دراسة دمج الكبار المولد الخلايا العصبية

Summary

تم وصف طريقة لدراسة التكامل بين حديثي الولادة الخلايا الحبيبية المسنن لدى الحيوانات البالغة. هذا الأسلوب يستخدم الارتجاعي هندستها لتسمية المولود الجديد الخلايا العصبية ، تليها التسجيلات الكهربية لتحديد التكامل الوظيفي في الجسم الحي.

Abstract

تكوين الخلايا العصبية في أدمغة الثدييات يحدث الكبار في منطقة البطين الفرعي (SVZ) من البطين الجانبي وفي منطقة الحبيبية الفرعي (SGZ) من التلفيف المسنن لقرن آمون في جميع مراحل الحياة. وأظهرت تقارير سابقة بأن يرتبط تكوين الخلايا العصبية قرن آمون في الدماغ الكبار الذين يعانون من اضطرابات متنوعة ، بما في ذلك ، والصرع والاكتئاب ، والفصام والقلق (1). قد فك رموز عملية طبيعية وشاذة التكامل عصبون البالغين المولودين في تسليط الضوء على مسببات هذه الأمراض وأبلغ تطوير علاجات جديدة.

SGZ تكوين الخلايا العصبية الكبار المرايا التنمية العصبية الجنينية وبعدها ، بما في ذلك مراحل مواصفات مصير ، والهجرة ، والتكامل متشابك ، والنضج. ومع ذلك ، الاندماج الكامل يحدث على مدى فترة طويلة 6 أسابيع. مدخلات متشابك الأولي إلى البالغين المولودين في الخلايا الحبيبية SGZ المسنن (DGCS) هو GABAergic ، تليها مدخلات glutamatergic في 14 يوما (2). العوامل المحددة التي تنظم تشكيل الدائرة من البالغين المولودين في الخلايا العصبية في التلفيف المسنن غير معروف حاليا.

مختبرنا يستخدم النسخ المتماثل التي تعاني من نقص ناقلات فيروسات استنادا إلى فيروس اللوكيميا مولوني الفئران لتوصيل الجينات البروتينات الفلورية والتنظيمية المفترضة لهذه الخلايا المتكاثرة. هذا الأسلوب يوفر الفيروسية خصوصية عالية ودقة لتحليل تاريخ ميلاد الخلية ، والنسب ، مورفولوجيا ، وsynaptogenesis.

تجربة نموذجية غالبا ما توظف اثنين أو ثلاثة من الفيروسات التي تحتوي على تسمية فريدة من نوعها ، التحوير ، ومروج لعناصر وحيدة الخلية تحليل العملية التنموية المنشودة في الجسم الحي. بروتوكول التالية توضح طريقة لتحليل الخلايا العصبية الوظيفية التكامل الوليد به خضراء واحدة (GFP) أو أحمر (dTomato) الارتجاعي بروتين فلوري والتصحيح ، المشبك الكهربية.

Protocol

1. حقن الفيروس

ويتم إنتاج عالية عيار الارتجاعي هندسيا (1 × 10 ⁹ وحدة / مل) من قبل ترنسفكأيشن المشترك للفيروسات وناقلات VSVG HEK293T في الخلايا ، تليها تنبيذ فائق من طاف الفيروسية. عن مصادر وأساليب الإنتاج ، انظر المظاهرة إن الرب الممتازة (3).

ملاحظة : يتم إيواء البالغين الشباب (4-6 أسابيع من العمر) من الإناث C57Bl / 6 الفئران (تشارلز ريفر) في ظل الظروف القياسية. متابعة كافة الإجراءات دليل المجلس القومي للبحوث من أجل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية بموجب البروتوكول التي وافقت عليها جامعة ستوني بروك IACUC.

1. 2ul ذوبان الارتجاعي المجمدة لكل حيوان على الجليد.
2. تخدير (100 + 10 ميكروغرام الكيتامين زيلازين ميكروغرام لكل غرام من وزن الجسم) ، وجبل الحيوان على إطار التجسيمي (Steolting). إزالة الشعر على الرأس ومسح الجلد مع الايثانول 70 ٪.
3. يعرض الجمجمة وحفر أربعة ثقوب الحفر الضحلة باستخدام الأسنان (0.6mm مثقاب) في الإحداثيات التالية :
   • anterioposterior = -2 مم من bregma ؛ الوحشي = ± 1.6 مم ؛ بطني = 2.5 مم ؛ anterioposterior = -3 ملم من bregma ؛ الوحشي = ± 2.6 مم ؛ بطني = 3.2 مم.
   • anterioposterior = -2 مم من bregma ؛ الوحشي = ± 1.6 مم ؛ بطني = 2.5 مم ؛ anterioposterior = -3 ملم من bregma ؛ الوحشي = ± 2.6 مم ؛ بطني = 3.2 مم.
4. شن هاميلتون 1μl ، مسطحة وحقن حقنة غيض 0.5 الارتجاعي ميكرولتر لكل موقع بمعدل 0.25 ميكروليتر / دقيقة في التلفيف المسنن. (راجع أعلاه للحصول على إحداثيات عمق بطني). قفة 2 دقيقة بعد كل حقنة قبل أن تنسحب ببطء حقنة لمنع حويضي السوائل. بين الحقن ، وشطف السطح الخارجي لفترة وجيزة من طرف المحاقن المعقمة مع برنامج تلفزيوني والتطبيقية لإزالة آثار دماء.
5. إغلاق الجرح العقيمة مع مواد خياطة الجروح الجراحية (نوع P - 1 ؛ الحجم 6-0) والعودة إلى ظروف السكن الحيوانية القياسية حتى المراحل الزمنية المطلوبة بعد الحقن.

2. إعداد شريحة

للحصول على نوعية عالية من شرائح الحاد فئران بالغة ، ونحن نستخدم حلا قطع تعديل لإعداد شريحة (أنظر أدناه).

1. قبل البرد حل لقطع 0-4 درجة مئوية على الجليد وفقاعة مع 95 ٪ O ₂ -5 ٪ CO ₂ على الأقل 30 دقيقة.
2. تخدير ويروي transcardially حيوان مع حل الأوكسجين المشبع الجليد الباردة القطع.
3. إزالة بسرعة الدماغ في طبق بتري مع فلتر ورقة قبل المبللة بمحلول الاوكسيجين الباردة ، والقطع. قطع المخيخ وشريحة متزايدة على الأقل السطح الأمامي 1MM إلى إحداثيات الحقن (مرئي). الغراء في المخ في الصعود إلى منصة vibrotome وتركيبها في غرفة مليئة القطع حل القطع الباردة والاوكسيجين.
4. انفجر تحضير شرائح الإكليلية أو الأفقي (300 350μm) ونقل لهم ماصة كبيرة تحمل لاحتضان غرفة تحتوي على درجة حرارة الغرفة ACSF مع 95 ٪ O ₂ / 5 ٪ CO _2.
5. احتضان الشرائح ، محتدما بشكل مستمر ، عند درجة 32 ل30-60 دقيقة. عودة الغرفة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة التسجيل.

3. تجارب كهربية

1. يتم نقلها الى غرفة شرائح تسجيل وهو perfused باستمرار مع ACSF الأوكسجين المشبع في 32 درجة مئوية -- 34 درجة مئوية.
2. يتم وضع التحفيز الكهربائي بين القطبين التنغستن في الطبقة الجزيئية للالتلفيف المسنن باستخدام مجهر التكبير المنخفض الهدف (10X).
3. ويتم تحديد DGCS الوليد في منطقة شبه الحبيبية / الطبقة الحبيبية الخلية عن طريق التعبير عن GFP أو dTomato. يتم تنفيذ كامل الخلية العصبية على تسجيل المواليد الجدد patchclamp تحت التكبير عالية (40X).
4. ويتم الحصول على خصائص الخلايا اطلاق سجلت عن طريق الحقن في سلسلة من التيارات الجارية تحت المشبك واسطة.
5. يتم تسليم المحفزات الكهربائية بواسطة القطب التحفيز عبر المعزل التحفيز التي تسيطر عليها تسجيل البرمجيات ، وأثار التيارات بعد المشبكي في DGCS حديثي الولادة يتم تسجيلها.

4. تحليل البيانات

ويتم تحليل سعة من الردود بعد المشبكي أثار في مراحل تنموية مختلفة من البالغين المولودين في الخلايا العصبية.

5. ممثل النتائج

باستخدام بروتوكول أعلاه ، GFP التعبير في التلفيف المسنن العصبية الوليد مشابهة الشكل رقم 1 هو شائع. لاحظ أن الخلايا العصبية هي تصور حديثي الولادة بسهولة والمسماة بقوة كل من التشعبات والمحاور. التعبير في المحاوير DGC رقيقة وأشواك صغيرة تعتمد على نوعية وعيار من الفيروس ، والمروج المستخدمة وطول التعبير في الجسم الحي. في أيدينا ، وخلايا الوليد والعضيات الخلوية الفرعية وعادة ما تكون وضوحا في غضون بضعة أيام بعد الحقن ، ويمكن تتبع التعبير العمود الفقري منذ المراحل الأولى للتنمية. Wثقب الخلايا العصبية التسجيلات من حديثي الولادة في مراحل زمنية مختلفة تسمح هذه الدراسة فريدة من خصائص الخلية الوليد وامكانات العمل مثلا (الشكل 2A) ، فضلا عن عملية التكامل متشابك في الدوائر العصبية الموجودة خلال نضوج (الشكل 2B).

الشكل 1 2 فوتون صورة مبائر من الخلايا العصبية في قسم الأطفال حديثي الولادة التلفيف المسنن الأفقي للماوس الكبار. الخلايا الخضراء هي 21dpi (أيام آخر الحقن) ، معربا عن GFP DGCS الوليد المسمى مع pUX - GFP الارتجاعي.

الشكل 2 أ) (ب) العمل المحتمل اطلاق خصائص DGC الوليد في 21 نقطة في البوصة). أثار ممثل التيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) التي سجلت على DGC المولود في 21 نقطة في البوصة.

Discussion

تكوين الخلايا العصبية في قرن آمون المستمر للأدمغة الثدييات الكبار ويوفر نظام فريد النموذج التجريبي لدراسة التنمية والتكامل في الخلايا العصبية للدماغ ناضجة. بروتوكول المعروضة هنا يجمع العلامات فيروسات وطرق الكهربية لدراسة التكامل بين الخلايا العصبية الوليد الحبيبية المسنن في أدمغة فئران بالغة.

لضمان تجاربك الناجحة ، فإننا نوصي بما يلي خلال الخطوات الحاسمة من الإجراء :

لتجنب العدوى والالتهابات غير المرغوب فيها ، يجب تعقيم جميع الأدوات (عن طريق التعقيم ، أي نوع من التعقيم ، أو الايثانول 70 ٪) قبل الجراحة. استخدام برنامج تلفزيوني العقيمة لغسل رأس الإبرة حقنة قبل الحقن.

للحقن الفيروس ، يجب أن تكون محمولة على الحيوانات بشكل جيد على الجهاز التجسيمي ويجب التقليل من مصادر حركة لا لزوم لها خلال الحقن. تأكد من أن الرأس هو ثابت وراسخ جيدا ، وضبط موضع أنفه من الماوس لbregma مستوى وامدا قبل حساب إحداثيات الحقن. استخراج الفيروس إلى المحقنة بسرعة للحد من التعرض لدرجة حرارة الغرفة -- الفيروسات القهقرية بشكل خاص حساس للحرارة. حقن الفيروس ببطء بمعدل أوصت للحد من الأضرار الضغط. وأوصى باستخدام حقنة ذات الرؤوس المسطحة (مقابل طرف مشطوف شيوعا) ضمان وجود عدوى موزعة بالتساوي منطقة التلفيف المسنن.

قبل إعداد شرائح ، لا بد من قطع فقاعات الحل ويحتضنها ACSF مع 95 ٪ O CO ₂ -5 ₂ ٪ على الأقل 30 دقيقة للسماح للتشبع الأكسجين إلى الحلول. وينبغي perfused الحيوانات بسرعة والمحافظة على النسيج في البرد حل الأكسجين المشبعة ، للحصول على جودة أفضل شريحة.

للتسجيل ، وزيادة كثافة التحفيز تدريجيا حتى هناك استجابة بعد المشبكي. تغير موقع القطب التحفيز داخل الطبقة الجزيئية للالتلفيف المسنن عند الضرورة.

وباختصار ، فإن النهج الموصى به يوفر وسيلة لاستكشاف خصائص متميزة وأدوار وظيفية ممكنة من البالغين المولودين في الخلايا العصبية في المرحلة الأولى من الاندماج في الدوائر ونشطة ناضجة.

Materials