تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

Summary

كيف محاريب والخلايا الجذعية خلال نموذج التنمية هو السؤال المهم مع الآثار العملية. في ذبابة الفاكهة المبيض ، والخلايا الجذعية الجرثومية الخط والشكل الجسدي مطلبهم خلال نمو اليرقات. هذا الفيديو يوضح كيفية تشريح ، وصمة عار وجبل المناسل الإناث من طور مرحلي third المتأخرة (LL3) ذبابة الفاكهة اليرقات.

Abstract

العديد من الأجهزة تعتمد على الخلايا الجذعية من أجل تنميتها وخلال مرحلة التطور الجنيني للصيانة أو ترميم خلال فترة البلوغ. فهم كيفية تشكل الخلايا الجذعية ، وكيفية تفاعلها مع بيئتها ، من الأهمية بمكان لفهم التنمية ، التوازن والمرض. وقد عمل المبيض من melanogaster ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة نموذجا للتفاعل مؤثر من الخلايا الجذعية الجرثومية خط (GSCs) مع دعم خلاياهم الجسدية (المتخصصة) ^{1 ، 2.} وقد أتاح الموقع معروف من مكانة وGSCs ، ويقترن بالقدرة على معالجة وراثيا لهم والباحثين لتوضيح مجموعة متنوعة من التفاعلات بين الخلايا الجذعية ومطلبهم ^12/03.

على الرغم من ثروة من المعلومات حول آليات مراقبة وصيانة GSC التمايز ، لا يعرف إلا القليل نسبيا حول كيفية GSCs مطلبهم والجسدية خلال نموذج التنمية. حوالي 18 محاريب الجسدية ، والتي تشمل المكونات الخلوية وخلايا شعيرات محطة كاب (الشكل 1) ، وشكل خلال طور مرحلي اليرقات third ^13-17. GSCs تنشأ من خلايا جرثومية بدائية (PGCs). PGCs تتكاثر في مراحل اليرقات في وقت مبكر ، ولكن في أعقاب تشكيل مجموعة فرعية متخصصة ليصبح PGCs GSCs ^{7 ، 16 ، 18 ، 19.} معا ، فإن الخلايا الجسدية وGSCs المتخصصة في جعل وحدة وظيفية التي تنتج البيض طوال فترة حياة الكائن الحي.

أسئلة كثيرة فيما يتعلق بتشكيل وحدة GSC تبقى دون جواب. وأفضل مثل عمليات التنسيق بين الخلايا السليفة للمحاريب والسلائف الخلايا الجذعية ، أو جيل من التباين داخل PGCs عندما تصبح GSCs ، يمكن دراستها في اليرقة. ومع ذلك ، دراسة منهجية للتنمية المبيض اليرقات يمثل تحديا جسديا. الأولى ، هي المبايض اليرقات الصغيرة. حتى في مراحل اليرقات أواخر هم فقط عبر 100μm. بالإضافة إلى ذلك ، المبيضين وشفافة هي جزء لا يتجزأ من الدهون في الجسم الأبيض. نحن هنا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لعزل المبيضين من أواخر يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي third (LL3) ، تليها تلطيخ مع الأضداد الفلورسنت. نحن نقدم بعض الحلول التقنية لمشاكل مثل تحديد المبيضين ، وتلطيخ وغسل الأنسجة التي لا تغرق ، والتأكد من أن الأجسام المضادة تخترق الأنسجة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على مراحل في وقت سابق من اليرقات والخصيتين اليرقات كذلك.

Protocol

1. البيض

1. قبل خمسة أيام من تشريح : السماح الإناث الملقحة لوضع البيض لمدة 2-4 ساعات على المواد الغذائية الطازجة تستكمل مع الخميرة. للحصول على اليرقات متزامنة ومتطورة ، فمن المهم ألا يكون المثقف مكتظة (حوالي 30 بيضة / فيال 25mm). عادة ، يتم استخدام 7-16 الإناث في قارورة ، اعتمادا على مدى نجاحها في إرساء.

2. اختيار اليرقات

1. إعداد طبق زجاج 9 - جيدا تشريح مليئة المتوسطة رينغر (128mM كلوريد الصوديوم ، 2mm وبوكل ، 1.8mM CaCl ₂ ، 4mM MgCl ₂ ، 35.5mM السكروز ، 5mM Hepes الحموضة 6.9).
2. إعداد مصافى الخلية في صفيحة تحتوي على ستة جيدا المتوسطة رينغر ووضعه على الجليد. بدلا من ذلك ، ونحن نستخدم قوالب معدة خصيصا مجهزة بشبكة من النايلون.
3. اختيار توقيت اليرقات من الجدران باستخدام الملقط فيال البيولوجية الدقيقة (ملقط) ووضعها في صحن يحتوي على الجرس لتشريح.
4. نقل اليرقة الإناث إلى بئر نظيفة. فنحن نميز الإناث من الذكور من قبل الغدد التناسلية الخاصة بهم. يتم التعرف عليها بسهولة كما ذكر الخصيتين الاهليليجات واضحة كبيرة مضمنة في الثلث الخلفي من الدهون في الجسم. يمكن التعرف على المبيضين الإناث ، التي تقع في نفس الجزء من الجسم الدهون ، وأصغر من ذلك بكثير ، المجالات ، واضحة وإيابا.

3. تشريح اليرقة

1. عقد اليرقة أسفل الخلفي فقط إلى الدماغ مع ملقط وإزالة الرأس مع الزوج الثاني من الملقط.
2. وضع الجزء المتبقي الخلفي على الجانب الظهري ، والقصبة الهوائية أسفل.
3. عقد اليرقة التي spiracles الخلفي مع زوج واحد من الملقط ودفعها ببطء نحو الداخل في حين أن الزوج الآخر هو انزلاق إهاب خلفي حتى حوالي نصف الدهون في الجسم يخرج اليرقات.
4. اعتقادا راسخا نهاية الخلفي واستخدام الملقط الزوج الأخرى لعقد فضفاضة للبشرة. برفق وببطء سحب بعيدا نهاية الخلفي بحيث إهاب والشريحة المرفقة الأمعاء من خلال هذه الثغرة. في نهاية هذه العملية ، ينبغي أن تكون منفصلة تماما الدهون في الجسم من الأمعاء وإهاب و. قطع الأمعاء من الجزء الأمامي من الدهون في الجسم. لجعل تلوين وتركيب أسهل ، فمن المهم أن الدهون في الجسم ستبقى على حالها.
5. الرطب ماصة المراعي تماما مع رينغر المتوسطة ، ويفضل أن تحتوي على اليرقات من تشريح جيدا. ويساعد هذا معطف ماصة ويمنع الدهون في الجسم من الالتصاق به. استخدم ماصة المراعي لنقل الدهون في الجسم في المتوسط ​​في رينغر الباردة الجليد في مصفاة الخلية.

4. التثبيت ويلطخ

يتم تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة ، باستثناء الحضانة مع الضد الأولى ، في 4 درجات مئوية.

1. احتضان الجسم الدهون في الفورمالديهايد 5 ٪ في المتوسط ​​رينغر. لمدة 20 دقيقة مع الإثارة لطيف.
2. يغسل لمدة 5 دقائق مع PBT 1 ٪ (1 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني). كرر هذه الخطوة لمدة 10 دقائق ، ومرة ​​ثالثة لمدة 45 دقيقة. 1 ٪ تريتون X - 100 هو مطلوب لخرم المبيض اليرقات والسماح لاختراق الأجسام المضادة لها.
3. كتلة مع PBTB 0.3 ٪ (0.3 ٪ تريتون س 100 و 1 ٪ في جيش صرب البوسنة PBS) لمدة 1 ساعة مع الانفعالات طيف
4. احتضان مع الضد المطلوب ^ش 1 المخفف في PBTB 0.3 ٪ خلال الليل في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف. وعادة ما يتم تنفيذ هذه الخطوة في 0.2 مل من الأنابيب على أسطوانات.
5. نقل الدهون في الجسم مرة أخرى إلى مصافى الخلية.
6. تغسل 3 مرات ، 30 دقيقة لكل منهما ، مع PBTB 0.3 ٪ مع الإثارة لطيف.
7. كتلة مع PBTB 0.3 ٪ تستكمل مع 5 ٪ المصل الحمار العادي لمدة 1 ساعة مع الإثارة لطيف.
8. احتضان مع الضد ثانوية المناسبة المخفف (وفقا لمواصفات الشركة المصنعة) في عرقلة الحل (0.3 ٪ PBTB تستكمل مع 5 ٪ المصل حمار عادي في PBT 0.3 ٪) لمدة 2 ساعة مع الإثارة لطيف. إذا كان الضد هو الفلورسنت ، واحتضان في الظلام من هذه النقطة فصاعدا. وعادة ما يتم تنفيذ هذه الخطوة في 0.2 مل من الأنابيب على أسطوانات.
9. تغسل 3 مرات لمدة 30 دقيقة مع كل PBT 0.3 ٪ مع الإثارة لطيف.

5. متزايد

1. نقل الدهون في الجسم لأنبوب إيبندورف نظيفة. جدا بعناية إزالة جميع السوائل بعيدا وتغطية مباشرة مع وسائل الاعلام Vectashield المتزايدة. نستخدم vectashield روتيني لأنه لا تتصلب في حين يجري فصل المبيضين من الدهون في الجسم.
   ويمكن تخزين العينات المتزايدة في وسائل الإعلام في 4 درجة مئوية لمدة تصل الى اسبوع.
2. قطع نهاية طرف ماصة واستخدامه لنقل بدقة الدهون في الجسم مع حجم الحد الأدنى من وسائل الاعلام تركيب (حوالي 30 ميكرولتر عن زلة تغطية 30mm) على شريحة المجهر.
3. استخدام اثنين من حاملي دبوس النيكل مطلي ، وعقد دبابيس قطرها 0.1 مم لتنتشر في الجسم الدهون. توجد في المبيضين الثالث الخلفي من الدهون في الجسم. تتشكل عادة من الدهون في الجسم التي تحيط بهم مثل "زهرة". هذا يساعد على تحديد مكان وجود المبيضين. تشريح خارج "زهور" عن بقية الجسم من الدهون والتخلص من هذا الأخير.
4. surro إزالة الدهون في الجسمunding الغدد التناسلية عن طريق عبور دبابيس two حولها بعناية. مكان الغدة التناسلية معزولة على الشريحة بعيدا عن مخلفات الدهون في الجسم.
5. مع تغطية زلة تغطية وختم بطلاء الأظافر.
6. تصور مباشرة باستخدام المجهر مبائر. ويمكن تخزين العينات في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع.

6. ممثل النتائج

لقد استخدمنا بروتوكول أعلاه لمتابعة إنشاء خلية الأنساب عدة داخل المبيض جسدية ، بما في ذلك GSCs ومطلبهم الجسدية. لهذا الغرض ، ونحن استخدام الاجسام المضادة المحددة وعلامات للتمييز بين أنواع مختلفة من الخلايا التناسلية في البلدان النامية. نعرض هنا مثالا على المبيضين LL3 two ملطخة تركيبات مختلفة من الأجسام المضادة. ويبرز الشكل 1A خيوط الخلايا الطرفية وقبعة (الأخضر) ، والتي تشكل معا الخلايا الجسمية من المحراب. 1B الشكل ، ويبين الخلايا المختلطة (ICS والأرجواني) ، والتي تتصل مباشرة الخلايا الجرثومية (الأزرق).

الشكل 1. LL3 المبيضين. (أ) وحيدة النسيلة 1B1 الأضداد (قرمزي) الخطوط العريضة الخلايا الجسدية والبقع وfusome ، وهي الخلايا داخل عضية PGCs (الأسهم). وأعرب في فخ محسن HH - lacZ (المضادة β - غالاكتوزيداز والأخضر) في الشعيرات الطرفية. ويمكن في قاعدة للخلايا الجسدية خيوط الغطاء (السهام) يمكن ملاحظتها. (ب) 1B1 الأضداد (الخضراء) وهي توضح كل الخلايا الجسدية في المبيض. مكافحة فاسا (الأزرق) تسميات جميع PGCs. PGCs الاتصال مباشرة على الخلايا المختلطة (ICS ، ومكافحة الاتجار المربى والأرجواني). بار (A و B) هي 20 ميكرومتر.

Discussion

هذا الفيديو يوضح عزلة والبروتوكول في الدقائق الاخيرة من تلطيخ المبيضين اليرقات طور مرحلي. لتنفيذ هذا البروتوكول بشكل روتيني وموثوق بها ، ينبغي إيلاء الانتباه إلى النقاط التالية :

1. ليرقات متزامنة ومتطورا بشكل جيد ، ي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	JT Baker
Kcl	Merck & Co., Inc.
CaCl2	Sigma-Aldrich
MgCl2	Merck & Co., Inc.
Sucrose	JT Baker
Hepes	Sigma-Aldrich
PBS	Sigma-Aldrich
Triton X-100	Sigma-Aldrich
Albumin Bovine Fraction V	MP Biomedicals	160069
Dumont biology tweezers 5 dumstar polished	Fine Science Tools	11295-10
Nickel plated pin holder	Fine Science Tools	26018-17
s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long	Fine Science Tools	26002-10
9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep	Corning	7220-85
Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST	Leica Microsystems
6 well plates	Costar	3516
Slides	Menzel-Glaser	798
Cover slips	Corning	2940-223
Mounting media	Vectashield	H-1200
Cell strainer	Falcon BD	FAL352350
1B1 antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank
Anti-Traffic Jam	Laboratory of Dr. Dorothea Godt
Anti-Vasa	Laboratory of Dr. Ruth Lehmann
Anti β-Galactosidase	Cappel
Secondary Antibodies	Jackson ImmunoResearch