ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

Summary

هذا البروتوكول يصف كيف يمكن أن تكون على استعداد نسيج المخ جزءا لا يتجزأ من الراتنج والمصورة في الأبعاد الثلاثة في شعاع ايون ركزت والمسح الضوئي المجهر الالكتروني.

Abstract

هذا البروتوكول يصف كيف العينات البيولوجية ، مثل أنسجة المخ ، ولا يمكن تصوير في ثلاثة أبعاد باستخدام المجهر تركز أيون شعاع الالكترون / المسح (FIB / SEM). يتم إصلاح هذه العينات مع الألدهيدات ملطخة المعادن الثقيلة باستخدام رباعي أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل. هم المجففة ثم مع الكحول وتسللت مع الراتنج ، وهو تصلب ذلك الحين. باستخدام مجهر الضوء ومشراح مستدق بالسكاكين الزجاج ، ويتم إجراء كتلة صغيرة تحتوي على مصلحة المنطقة القريبة من السطح. ثم يتم وضع كتلة داخل الاكذوبه / ووزارة شؤون المرأة ، وشعاع ايون المستخدمة في طاحونة ما يقرب من وجه رأسية على طول جانب واحد من الكتلة ، على مقربة من هذه المنطقة. باستخدام الإلكترونات backscattered لصورة الهياكل الأساسية ، ويطحن ثم أصغر وجه مع أدق شعاع ايون وفحص السطح بشكل وثيق لتحديد الدقيق للمنطقة وجها ليمكن تصوير ويطحن. ثم يتم تعيين المعلمات من المجهر بحيث يتم طحنها مرارا وتكرارا على وجهه وتصويرها بحيث يتم جمعها من خلال الصور التسلسلية حجم الكتلة. سوف تحتوي عادة على صورة كومة voxels الخواص ذات أبعاد صغيرة كما نانومتر 4 (أ) في كل اتجاه. هذا جودة الصورة في أي طائرة التصوير تمكن المستخدم لتحليل التركيب الدقيق خلية في أي زاوية المشاهدة داخل كومة الصورة.

Protocol

1. تثبيت العينة وتضمينها الراتنج

1. يتم إصلاح عينات من أنسجة وخلايا جديدة لمدة لا تقل عن 2 ساعة في بارافورمالدهيد 2 ٪ ، وغلوتارالدهيد 2.5 ٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات في درجة حموضة 7.4. يجب أن لا يتجاوز حجم العينة 0،150 ملم في سماكة كافية للسماح للتغلغل أو مثبت ، وينبغي ألا تترك في الإصلاح لمدة أطول من 12 ساعة.
2. وضع العينات في 20ml قنينة زجاجية التلألؤ وشطف لهم ثلاث مرات ، 5 دقائق لكل منهما ، في كاكوديلات 0.1M العازلة.
3. وصمة عار مع 1.5 ٪ (W / V) البوتاسيوم رباعي أكسيد الأوزميوم فيروسيانيد و 1 ٪ (W / V) في 0.1 العازلة كاكوديلات M (0،1 م ، ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 30 دقيقة.
4. وصمة عار مع رباعي أكسيد الأوزميوم 1.0 ٪ (W / V) في المخزن كاكوديلات 0.1M لمدة 30 دقيقة.
5. شطف مرة واحدة مع الماء المقطر المزدوج لمدة 3 دقائق.
6. وصمة عار مع 1 ٪ (W / V) خلات اليورانيل في الماء المقطر المزدوج لمدة 30 دقيقة.
7. شطف المقاطع لمدة 5 دقائق في الماء المقطر المزدوج ، ثم يجفف في سلسلة متدرجة الكحول ، 2 دقائق كل تغيير (1 × 50 ٪ ، 1 ٪ × 70 ، 1 × 90 ٪ ، 1 ٪ × 95 ، 2 × 100 ٪).
8. تضمين في زيادة تركيزات من راتنج Durcupan مختلطة مع الايثانول و 30 دقيقة كل تغيير ، ابتداء من الساعة Durcupan 50 ٪ في الايثانول ، ثم تليها : 70 ٪ ، 90 ٪ ، 95 ٪ ، ثم 100 ٪.
9. استبدال Durcupan الطازجة وتستنهض الهمم ببطء لمدة 4 ساعات.
10. أقسام المركز ، وذلك باستخدام العصي الخشبية الكوكتيل ، المجاهر على الشرائح الزجاجية المطلية مع وكيل العفن فصل ، ووضعه في الفرن 65 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

2. إعداد نموذج لالاكذوبه / SEM

11. فصل طبقة الراتنج ، والتي تحتوي على عينات من بين الشرائح الزجاجية المجهر اثنين وتغسل جيدا لإزالة أي قالب فصل العامل.
12. باستخدام مجهر الضوء المرسل مع أهداف الطاقة المنخفضة ، أو تشريح المجهر مع إنارة المنقولة ، لتحديد المنطقة التي تهم شريحة من داخل الراتنج.
13. قطع صغيرة (3 مم × 3 مم) مربع حول المنطقة ذات الاهتمام باستخدام شفرة حلاقة وهذا العصا إلى أعلى كتلة فارغة مع الراتنج الغراء الاكريليك (الشكل 1). انتظر 5 دقائق للالغراء لتتصلب ، ومن ثم المضي قدما إلى الخطوة التالية.
14. المشبك كتلة إلى صاحب ulramicrotome و، وذلك باستخدام stereomicroscope المرفقة ، وتقليم جميع أنحاء المنطقة في المصالح مع شفرة الحلاقة حتى هرم صغير فقط من البقايا المادية.
15. مزيد من خفض كتلة ، وذلك باستخدام سكين الزجاج الثابتة في مشراح مستدق ، بحيث يمكن أن تكون المنطقة ذات الاهتمام يقع بالتحديد فيما يتعلق بأبعاد سطح بلوك (الشكل 1). قطع حافة واحدة من كتلة ، على مقربة من منطقة الفائدة ، بحيث يتم قطع خطوة عمودي من خلال نموذج (الشكل 1 و 2). هذه الخطوة لمواجهة أشكال التصوير (الشكل 2).
16. إزالة كتلة من مشراح مستدق وتصوير المنطقة المصالح داخل الكتلة ، وذلك باستخدام مجهر الضوء المرسل.
17. خفض كتلة قلصت بعيدا عن كعب راتنج المتبقية. يتم ذلك باستخدام رأى الصائغ ويضمن التي يتم وضعها فقط كتلة صغيرة داخل الاكذوبه / SEM. وينبغي أن الارتفاع الإجمالي لهذه الكتلة لن يكون أكثر من 5 ملم.
18. كتلة الغراء للصق كعب الألومنيوم مع الكربون ضمان أن يكون الجانب المصورة على حافة الأبعد (الشكل 1).
19. بعد الغراء قد جفت ، ومعطف كتلة بطبقة رقيقة من الذهب (> 20 نانومتر ؛ Cressington نظام التبخير فراغ).

3. التصوير في الاكذوبه / SEM

20. في التكبير منخفضة ، واستخدام التصوير الثانوية الإلكترون (5 كيلو فولت ، 0.5 nAmp) ، توجيه كتلة بحيث المنطقة المختارة من الاهتمام والى جانب كتلة ليمكن تصوير يواجه المشغل (الشكل 2 ج ، د).
21. توجيه كتلة بحيث يمكن تصوير لمواجهة الأكاذيب موازية لشعاع الطحن. وهذا يعني أن شعاع الالكترون هو المنحى في 54 ° إلى هذا الوجه (الشكل 2 ب).
22. باستخدام شعاع ايون الحالية 13-27 nAmps في 30 كيلوفولت إزالة شريط ضيق من راتنج من الجبهة في المنطقة ليمكن تصوير.
23. التبديل إلى وضع التصوير backscattered لعرض الوجه المضروب أن يعتلي المنطقة من الفائدة.
24. باستخدام المجهر الضوئي صورة المرجعية (التي اتخذت في الخطوة 16) ، وصورة الوجه المضروب تحديد موقع المنطقة المحدد على أن تكون كتلة والتقط المضروب (الشكل 2).
25. ودائع طبقة واقية (حوالي 1 ميكرون سميكة) من الكربون (أو المعادن) ، وذلك باستخدام نظام حقن الغاز في المجهر ، على سطح الكتلة ، وفوق منطقة الفائدة (الشكل 2).
26. باستخدام تيار من 700 picoAmps ، مطحنة الدقيق في المنطقة من خلال كتلة والتي سوف تؤخذ الصور النهائية.
27. ترك شعاع لطحن مطحنة تماما صورة هذا الوجه حتى لا يمكن رؤية التحف الطحن على وجهه. يتم فحص طاحونة كاملة للوجه من خلال مراقبة التغيرات في كل صورة لاحقة عبر مجمل ميدان العرض. يمكن طحن غير كافية كما شهدت خطوط بيضاء أو "الستائر" الظهور vertically في الصورة.
28. مغادرة المجهر لساعات لا يقل عن 2 عن أي تغيرات حرارية لتبدد. هذا يقلل من المخاطر التي تواجهها كتلة سوف تنجرف أثناء التصوير ، مما أسفر عن الصور المنحرفة.
29. حدد المعلمات مجهر لتصوير الوجه متسلسل. تأكد من أن شعاع الالكترون والجهد الذي يتم منخفضة بما فيه الكفاية لصورة فقط على عمق ضحل جدا من المواد في مواجهة كتلة. ينبغي أن يكون هذا أيضا ضحالة بكثير من سمك وجها لإزالتها. معلمات نموذجي للتصوير هي الفولتية بين 1،2-2،0 كيلوفولت مع أحجام بكسل بين 4-20 نانومتر. بكسل يسكن تحتاج الى وقت لإبقاء حوالي 10 μsecs بحيث يتم الحفاظ على الوقت الإجمالي لطاحونة الوجه والحصول على صورة واحدة أقل من 2 دقيقة (الشكل 3).

4. أسرار النجاح

الخطوة 1) التأكد من العينات ليست أكثر سمكا من 150 ميكرون. وسيمكن هذا الاختراق الكافي لبقع مختلفة والراتنج في هذه المادة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال sectioning العينات مع vibratome مباشرة بعد التثبيت. هذا هو المناسب لسمك أنسجة المخ. الأنسجة الأخرى يجب أن يتم اختبارها لضمان التثبيت الملائم والتلوين.

خطوة يجب 3) أن يكون توزيع عينات بحرية في جميع أنحاء الحل ، وليس تجمعت معا في جزء واحد من قنينة بينما قدم هذا مثبت الثانوية. وهذا ضمان أقصى قدر من الاختراق من العينة والحد من العينة أن تصبح مشوهة خلال هذه العملية التثبيت. ويتحقق ذلك من خلال عينات بلطف يحوم داخل القارورة مباشرة بعد إضافة الحل.

الخطوة 15) التأكد من أن يقع في المنطقة ذات الاهتمام فورا أدناه (<30 ميكرون) على سطح الكتلة. وهذا سوف يقلل من كمية الطحن بواسطة شعاع أيون خلال المرحلة اقتناء الصور.

الخطوة 22) والمسح الضوئي الوقت من شعاع ايون يحتاج إلى adequte لضمان المضروب تماما لمواجهة التصوير بأكمله. سيظهر الطحن واعتبرتها غير كافية الشرائط البيضاء ، أو "الستائر" تظهر عموديا إلى أسفل الوجه والتصوير.

الخطوة 26) ويجب أن يواجه النهائي المضروب تكون أكبر من الوجه الذي هو تصوير. هذا هو لأنه طرد من راتنج المضروب من كتلة وredeposits على سطح كتلة في المنطقة المجاورة مباشرة. يمكن لهذا التعدي على redeposition مجال التصوير للعرض ، وتجنبها من خلال طحن مساحة كبيرة بكثير مما هو تصوير. لنافذة التصوير الذي هو 20 ميكرون واسعة ، وجهه كتلة المضروب هو أكبر من 30 ميكرون واسع.

الخطوة 29) ومن الأهمية بمكان أن المعلمات شعاع الالكترون هي تلك التي يتم إنشاؤها بواسطة صورة الالكترونات التي تخرج من نانومتر القليلة الأولى فقط من سطح بلوك. هذا الأمر acheved عن طريق التقليل من الجهد إلى أقل من 2 كيلو فولت ، وضمان عدم اختراق الإلكترونات بعيدة جدا. هو أيضا ساعد هذا الجهد باستخدام الشبكة على كاشف بحيث لا الإلكترون وفقا لأعلى الطاقات المساهمة في الصورة النهائية. عادة ، يتم استخدام شبكة من التوتر 1.3 ك للحصول على الجهد التصوير من 1.5 كيلو فولت.

5. ممثل النتائج :

الشكل 1. إعداد كتلة الراتنج. راتنج) جزءا لا يتجزأ من الباب الاكليلية (80 ميكرون سميكة) دماغ الفئران من خلال عرضها في البالغين steromicroscope. في الصورة تظهر بوضوح مناطق الدماغ المختلفة التي يمكن أن تقطع من المقطع (ب) باستخدام شفرة المشرط. هنا ، هو إزالة مربعة طول ضلعها 1 من القشرة و (ج) تمسك كتلة راتنج فارغة. د) ثم قلص كتلة راتنج بسكين الزجاج التي شنت في مشراح مستدق ، ومرة واحدة تم تخفيض كتلة بمغادرة فقط منطقة الفائدة (ه) ، هو قطع خطوة عمودي على السطح الأمامي من المواد المضمنة. و) ثم قص هذه المنطقة بأكملها قلصت من بقية الاجزاء والتي شنت في الصعود إلى كعب الألومنيوم جاهزة للطلاء المعادن والتصوير في المسح المجهر الالكتروني.

الشكل 2. الاستعداد لمواجهة كتلة الاكذوبه / SEM التصوير. أ) و ب) من الرسوم التوضيحية تظهر كتلة والحافة التي يتم طحنها لخلق مواجهة التصوير (المشار إليها مع سهم مزدوج الرأس السوداء). ويظهر موقف شعاع ايون (أبيض) موازية لمواجهة التصوير ، ويظهر شعاع الالكترون (الرمادي) ضرب الوجه في 54 ° إلى شعاع ايون ج) يبين وجهة نظر الكتلة التي اتخذت مع شعاع الالكترون والتقط مع الإلكترونات الثانوية. على هذا الجانب من كتلة قتامة المنطقة (المشار إليها مع مربع أبيض منقط) يظهر جزء من الوجه الذي تم المضروب تقريبا (كما هو موضح مع المزدوج الرأسالطبعة الأسود السهم) للكشف عن نموذج المصدر. د) عندما يتم تصوير هذه المنطقة فقط باستخدام الإلكترونات backscattered يمكن رؤية الأنسجة المضمنة. هنا ، يشار إلى العرض الكامل للقسم الأنسجة المضمنة مع سهم مزدوج أبيض الرأس. الحجم في شريط ج) هو 100 ميكرون.

الشكل 3. عكس التصوير وبلغ حجم أنسجة المخ مع voxels الخواص. أ) صورة backscattered النقيض من الوجه كتلة يبين الترآيب الدقيق داخل المنطقة من الدماغ الفئران. كل الأغشية مرئية فضلا عن الهياكل الجزيئات الكبيرة. ب) تم جمع ما مجموعه 1600 صور في 5 نانومتر تباعد مما أدى إلى كومة صورة مع voxels آيزوتروبي ج) ولا يمكن تصوير هذا المكدس في أي طائرة مع القرار نفسه. هذه الصورة تظهر اتصال متشابك واحد هو تصوير في الطائرة س ص والطائرة YZ.

Discussion

تقنية الاكذوبه / SEM يعمل بشكل مثالي عندما تهم المنطقة ليست كبيرة جدا. الحد الأعلى لحجم تصوير يعتمد على شعاع ايون والمنطقة التي يمكن أن طاحونة باستمرار مرارا على مدى ساعات عديدة. حتى الآن وقد تم ذلك مع المناطق حوالي 60 ميكرون 60 × ، ولكن ، والتصوير هذه المنطقة بأكملها هو غير ممكن مع قرار صورة مناسبة ، ويرجع ذلك أساسا إلى عامل الوقت في جمع مثل هذه الصور الكبيرة. كمثال ، صورة KX 4 4 ك بكسل يسكن مع الوقت إلى 10 ميكرو سوف تتخذ 2 دقائق و 40 ثانية للحصول على وعن مجال الرؤية من 60 ميكرون هذا من شأنه أن يعطي سوى 15 من حجم بكسل نانومتر. لتصوير التركيب الدقيق للخلايا والأنسجة ، وحجم أصغر بكسل هو أكثر ملاءمة ، وعادة ما بين 4 و 10 نانومتر / بكسل. سيكون لمساحة 60 × 60 ميكرون يمكن الحصول على صورة في 10 ساعة ، حتى لو كان هذا المجهر القدرة. لهذه الأسباب ، المجهر هو أداة مثالية لمجلدات الصور في ترتيب 10 × 10 × 10 ميكرون ، أو مناطق كبيرة من الخلايا بأكمله. ويمكن بسهولة أن يتم ذلك في غضون فترة 48 ساعة على العينات التي يتم جيدا يتناقض مع هذا الإجراء.

حتى الآن تم استخدام بروتوكول بشكل رئيسي مع أنسجة المخ ، وكذلك أنواع مختلفة من خلايا الثدييات مثقف التمسك coverslips. ومع ذلك ، يمكن استخدام الإجراء التثبيت وتلطيخ مع العديد من أنواع أخرى من المواد البيولوجية ، بما فيها المواد النباتية لإنتاج مداخن بالتساوي صورة جيدة مقارنة.

لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو قدرتها على حجم الصور مع voxels الخواص. مداخن صورة من هذا النوع يسمح لتحليل حجم 3D باستخدام الصور الملتقطة في أي طائرة في المكدس. الاستفادة من هذا هو السماح للمراقب إلى ميزات صورة في صورة سلسلة من أي اتجاه ، وتوفير قدر أكبر من التفصيل صورة (الشكل 3).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	فهرس العدد
Cyanoacrylate الغراء
تشريح المجهر : ايكا MZ8	لايكا مايكروسيستمز ، وألمانيا
Durcupan الراتنج	سيغما الدريخ كيمي شركة محدودة ، سويسرا
FIB / SEM المجهر (زايس ، NVision 40)
الأنسجة الشرائح الزجاجية	منزل جلاسر ، وألمانيا	AA00008032E
الزجاج صانع سكين : ايكا EM KMR2	لايكا مايكروسيستمز ، وألمانيا
قوارير الزجاج التلألؤ (20ml)	EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية	72634
غلوتارالدهيد	EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية	16222
ورأى الصائغ	EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية	72010
فصل عامل قوالب	Glorex ، سويسرا	62407445
رباعي أكسيد الأوزميوم	EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية	19110
بارافورمالدهيد	EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية	RT 19208
أملاح الفوسفات عازلة للفوسفات	سيغما الدريخ كيمي شركة محدودة ، سويسرا	71642 و71496
الصوديوم كاكوديلات	سيغما الدريخ كيمي شركة محدودة ، سويسرا	20840
بصق المغطي مع الهدف الذهب	Cressington ، الولايات المتحدة الأمريكية
قاعدة تريس (TBS)	سيغما الدريخ كيمي شركة محدودة ، سويسرا	T1378
مشراح مستدق : ايكا UCT	لايكا مايكروسيستمز ، وألمانيا
اليورانيل خلات	EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية	RT 22451