق المالية مقايسة إلى التركيز النهائي لل0.1mg/mL. وسوف تستخدم كل لوحة 20mL ما يقرب من الحل ، بالإضافة إلى إجراء 50mL إضافية للسماح لحجم القتلى.
   ملاحظة : DNP - Cellobioside لا يذوب بسهولة في الماء ، وذلك في حل DMSO يزيد من الذوبان. وجود DMSO في الحل النهائي مقايسة ليس له أي آثار يمكن ملاحظتها.
2. إعداد qFill3 وتعليمات الشركة الصانعة في زجاجة مع وسائل الاعلام التابعة لمشعب عبر أنابيب معقمة. البرنامج الذي لكمية مناسبة من وسائل الإعلام ، وتعيين لملء حجم 45uL في كل بئر.
3. تطهير الهواء من الأنابيب المتعددة وباستخدام ميزة تطهير الروبوت حتى وسائل الاعلام المرئية والقادمة من كل طرف من الجوانب.
4. إضافة إلى مزيج مقايسة كل لوحة باستخدام qFill3. كل لوحة يستغرق نحو 20 ثانية لملء الفراغ.
5. مرة واحدة يضاف مزيج مقايسة ، احتضان لوحات في 37 في مربع الرطوبة 12-16 درجة مئوية لساعات.
   ملاحظة : يتم إضافة أكثر من الحضانة في لوحات أخرى على مزيج مقايسة سوف يسبب تبخر في الآبار الخارجي للوحة ، مما أسفر عن ارتفاع قراءات الامتصاصية من ينظر لآبار في الداخل. ويمكن تعويض ذلك من خلال احتضان لوحات في غرفة الرطوبة.

4. القراءة من امتصاص المستنسخون اختبر

1. إزالة لوحات من 37 درجة مئوية الحاضنة. وإزالة جانبا الأغطية وألواح مكان على منصة التحميل مجلة المتوفرة مع RapidStak ، بحد أقصى قدره 25 لوحات.
   ملاحظة : لوحة في اسفل كومة من سيكون أول واحد يجب أن تقرأ. تأكد من أن تتبع من أجل من لوحات ، والبرنامج لا يسجل هذا.
2. إزالة مجلة واحدة من Stak السريع ، تأكد من أنه فارغ ، ودفعها إلى المكدس لوحات يجب أن تقرأ. الاستيلاء عليها من قبل التعامل معها ، ويجب على جميع لوحات يتم تحميلها في المجلة. تحميل المجلة في RapidStak.
   ملاحظة : مجلة لديه برغي صغير في الزاوية التي تشير الزاوية الآبار A1 من لوحات يجب أن تذهب. والمجلة الوحيدة في جبل RapidStak في اتجاه واحد.
3. فتح البرنامج RE SkanIt على الكمبيوتر متصلا الآلات. حدد "الدورة الجديدة" وتسميته بشكل مناسب. اختر "طابق سفلي كورنينج 384 جيدا لوحة" كنوع لوحة.
4. في مجال "تخطيط لوحة" ، حدد "معالج" الزر ، واختر إضافة إلى 384 لوحة المجهولة لديك.
5. في المنطقة "البروتوكول" ، حدد "حسنا حلقة" الخيار ، والدخول في 384 بئرا. وسوف "حسنا حلقة" أيقونة تظهر في شجرة التدفق على الجانب الأيسر من الشاشة. حدد رمز وانقر لإضافة "قياس مضوائية". تعيين إلى قراءة في 400nm.
6. حفظ البروتوكول الخاص مع اسم فريد ، وأغلق البرنامج RE SkanIt.
7. على الكمبيوتر ، افتح برنامج PolaraRS.
8. على الصفحة الرئيسية وسوف يكون هناك جدول إدراج الصكوك متصلا الجهاز RapidStak. ينبغي أن يكون VarioSkan على الجانب الأيسر من هذا الجدول. تحت عنوان VarioSkan ، سيكون هناك اثنين من وصلات "؛ RunSession" وIncubat "ه ". انقر على" RunSession "الخيار.
9. ستظهر نافذة جديدة ، في إطار الفحص ، تظهر مع مخطط انسيابي في الوسط. حدد "RunSession" البند (يجب أن يكون البند الوحيد الحاضر). على الجانب الأيمن من الشاشة والقائمة المنسدلة تظهر. العثور على اسم RE الخاص SkanIt حفظ تشغيلها في هذه القائمة.
10. انقر مرة واحدة قمت بتحديد البروتوكول الخاص بك ، في الزاوية اليمنى العليا "تشغيل هذا الاختبار".
11. سوف يظهر مربع يطفو على السطح ، يطلب منك للدلالة التي مجلة لاستخدامها كمصدر ، والتي مجلة فارغ. انخفاض مربع على الشاشة يناظر مجلة الجبهة. [اختياري : ويطلب منك إدخال عدد من لوحات حملت لتحديد تقدير لكمية الوقت الذي ستستغرقه. هذا التقدير هو عادة بعيدا.]
12. ضمان رفض كل من وRapidStak VarioSkan المعنية ، ثم اضغط على "موافق"
13. سيتم تلقائيا تحميل RapidStak لوحات الخاص في قارئ لوحة ، والسماح لقياسات مستمرة لوحات.
    ملاحظة : من المستحسن لمراقبة التحميل طبق لأول مرة في VarioSkan لضمان التوافق السليم للآلات. إذا لم يتم تحميل RapidStak القارئ وحة صحيح ، واستخدام "وقفة هذا الاختبار" الموجود في الزاوية العليا اليمنى من نافذة PolaraRS.
14. وبمجرد الانتهاء من قراءة كل VarioSkan لوحات ، وإزالة مجلة الكامل ووضعه على منصة التحميل مجلة. ارفع المستطيل الخارجي للمنصة ، ومجلة ينبغي إيقاف الشريحة ، وترك لوحات واقفا في كومة في الوسط. يمكن التخلص من لوحات وفقا لإجراءات المختبر الخاص بك.
15. لتصدير قراءات الامتصاصية ، RE SkanIt البرمجيات مفتوحة ، واختيار "فتح ملف موجود".
16. حدد الدليل حيث قمت بحفظ جلسة العمل الخاصة بك ، وضرب "+" رمز لتوسيع القائمة وتحت عنوان البند سيتم خيارات المسمى "حاوية 1" إلى "N الحاويات" اعتمادا على عدد من لوحات. حدد لوحة أول من تحليلها.
17. في شريط القائمة في الجزء العلوي من الصفحة ، حدد "معالجة البيانات> تقرير / التصدير"
18. اختر الخيارات المطلوبة للتصدير.
    ملاحظة : أنا عادة حدد "تخطيط لوحة" و "مضوائية" بيانات للتصدير.
19. انقر على زر "عرض التقرير" ثم "ملف> حفظ". اختر الدليل المطلوب. تنسيق الإخراج هو جدول بيانات Microsoft Excel

5. ممثل النتائج

ويرد مثال على قراءات الامتصاصية من 384 لوحة واحدة بشكل جيد يحتوي على استنساخ إيجابية في الشكل 2. استنساخ الإيجابية تظهر ارتفاعا ملحوظا في أكثر من أولئك الذين لا الامتصاصية معربا عن النشاط سلولاز. يمكن أن الاختلافات في وقت الفحص ، والموقع بشكل جيد على لوحة ، أو تركيز DNP (قد تكون أدخلت من خلال تصفية الامم المتحدة بحل DNP) تؤثر على قراءات الامتصاصية مطلقة. قراءات الامتصاصية النسبي ، مثل الفرق في الامتصاصية فوق متوسط ​​أو متوسط ​​لوحة العمود ، هي وسيلة قوية لتحديد أكثر إيجابية سلولاز الحيوانات المستنسخة.

بعد التعرف على الحيوانات المستنسخة ايجابية من لوحات المكتبة ، فمن المستحسن لتكرار كل الحيوانات المستنسخة الإيجابية في لوحة جديدة لفحص ثانوي. هذا يزيل آثار الناشئة عن اختلاف موقع البئر أو لوحة ، ويسمح للمقارنة مباشرة بين الحيوانات المستنسخة أكثر إيجابية.

الشكل 1. الرسم البياني للمقايسة الإنتاجية العالية لمكتبة metagenomic المستنسخة في E. القولونية وتخزينها في -80 درجة مئوية.

الشكل 2. امتصاص قراءات من 384 لوحة كذلك يحتوي على استنساخ إيجابية. يمكن التعرف على الحيوانات المستنسخة إيجابية سلولاز الامتصاصية التي زادت بشكل كبير خلال استنساخ سلبية.

Discussion

شاشة إنتاجية عالية للكشف السريع للنشاط cellulolytic من الجينوم إدراج مكتبة كبيرة metagenomic الحمض النووي التي أعرب عنها في E. يوصف القولونية في هذا البروتوكول. هذا الأسلوب هو تحسنا خلال مقايسة الأحمر CMC / الكونغو استخداما في الأدبيات. هو حل قائم ، ويسمح لأحد وعاء الفحص ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
qPix2	Genetix		With 384-pin gridding head
qFill3	Genetix		With 384-well manifold
Varioskan	Thermo Fisher Scientific, Inc.
RapidStak	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Connected to Varioskan
Micro90 Detergent	Cole-Parmer	18100-00	Diluted to 2% in water
Ethanol	Major Lab Supplier		Diluted to 80% in water
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	12.5mg/mL in ethanol
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-2	25g/L, autoclaved
384-well flat bottom plates	Corning	3680
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	100mg/mL in water
Potassium Acetate	Fisher Scientific	P171	50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253	In TE buffer solution, 100mM
EDTA disodium salt	Sigma-Aldrich	E5134	In TE buffer solution, 10mM
2,4-dinitrophenyl cellobioside			Provided by Dr. Steve Withers, UBC
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418