توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

Summary

نحن هنا تصف طريقة لتوسيع بكفاءة وتنقية أعداد كبيرة من الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية وتقييم وظائفها.

Abstract

الطبيعية القاتلة (ناغورني كاراباخ) الخلايا تلعب دورا هاما في مراقبة المناعة ضد مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة المعدية والأورام. قيدت توافر محدود من الخلايا القاتلة الطبيعية والقدرة على التوسع في تطوير المختبر المناعي خلايا NK. نحن هنا تصف طريقة لتوسيع بكفاءة كميات هائلة من وظيفية NK فيفو السابقين الخلايا باستخدام الخلايا K562 معربا عن غشاء محدد IL21 ، باعتبارها خلية مستضد تقديم الاصطناعي (aAPC).

وقد استخدمت العلاج بالخلايا NK بالتبني حتى الآن منتج الخلية التي حصلت عليها الدولة المستقرة leukapheresis من المانحين تليها استنفاد الخلايا التائية أو التحديد الإيجابي للخلايا NK. وعادة ما يتم تنشيط المنتج في IL - 2 ثم بين عشية وضحاها وتدار في اليوم التالي ^1. بسبب التردد المنخفض من الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم المحيطي ، وقد تم تسليم عدد قليل نسبيا من الخلايا القاتلة الطبيعية في التجارب السريرية.

وقد عجز لنشر الخلايا القاتلة الطبيعية في المختبر العامل المحدد لتوليد أرقام خلية كافية لنتائج سريرية الأمثل. التوسع في بعض الخلايا القاتلة الطبيعية (5-10 أضعاف على مدى 1-2 أسابيع) ويمكن تحقيقه من خلال وحده IL - 2 جرعة عالية ^2. ويمكن تنشيط خلايا تي ذاتي التوسط NK توسيع الخلية ، ويفترض أيضا من خلال الافراج عن خلوى المحلية ^3. يمكن أن تدعم سدى مع الوسيطة أو الخلايا الاصطناعية تقديم المستضد (aAPCs) دعم التوسع في الخلايا القاتلة الطبيعية سواء من الدم المحيطي ودم الحبل السري ^4. يجري تسويق NKp46 المشتركة وتفعيل CD2 بواسطة الأجسام المضادة المغلفة الخرز للتوسع الخلايا القاتلة الطبيعية (Miltenyi بيوتيك ، صحراء كاليفورنيا) ، مما أدى إلى التوسع في ما يقرب من 100 مرات في 21 يوما.

التجارب السريرية باستخدام aAPC الموسع أو تنشيط خلايا NK جارية ، واحد باستخدام خط خلية اللوكيميا CTV - 1 لرئيس الوزراء وتنشيط خلايا NK ⁵ دون توسع كبير. والمحاكمة الثانية تستخدم LCL - EBV للتوسع الخلية ناغورني كاراباخ ، وتحقيق التوسع يعني 490 مرات في 21 يوما ^6. ثالث يستخدم لaAPC K562 المستندة transduced مع 1BBL - 4 (CD137L) و ⁷ غشاء محدد IL - 15 (MIL - 15) ، والتي حققت توسعا يعني NK 277 مرات في 21 يوما. على الرغم من أن الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام موسع - K562 - 41BBL mIL15 aAPC السامة للخلايا هي غاية في المختبر والمجراة مقارنة مع الخلايا القاتلة الطبيعية unexpanded ، والمشاركة في ADCC ، يقتصر انتشارها الشيخوخة التي نسبت الى تقصير التيلومير ^8. وأفيد في الآونة الأخيرة توسعا 350 ضعفا من الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام K562 ميكا الإعراب ، و 4 و ⁹ - 1BBL IL15.

وصف أسلوبنا في توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية تنتج هنا الانتشار السريع لخلايا NK الشيخوخة دون تحقيق التوسع وسيطة 21000 مرات في 21 يوما.

Protocol

1. عزلة PBMCs من معطف بافي

ويتم الحصول على الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC) بواسطة الطرد المركزي كثافة الطفو على Paque - Ficoll عينات من متبرع سليم معطف الشهباء التي يجنيها leukapheresis.

1. تتم الطرد المركزي Ficoll - Paque كبروتوكول في مصنع مع تعديلات طفيفة.
2. إضافة إلى برنامج تلفزيوني المانحة العادي الدم بين المصارف معطف الشهباء إلى الحجم النهائي من 140 مل (نموذجي حجم معطف الشهباء 40-70 مل).
3. طبقة 35 مل من عينة معطف الشهباء في 15 مل من Ficoll - Paque (4 أنابيب).
4. الطرد المركزي في 400g لمدة 20 دقيقة دون فرامل.
5. استرداد PBMCs من Paque - Ficoll : البلازما واجهة ، لا يتخلص من كرات الدم الحمراء في الجزء السفلي من Paque - Ficoll.
6. غسل PBMCs ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ، الطرد المركزي في كل مرة 400g مدة 10 دقائق.
7. ويمكن استخدام PBMCs مباشرة للتوسع الخلية ناغورني كاراباخ في هذه المرحلة أو الخلايا القاتلة الطبيعية يمكن أن تكون معزولة بسبب RosetteSep (القسم 4)
8. يمكن تجميد PBMCs المتبقية في FBS DMSO تحتوي على 10 ٪ في النيتروجين السائل.
9. نضح في Ficoll وجمع من كرات الدم الحمراء في الخطوة 5 الى اثنين من 50 مل أنبوب الطرد المركزي ، ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (إضافة إلى علامة مل 50) ، في كل مرة ونضح القشط طاف الجزء العلوي من طبقة RBC لإزالة المحببة.
10. يمكن استخدام كرات الدم الحمراء على الفور الحصول على تنقية  RosetteSep من الخلايا القاتلة الطبيعية (يرجى الرجوع إلى القسم 4) أو تخزينها في الحجم على قدم المساواة في حل Alsever في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا (وكرات الدم الحمراء ويمكن تخزين لمدة أقصاها 4 أسابيع).

2. NK الخلية التوسع

ويمكن البدء في التوسع باستخدام خلايا NK PBMCs أو تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية. يمكن أن تختلف كمية PBMCs المستخدمة للتوسع على أساس كمية من الخلايا القاتلة الطبيعية المرجوة في نهاية توسع ثلاثة أسابيع ، تشير النتائج إلى الباب ممثل للحصول على تفاصيل. (راجع ملاحظة 1)

التحفيز 1

اليوم 0

1. لكل PBMCs ⁶ 5x10 إلى توسيعها ، عد وأشرق 10x10 ⁶ K562 Cl9 mIL21 irradiator باستخدام أشعة غاما في 100 غراي.
2. تشعيع آخر ، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وresuspend في الخلية NK توسع وسائل الإعلام (NKEM).
3. البذور 5x10 ⁶ PBMCs مع 10x10 ⁶ المشع mIL21 Cl9 K562 (1:2 نسبة) في 40 مل من NKEM في قارورة T75 وضعه في حاضنة تستقيم عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.

أيام 3 و 5

4. استعادة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 400g لمدة 5 دقائق ونصف من محل وسائل الإعلام مع NKEM الطازجة (IL2 إضافة جديدة لحجم وسائل الإعلام كلها) ، ويستمر الثقافة.

التحفيز 2

يوم 7

1. حساب عدد الخلايا في الثقافة في نهاية أسبوع واحد.
2. جانبا 5x10 ⁵ خلايا للphenotyping بواسطة التدفق الخلوي (راجع ملاحظة 2)
3. لكل الخلايا ⁶ 5x10 أن restimulated ، عد وأشرق 5x10 ⁶ K562 Cl9 mIL21 باستخدام irradiator غاما في 100 غراي.
4. إضافة على عدد متساو من المشع mIL21 Cl9 K562 (نسبة 1:1) وresuspend في NKEM في 2.5x10 ⁵ خلايا الكل / مل (انظر الحاشية 3).
5. خلايا البذور في قوارير T75 (الحد الأقصى 50 مل في القارورة).

أيام 10 و 12

6. حساب عدد الخلايا.
7. تغيير كامل مع وسائل الاعلام NKEM جديدة استنادا إلى أرقام الخلية (انظر الحاشية 3).

اليوم 14

8. في نهاية أسبوعين من التوسع حساب عدد الخلايا في الثقافة.
9. جانبا 5x10 ⁵ خلايا للphenotyping بواسطة التدفق الخلوي (راجع ملاحظة 2)
10. يمكن إذا كان التوسع التي يمكن تنقيته من PBMCs الخلايا القاتلة الطبيعية في هذه المرحلة من التوسع باستخدام بروتوكول تنقية RosetteSep (راجع القسم الرابع). إذا بدأ التوسع المنقى من الخلايا القاتلة الطبيعية المضي قدما لتحفيز 3.
11. بعد تعيين تنقية جانبا 5x10 ⁵ خلايا للphenotyping بواسطة التدفق الخلوي للتحقق من نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية (كما في الخطوة 8).
12. المضي قدما في تحفيز 3 باستخدام كافة الخلايا القاتلة الطبيعية النقية (راجع ملاحظة 4).

التحفيز 3

1. Resuspend الخلايا القاتلة الطبيعية مع المشع mIL21 Cl9 K562 (1:1) في NKEM على أساس أرقام الخلية (انظر الحاشية 3).

أيام 17 و 19

2. حساب عدد الخلايا.
3. تغير وسائل الاعلام مع NKEM جديدة استنادا إلى أرقام الخلية (انظر الحاشية 3).

21 يوما

4. في نهاية ثلاثة اسابيع من التوسع حساب عدد الخلايا في الثقافة.
5. استرداد 1x10 ⁶ خلايا لتحليل التدفق الخلوي للخلايا NK لوحة كاملة phenotyping الأضداد (انظر الجدول 1).
6. تجميد الخلايا في FBS DMSO تحتوي على 10 ٪ في الحد الأقصى لكثافة 5x10 ⁷ الخلايا في قارورة لاستخدامها في المستقبل.

3. NK الفحص الخلوي السمسة

1. أذاب قارورة من الخلايا القاتلة الطبيعية والبذور في NKEM يوم واحد قبل المؤسسة العامةrforming مقايسة السمسة السماح الانتعاش.
2. لكل خلية مقايسة السمسة NK باستخدام خلية هدف واحد الخط ، 6x10 ⁵ الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المستهدفة 3x10 ⁵ مطلوبة (انظر الملاحظة 5).
3. إعداد CAM ، وسائل الإعلام عن طريق تمييع Calcein - AM (البورصة 1 ملغ / مل في DMSO) في NKEM (انظر الملاحظة 6).
4. 10 Resuspend الخلايا المستهدفة ⁶ في 1 مل من وسائل الإعلام CAM (انظر الملاحظة 7).
5. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، مع اهتزاز في بعض الأحيان.
6. Resuspend الخلايا القاتلة الطبيعية في خلايا 1x10 ⁶ / مل وإضافة 200uL التعليق الخلية NK إلى كل من الآبار 3 من قاع U - 96 - جيدا وحة to10 المقابلة : 1 E : نسبة T هو مبين في الشكل 1. (انظر الملاحظة 8)
7. إضافة 100uL من وسائل الإعلام كاملة لجميع الآبار المتبقية باستثناء "الحد الأقصى".
8. إضافة 100uL تريتون من 2 ٪ X - 100 إلى "الحد الأقصى".
9. إجراء التخفيفات التسلسلي للخلايا NK لE 5 اللاحقة : نسب T عن طريق نقل 100uL من الخلايا في كل مرة ، ومزيج جيد. تجاهل 100uL من الآبار الأخير (E : نسبة من 0.3125:1 T).
10. بعد 1 ساعة من تحميل calcein ، وغسل الخلايا المستهدفة في NKEM مرتين ، والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1200 دورة في الدقيقة. (انظر الملاحظة 9)
11. إعادة عد الخلايا المستهدفة وresuspend في الخلايا 1x10 ⁵ / مليلتر.
12. إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا المستهدفة على كل بئر (1x10 / ⁴ أيضا). الطرد المركزي ل1 دقيقة في 100G لبدء الاتصال الخليوي.
13. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ لمدة 4 ساعات.
14. مزيج ثقافة بلطف مع pipetting pipetter 100 ميكرولتر من أجل وقف موحد calcein صدر ، وتدور في أسفل لوحة 100G لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه ونقل 100 ميكرولتر من طاف لوحة جديدة مع الحرص على تجنب الفقاعات. البوب ​​أي الفقاعات التي قد تشكل باستخدام إبرة دقيقة.
15. قراءة لوحة باستخدام قارئ لوحة نيون (الإثارة تصفية 485 نانومتر ، والانبعاثات تصفية 530 نانومتر). من المستحسن قراءة القاع.
16. حساب النسبة المئوية للتحلل محددة وفقا للصيغة [(اختبار اطلاق سراح الإفراج عفوية) / (عن الحد الأقصى ل-- الافراج عن العفوية)] × 100.

4. NK تنقية الخلايا التي RosetteSep

1. تأخذ 100 أضعاف الفائض من كرات الدم الحمراء إلى أن من PBMCs أو خلايا الموسع ، في أنبوب 50 مل (100:1 RBC : PBMC).
2. لو كرات الدم الحمراء الطازجة به مباشرة إلى الخطوة التالية ، أو إذا تم تخزينها في كرات الدم الحمراء في محلول Alsever ثانية ، حساب عدد كرات الدم الحمراء وغسل المناسبة (100 الزائدة أضعاف) كمية كرات الدم الحمراء مع PBS تستكمل مع FBS 2 ٪ ثلاث مرات ، في 1200 دورة في الدقيقة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة كل مرة.
3. تجمع كرات الدم الحمراء مع PBMCs من الخطوة 1.7 أو الخلايا توسعت من 2.10 في خطوة PBS + 2 ٪ FBS إلى الحجم النهائي من 1 مل لكل 5x10 ⁷ من PBMCs أو خلايا الموسعة.
4. إضافة 1μL من RosetteSep  خلية NK الإنسان كوكتيل في إثراء 1x10 ⁶ من PBMCs أو خلايا الموسعة.
5. مزيج جيد ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع طيف خلط كل 5 دقائق.
6. إضافة حجم مساو من برنامج تلفزيوني + 2 ٪ FBS المزيج بلطف وطبقة على رأس Ficoll - Paque.
7. كرر الخطوات من Ficoll - Paque الطرد المركزي لوصف العزلة PBMC (الفرع الأول).
8. عدد الخلايا القاتلة الطبيعية تعافى بعد تنقيتها ويوضع جانبا لphenotpying 5x105 الخلايا التي التدفق الخلوي للخلايا NK النقاء (الخطوة 8).

5. تلاحظ

ملاحظة 1. ويمكن توسيع نطاق الخلايا القاتلة الطبيعية مباشرة من PBMCs ، أو من RosetteSep  الخلايا القاتلة الطبيعية النقية. لقد لاحظنا زيادة كفاءة مماثلة ، ولكن بعض المانحين قد تكون منخفضة للغاية أعداد الخلايا القاتلة الطبيعية الناتجة في تنقية الصعوبة RosetteSep قبل التوسع.

ملاحظة 2. نستخدم بشكل روتيني CD56 - FITC ، PE - CD16 ، وCD3 - PE Cy5 مقابل phenotyping خلال التوسع ، وتعداد الخلايا القاتلة الطبيعية وتلك التي CD3 سلبية وCD16 CD56 أو إيجابية.

ملاحظة 3. عند كل تغيير وسائل الإعلام أو التحفيز ، والخلايا في resuspend 2.5 × 10 مل / ⁵ للحفاظ على أعداد الخلايا PBMC / NK عند أو أقل من 2 مليون دولار في مل في مراحل الذروة من التوسع. وهذا يمنع استنفاد المواد المغذية والمساعدة على تحقيق أقصى قدر من التوسع والبقاء.

ملاحظة 4. معدل التوسع NK من أهم الدول المانحة والتي تعتمد في نهاية التحفيز 1 أو 2 جزء من الخلايا يمكن أن تكون جزءا المجمدة وتوسعت تبعا لحاجة التجريبية. وقد حققنا نجاحا جيدا في مجال استخدام خلايا مجمدة للتوسعات في وقت لاحق.

ملاحظة 5. وبغية إتاحة الفرصة مجال للخطأ ونحن نوصي باستخدام الحد الأدنى من ⁵ خلايا NK 7x10 معلق في 700 من ULS NKEM و4x10 ⁵ - AM Calcein الخلايا المستهدفة ملطخة معلق في 4 مل من NKEM لإعداد مقايسة السمسة. إذا باستخدام ماصة الأقنية لبذر الخلايا المستهدفة كميات أكبر من الخلايا (ما يصل الى ⁵ في 6x10 6 مل) قد يكون مطلوبا على أساس حجم الحوض وسائل الإعلام المستخدمة. كما أوصت أعداد الخلايا القاتلة الطبيعية على وجه التحديد لE : نسب T تظهر في البروتوكول ، لاستخدام البريد العالي : زيادة نسب Tأعداد الخلايا القاتلة الطبيعية لكل مليلتر وفقا لذلك (على سبيل المثال للحصول على 40:1 E : T 4x10 استخدام نسبة ⁶ خلية / مل)

ملاحظة 6. نوصي أداء أولي Calcein - AM تحميل المعايرة للهدف خط خلية من اختياره ، وذلك باستخدام التخفيفات التالية من 1:400 ، 1:500. 1:300 ، 1:200 1:100 والفرق لتحقيق الحد الأقصى الأمثل بين الإفراج وعفوية.

ملاحظة 7. عند استخدام خط خلية ملتصقة هدفا ، وإعداد أول واحد باستخدام نظام التعليق الخلية غير الأنزيمية العازلة تفارق الخلية. إذا كان أداء ADCC ، وإعداد أنبوب مكررة من الخلايا المستهدفة في CAM وسائل الإعلام.

ملاحظة إذا كان أداء ADCC 8 ، إضافة إلى خلايا NK نفس الموافق 3 آبار 10:01 E : T لADCC. تكرار للمانحين آخرين. تكرار للخلايا المستهدفة إضافية.

ملاحظة 9. إذا كان أداء تجربة ADCC ، وبعد 45 دقيقة من تحميل calcein ، إضافة 10ug من الأجسام المضادة المحددة للتحريض ضد ADCC الخلايا المستهدفة. بعد 15 دقيقة ، وغسل الخلايا المستهدفة في المتوسط ​​الشامل مرتين ، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1200 دورة في الدقيقة. Resuspend الخلايا في الخلايا 1x10 ⁵ / مل ، والمضي قدما في الخطوة التالية في البروتوكول.

6. الممثل النتائج

الشكل 2 ، وعندما يتم تنفيذ التوسع وفقا للمخطط الموصوف أعلاه ، وذلك باستخدام 5x106 PBMCs كمادة بداية ، مجموعة نموذجية NK غلة خلية من خلايا 1x10 ⁹ إلى ^{10 10} (تقلب المانحة التابعة). ويوضح الشكل NK توسيع الخلية أضعاف (ن = 19) مقارنة مع الخلايا القاتلة الطبيعية الموجودة في المنتج الأصلي (المتوسط ​​+ / -- الربع).

الشكل 3 ، وتوسعت الخلايا القاتلة الطبيعية تعبير عن مختلف مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية التي هي مماثلة للخلايا NK unexpanded الابتدائي مع وجود استثناءات قليلة (CD11b ، وCD160 CD244).

الشكل 4. PBMCs التعافي من معطف بوفي من أهم الدول المانحة ، ويمكن أن تعتمد على مجموعة من ⁶ إلى 300x10 800x10 ^6. قد تتكون خلايا NK 2 ٪ -- 18 ٪ من PBMCs. لتنقية RosetteSep الخلايا الموسعة ، وإنعاش الخلايا القاتلة الطبيعية النقية في يوم 14 تتراوح بين 40-70 ٪. باتباع بروتوكول الموصى بها من التوسع وتنقية ، يمكن توقع NK نقاء خلية من 99 ٪.

وقد أثبتت الرقم 5. الخلايا القاتلة الطبيعية السمسة الموسع ضد مجموعة من خطوط الخلايا السرطانية بما فيها العصبية ومكافحة غسيل الاموال ، عظمية وسرطان الجلد (ممثل مكافحة غسل الأموال والقتل كما هو مبين في المئة تحلل محددة).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
	الجسم المضاد	حجم لكل اختبار	شركة	فهرس العدد
أنبوب 1	Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC FACS العازلة اجمالى حجم التداول	5 5 5 5 80 100	دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen	555748 555749 557224 340442
أنبوب 2	CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE - Cy5 CD16 اليكسا 647 FACS العازلة اجمالى حجم التداول	5 5 5 5 5 5 70 100	دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen	340410 558407 558563 557991 555341 557710
أنبوب 3	CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE - Cy5 NKG2D APC FACS العازلة اجمالى حجم التداول	5 5 5 5 5 5 70 100	دينار بحريني Pharmingen R & D نظم Miltenyi بيوتيك R & D نظم دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen	340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071
أنبوب 4	CD56 FITC CD11b PE CD3 PE - Cy5 CD27 APC FACS العازلة اجمالى حجم التداول	5 5 5 5 80 100	دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen	340410 555388 555341 558664
أنبوب 5	CD56 FITC CD266 (DNAM - 1) PE CD3 PE - Cy5 CD160 Alexa647 FACS العازلة اجمالى حجم التداول	5 5 5 5 80 100	دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen eBiosciences	340410 559789 555341 51-1609-42
أنبوب 6	CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE - Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS العازلة اجمالى حجم التداول	5 5 5 5 80 100	دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen دينار بحريني Pharmingen eBiosciences	340410 550816 555341 17-1979-42