A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
وقد ثبت RNA التدخل الفعال للغاية لتحليل الجينات في وظيفة ذبابة الفاكهة التنمية القصبة الهوائية. ويوضح بروتوكول مفصلة المستخدمة من قبل مختبر جيانج لحقن الرنا المزدوج الجديلة في الأجنة يطير إلى التعبير الجيني ضربة قاضية. هذا الأسلوب لديه القدرة على فحص الجينات اللازمة للتنمية الأنسجة والأعضاء في ذبابة الفاكهة.
الفحص الجيني هي واحدة من أقوى الوسائل المتاحة لاكتساب نظرة ثاقبة عملية بيولوجية معقدة 1. على مر السنين وأصبحت العديد من التحسينات وأدوات للتلاعب الجيني المتاحة في ذبابة الفاكهة 2. بعد وقت قصير من الاكتشاف الأولي Frie وميلو 3 التي يمكن استخدامها RNA المزدوج تقطعت بهم السبل لضربة قاضية في نشاط الجينات الفردية في ايليجانس انواع معينة ، وقد تبين تدخل الحمض النووي الريبي (رني) لتوفير منهج قوي الجينية العكسية لتحليل وظائف الجينات في تطوير الجهاز ذبابة الفاكهة 4 ، 5.
وتتكون العديد من الأجهزة ، بما في ذلك الرئة والكلى والكبد والأوعية الدموية ، أنبوبي من شبكات متفرعة أن السوائل أو الغازات الحيوية النقل 6 ، 7. تحليل تشكيل ذبابة الفاكهة القصبة الهوائية يوفر نظام نموذجا ممتازا لدراسة التشكل الأجهزة الأخرى 8 أنبوبي. كشفت ذبابة الفاكهة بيركلي مشروع الجينوم مئات الجينات التي يتم التعبير عنها في النظام القصبة الهوائية. لدراسة الآلية الجزيئية والخلوية تشكيل الأنبوب ، فإن التحدي يكمن في فهم دور هذه الجينات في عملية التنمية القصبة الهوائية. هنا ، نحن وصف مفصل لطريقة حقن الرنا المزدوج الجديلة في جنين ذبابة الفاكهة في التعبير ضربة قاضية الجينات الفردية. نحن أفلحت أسفل الذاتية dysfusion التعبير الجيني (dys) الرنا المزدوج الجديلة عن طريق الحقن. Dys هو بروتين bHLH لتقييم الأداء وأعرب في خلايا الانصهار القصبة الهوائية ، وكان مطلوبا للاندماج فرع القصبة الهوائية 9 و 10. dys - رني القضاء عليها كليا التعبير dys وأسفرت عيب الانصهار القصبة الهوائية. هذه طريقة بسيطة نسبيا يوفر أداة لتحديد الجينات لrequried tissure وتطوير الجهاز في ذبابة الفاكهة.
1. كوكتيل الجنين
2. سحب الإبرة
جعل الإبر microinjection عن طريق سحب أنابيب زجاجية الشعرية. نستخدم مجتذب إبرة دقيقة من الصك الدولي (النموذجي PUL - 1). مواصفات البرنامج إبرة مجتذب هي : الحرارة : 1 ، 4 تأخير.
3. ملء إبر
العودة الحمل باستخدام الإبر P20 إيبندورف ماصة مزودة نصائح Microloader إيبندورف ، تحميل عادة 1،5-2 الرنا المزدوج الجديلة ميكرولتر
4. كسر إبر
5. حقن
6. تحليل المظهري
7. ممثل النتائج :
مثالا على الرنا المزدوج الجديلة نهدم dysfusion (dys) الجينات في الأجنة Drosophlia هو مبين في Fig1. GFP - الأجنة حقن الرنا المزدوج الجديلة هي السيطرة السلبية. Dys هو عامل النسخ PAS bHLH التي أعرب عنها في خلايا الانصهار القصبة الهوائية. GFP - حقن الرنا المزدوج الجديلة الأجنة تظهر الانصهار القصبة الهوائية العادية ، وDys بروتين موجود في خلايا الانصهار (الشكل 1A). من ناحية أخرى ، dys - الرنا المزدوج الجديلة حقن الاجنة تظهر فشل اندماج فرع ، وDys البروتينات ليست موجودة في خلايا الانصهار (1B الشكل). أظهرت يرقات dys - الرنا المزدوج الجديلة حقن الرنا المزدوج الجديلة عند حقن الأجنة تتطور إلى مرحلة اليرقات ، فشل اندماج فرع (Fig.1D) مقابل السيطرة GFP - الرنا المزدوج الجديلة السلبية حقن (1C الشكل). وأظهرت هذه النتائج فعالة نهدم الذاتية من التعبير الجيني عن طريق الحقن dys الرنا المزدوج الجديلة في أجنة ذبابة الفاكهة
الشكل 1. إزالة الدالة dys بواسطة dys - رني يكشف الرغامى د الانصهارefects. تم حقن الاجنة الأريمة (ث 1118) إما مع GFP - الرنا المزدوج الجديلة (مراقبة سلبية) أو dys الرنا المزدوج الجديلة ويعاير عن العيوب القصبة الهوائية. (أ) مرحلة الجنين 16 حقنوا GFP - الرنا المزدوج الجديلة وملطخة α - MAB 2A12 Dys والبقع التي تجويف القصبة الهوائية. أظهرت بشكل بارز هو الجذع الوحشي الذي تنصهر. السهام لخلايا الجذع نقطة الانصهار الأفقي Dys إيجابية. (ب) المرحلة 16 الجنين حقنوا dys - الرنا المزدوج الجديلة وملطخة α - 2A12 Dys وماب. وأظهرت عدم وجود الجنين الانصهار الجذع الجانبية (العلامة النجمية يشير الموقع الطبيعي للانصهار الاطراف الجذع في الأجنة التحكم). ولوحظ وجود خلايا Dys إيجابية ، مشيرا الى ان dys - RNA ألغت فعليا Dys البروتين. تم فحص (C إلى D) الثانية طور مرحلي اليرقات إما مع GFP - الرنا المزدوج الجديلة أو الرنا المزدوج الجديلة dys تلو مشرق الميدان المجهري للعيوب القصبة الهوائية. (ج) يتم الإشارة إلى مواقع الانصهار بواسطة نجمية في GFP - الرنا المزدوج الجديلة اليرقات تحكم حقن. (D) الجذع الوحشي فشلت في الصمامات في يرقات dys - RNA حقن ، (*) يشير إلى الموقع الطبيعي للانصهار الجذع الجانبية.
طريقة حقن الرنا المزدوج الجديلة الحاضر هنا يمكن تحليل حساسة جدا وسريعة وظيفة الجينات في تطوير ذبابة الفاكهة القصبة الهوائية. ومن الممكن أن تطبق هذه الطريقة لتحليل وظيفة الجين على الأنسجة الأخرى ، وتطوير الجهاز.
فإن الكتاب أود أن أشكر ستيفن لطواقم dysfusion الضد ، [كدنا] Dys والذباب 1118 ث.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
Picospritzer III picopump | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved