مما يدل على استخدامات مطياف الرواية قوة الجاذبية على التمدد وقياس البروتينات الليفية

Summary

هذا هو خطوة خطوة دليل يبين الغرض ، والعملية ، والنتائج ممثل عن مطياف قوة الجاذبية الرواية.

Abstract

وقد أصبحت دراسة بنية الجزيئات الحاسمة أمام الكشف عن الآليات الجزيئية وظيفة. هناك العديد من bioinstruments محدودة ، ولكنها مهمة قادرة على الاعتماد على اختبار قوة من الميزات الهيكلية في البروتينات. وقد تم تحديد نطاق معلمة على مدى دقة يمكن للباحثين نظير في العالم ميكانيكية نانوية من الجزيئات ، مثل الأحماض النووية ، والانزيمات والبروتينات التي تؤدي المحركات إدامة الحياة عمل. يتم ضبطها جيدا قوة ذرية المجهر (AFM) لتحديد الهياكل الأصلية من البروتينات الليفية مع دقة المسافة على قدم المساواة مع المجهر الإلكتروني. ومع ذلك ، في الدراسات القوة فؤاد ، والقوات وعادة ما تكون أعلى بكثير من جزيء واحد قد تواجه ^{1 و 2.} الفخاخ البصرية (OT) هي جيدة جدا في تحديد المسافة النسبية بين حبات المحاصرين ، ويمكن نقلها قوات صغيرة جدا ^3. ومع ذلك ، فإنها لم تسفر أطوال المطلقة دقيقة من الجزيئات قيد الدراسة. المحاكاة الجزيئية تقديم معلومات داعمة لمثل هذه التجارب ، لكنها محدودة في القدرة على التعامل مع أحجام نفس الجزيئية كبيرة ، وأطر زمنية طويلة ، وإقناع بعض الباحثين في غياب الأدلة الداعمة الأخرى ^{2 و 4.}

قوة الجاذبية مطياف (GFS) يملأ مكانة حاسمة في ترسانة محقق من خلال تقديم مزيج فريد من قدراتهم. هذه الأداة هي قادرة على توليد قوى عادة مع 98 ٪ أو أفضل دقة من مجموعة إلى مجموعة femtonewton nanonewton. قياسات المسافة في الوقت الحاضر قادرة على حل طول المطلقة الجزيئية الى خمسة نانومتر ، والنسبية فصل الزوج حبة المسافات مع دقة مماثلة لاعتراض البصرية. أيضا ، يمكن أن تمتد أو تحديد GFS uncoiling حيث القوة بالقرب من التوازن ، أو توفير قوة متدرج لسيجمع ضد أية تغييرات هيكلية قياسه. فمن الممكن حتى لتحديد كيفية العديد من مخلفات الأحماض الأمينية ويشارك في فعاليات uncoiling تحت الأحمال القوة الفسيولوجية ^2. خلافا لأساليب أخرى حيث هناك واسعة معايرة القوة التي يجب أن تسبق أي فحص ومعايرة GFS لا يتطلب مثل هذه القوة ^5. من خلال استكمال نقاط القوة في أساليب أخرى ، فإن GFS سد الفجوات في فهم nanomechanics من البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى.

Protocol

مقدمة لتكوين الرواية GFS

من GFS يتكون من عدة عناصر أساسية : أ مجهر الضوء العادي ، وهو جبل الاستوائية ، كاميرا ، وجهاز كمبيوتر [الشكل 1]. أمر لا غنى عنه أيضا مختومة تدفق الخلايا التي تتولى غرفة العينة وفقا للتصميم GFS. هي التي شنت المجهر الخفيفة على جبل الاستوائية بحيث نطاق يمكن استدارة في اتجاهات مختلفة في الفضاء. هذه القدرة تسمح استغلال ناقلات ثابت الجاذبية بحيث عينات يمكن التوجه بشكل حيوي بالنسبة للناقلات وبالتالي فإن قوة الجاذبية يمكن نقلها حمولة قوة piconewton المدى للعينات. عدسة الكاميرا يستبدل المجهر الضوء على العين بحيث يمكن تسجيل التغيرات في توجهات العينة. وهذه البيانات الرقمية الخام ومعالجته عن طريق الكمبيوتر لتفسير البيانات حيز التنفيذ الفعلي وقياسات المسافة. تم تصميم غرفة مغلقة تدفق للسماح لجميع درجات الحرية في الفضاء من دون خسارة العينة. في غرفة يتواجد الجزيء العينة التي مربوط بالقرب من واحدة إلى محطة حبة "الراسية" التي يتم لصقها على سطح الغرفة. غير المربوطة في نهاية المقابلة لحبة "الجوال" التي هي خالية من سطح الغرفة. هذا هو حبة المحمول ، حرة في المنطقة العازلة التي يمكن مقايسة تصرف عليه قوة الجاذبية تمتد بذلك جزيء المربوطة في مثل هذه الأحمال قوة منخفضة [الشكل 2]. العينة يبدو ببساطة مثل زوج من المجهرية تحت المجهر ، على الرغم من أنها لا تأخذ بعض الخبرة لتمييز أزواج صالحة للاستعمال جيدة مقرونة تمسكهم جزيء من الأزواج على حد سواء حيث حبات يجلسون على السطح من غرفة التدفق. واحد تعديل على هذا النظام هو إضافة منصة عائمة التي تتولى GFS وعلقتها الينابيع. في هذا التكوين ، وبمجرد أن عينة تم تدويرها في وضع يمكنها من حيث قوة الجاذبية يمكن أن تعمل على العينة ، ويمكن إسقاط النظام الأساسي وجميع مكوناته ضد الربيع الدائم. بالقرب من سقوط حر ، القوة المؤثرة على حبة المحمول هو ما يقرب من الصفر ، وعند تمديد الينابيع "كحد أقصى ، يتم ضرب قوة الجاذبية بمقدار مرتين. في هذه الطريقة ، يمكن تصنيف القوة المجدولة a / المسافة استجابة لقياس سلوك جزيء واحد يحمل في قوة مختلفة.

1. إعداد Microsphere

1. غمر حوالي 10 ملغ من الخرز الزجاجي أو السليكا 0.04 ٪ في 3 Aminopropyltriethoxysilane (قطع مع الأسيتون) لمدة دقيقتين.
2. شطف مع اثنين من التغييرات من الماء المقطر مزدوجة وأجهزة الطرد المركزي لبيليه في 2000 XG لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
3. إضافة 5 مل من اقتران العازلة (0.01 م بيريدين قطع مع الماء المقطر المزدوج وضبط درجة الحموضة إلى 6.0) ، ويهز هذا الخليط بقوة. الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
4. لكعكة الرطب من الخرز ، إضافة 2 مل من محلول gluteraldehyde 5 ٪ (قطع gluteraldehyde العازلة مع اقتران). هزة بقوة.
5. تحت غطاء المحرك ، وتناوب حبة خليط / gluteraldehyde لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
6. الطرد المركزي كما سبق ونضح وطاف.
7. تغسل حبات في 5 مل من اقتران العازلة التي تهتز لها بقوة والطرد المركزي ، ونضح وطاف. كرر ذلك مرات ثلاث.
8. إضافة حوالي 15 ميكرولتر من الأجسام المضادة المطلوبة لالخرز وتهزه بقوة. ينبغي أن تكون استدارة لحبات 16-24 ساعة.
9. تحت غطاء محرك السيارة ، إضافة 5 مل من 1 M حل تبريد جليكاين (قطع جليكاين بالماء المقطر المزدوج وضبط درجة الحموضة إلى 7.0). هزة بقوة هذا الخليط وتناوب لمدة 30 دقيقة.
10. الطرد المركزي ونضح من طاف.
11. إضافة 5 مل من غسل العازلة (0.01 م تريس ، ودرجة الحموضة 7.0 ؛ 0.1 ٪ أزيد الصوديوم ؛ 0.1 ٪ BSA ؛ كلوريد الصوديوم 0.15 M ، و 0.001 EDTA M). هزة بقوة هذا ، ونضح الطرد المركزي لطاف. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات إضافية.
12. عازلة لتغيير قليل الملح العازلة (0.1 M بوكل ؛ إيميدازول 0.02 م ؛ 5 ملم MgCl ₂ ؛ لضبط درجة الحموضة 7.0). كرر ثلاث مرات.

2. مرفق نموذج لالمجهرية

1. أخذ كمية صغيرة من الخرز أعدت (حوالي 2 ميكرولتر من كل كعكة من الخرز ولكن ، إذا كان هناك تباين كبير في القطر بين دفعات ، فإنه من المفيد استخدام حول وجود نسبة كبيرة من 8:01 إلى حبات صغيرة) وإضافتها إلى أنبوب microcentrifuge مقايسة مع العازلة. تقليل تركيز البروتين الخاص إلى نحو 5 ميكرومتر ، وذلك باستخدام مقايسة العازلة. إعداد ما لا يقل عن الحجم الإجمالي من 400 ميكرولتر بما في ذلك المخزن ، والبروتين ، والخرز و.
2. تدوير هذا الخليط حوالي 1 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات (إذا تم تحريكها على الكثير من البروتين ، وسوف تصبح عديمة الفائدة والتجميعية).

3. غرفة تحضير الشرائح

1. معطف سميك شريحة المجهر مع النيتروسليلوز 0.01 ٪ (في خلات الأميل). السماح لهذه الشريحة الجافة لمدة 10 دقائق تقريبا.
2. مع قطع الزجاج الحادة ، وخفض تغطية الشريحة وذلك لجعل غرفة. وهذا يتطلب ثلاثة شرائط من الزجاج.
3. استخدام الواقعأوري حافة الزجاج وأشعل النار عليه عبر مسحة من الشحوم فراغ على جانبي الحافة.
4. غطت الصحافة شرائط الشحوم المغلفة على النيتروسليلوز المجفف الشريحة لإنشاء مربع على سطح الشريحة.
5. ماصة حوالي 2 ميكرولتر من خليط حبة / البروتين من خلال استغلال pipetter على سطح من الزجاج داخل منطقة الجزاء.
6. إضافة حوالي 2-40 ميكرولتر من الملح العازلة منخفضة اعتمادا على كيفية كبيرة في الغرفة.
7. اضغط زلة تغطية على أعلى مربع وهي مغلفة بالفعل مع الشحوم فراغ لإنهاء غرفة مغلقة ومعزولة.
8. اسمحوا الشريحة الجلوس على مستوى مكان حتى حبات متسع من الوقت لترسيخ نفسها لالنيتروسليلوز.

4. GFS البيانات اقتناء

1. جبل الشريحة على مرحلة GFS
2. رصد ما هو الكاميرا GFS تسجيل والبحث عن الشرعية "أزواج حبة" والذي يتم إرفاق microsphere صغيرة قرب خط الاستواء من microsphere كبيرة.
3. عندما يتم العثور على الزوج المحتملة حبة ، تذهب من خلال عمق التركيز لتحديد إذا كان "الجوال" ليست حبة يستريح على سطح الشريحة.
4. حالما يتم التعرف على زوج مناسب ، لاحظ زاوية الجوال حبة بعيدا عن _أقصى د (د _أقصى = المسافة القصوى بين centroids من جانب المجهرية). نقل نطاق في موقف للحصول على الفيديو.
5. ينبغي زاوية سفر GFS تكون كافية لتسجيل د _دقيقة ، كحد _أقصى يوميا ، _ودقيقة د التي قد تدعو ل25-90 درجة اعتمادا على طول جزيء.
6. محضر كما يسافر الزوج من _دقيقة إلى _أقصى د د د والعودة إلى _دقيقة.
7. انها فكرة جيدة لتصوير الفيلم أيضا من الخلفية بحيث يمكن طرح في وقت لاحق لتحليلها.
8. إذا تراجع أداء GFS ، نقل مرة أخرى إلى نطاق _{الحد الأقصى} د وسجل انخفاض في ما لا يقل عن 60 لقطة في الثانية الواحدة. الجزء الحاسم هو التذبذب الأولى ، ولكن يمكن أيضا أوقات قياسية طويلة تستعمل لدراسة ديناميكية.

5. GFS تحليل البيانات

1. تحويل الفيديو رقميا الخام إلى صورة "thresholded" وتشغيل الماكرو في imageJ لتحديد موقف من كل حبة النقطه الوسطى في كل إطار من الفيديو. وهذا هو أيضا لإسقاط الفيديو.
2. تفريغ X ، Y والبيانات في المنطقة من ImageJ Excel ورسم نقطة.
3. إذا تم الحصول على زوج مناسب حبة عن طريق الفيديو ، وسنام ملاحظته في الرسم البياني يدل على حبات يجري في أقرب منها (د _دقيقة) وعلى قمة من الرسم البياني هو موقف _{الحد الأقصى} د.
4. باستخدام هذه البيانات ، ينبغي تحديد دائرة نصف قطرها من كل حبة على وجه التحديد في ImageJ ويتم وضع كل هذه المعلومات في المعادلة متداخلة :
   د = [(ز الخطيئة α) ² + (α + جتا ز د _ماكس -- ز) ^{2] 0.5}
   ز = [د ² _دقيقة + ص _(ب) ² -- (ص _أ + _ب ص) ^2] = ^0.5 ص _ب β الخطيئة
   ج = د _ماكس -- ص _أ -- ز
   (د = المسافة بين centroids ؛ ز = قوة الجاذبية ؛ α = زاوية في درجة موازية لعدسة الهدف ؛ ص _ب = نصف قطرها حبة المتنقلة ؛ ص _أ = نصف قطرها الراسية حبة ؛ β = زاوية مرفق قبالة محور خط الاستواء للحبة الراسية.
5. ويمكن تركيبها باستخدام نصف قطرها من حبة المحمول الذي ينتج أيضا حجمه ، ونظرا لكثافة حبة ، حبة القوة المحمول يضفي على جزيء تحسب في piconewtons بعد انتعاش المذيب هو مطروح. هذا الأسلوب تدابير القوة على جزيء المربوطة في piconewtons ويحسب طول جزيء المطلق بين الأضداد في المرفقات نانومتر. F = V (ديسيبل) A (F = القوة ، V = الحجم ، د = كثافة microsphere الزجاج ، وتسارع = بسبب الجاذبية ، ب = كثافة الماء المزاح).

6. ممثل النتائج :

إذا فعلت الإعدادية حبة بشكل صحيح ، لن يكون هناك حد أدنى التجميع حبة رغم أنه قد يكون هناك يزال هناك تتجمع أحيانا حبة. عندما ينظر اليها من خلال نطاق ويجب أن يكون هناك توزيع معقول من الخرز أو ما إذا كان الاقتران ليس في الغرفة.

فمن المهم تقليل الاهتزازات قدر الإمكان ؛ القيام بذلك إما جدول الهواء ، وامتصاص الصدمات الخاصة القدمين لترايبود أن يحمل جبل مكافئ ، أو على النظام الذي يستخدم ويمكن استخدام الينابيع لعزل الاهتزاز.

آخر نصيحة مفيدة بشأن تدفق غرفة مغلقة والسماح لها الوقوف لمدة خمس دقائق على طاولة المستوى بعد أن تم بناؤها بالكامل. هذا يسمح لأي الخرز غير مرتبط بشكل اكبر لتعويم أسفل عبر العازلة والباقي في طبقة من النيتروسليلوز. إذا كانت المركبة بدلا من الشريحة مباشرة بعد الانتهاء ، فإن المحقق قد باستمرار للتعامل مع حبات تحلق حرفيا من خلال مجال الرؤية ، وإذا كان هذا يحدث خلال اقتناء الفيديو يمكن الفاسدين عشره التجربة. إذا تم ذلك بشكل صحيح ، يتم تصغير حبة كبيرة ونتائج الرحلة أنظف الفيديو.

عندما يتم التعرف على إمكانات الزوج حبة من قبل المشغل GFS ، فمن المفيد وضعها من خلال التناوب الأولية لرصد سلوك الزوج. ونادرا ، ليست حبة كبيرة ملصقة بإحكام على الشريحة. إذا حدث هذا ، ليس هناك أي فائدة من استخدام الزوج لأنه من الأهمية بمكان أن تبقى راسية بشكل اكبر حبة في وضع ثابت خلال مدة الاستحواذ. إذا كان الزوج مستقرة ولا يحمل "لفة حبة الراسية" ، ثم انها مناسبة لالتجريب.

ويمكن استخدام قطعة من مسافات الفصل حبة مقابل تغيير في زاوية النسبي للجاذبية لتقييم البيانات التي يحصل عليها. وتتمثل احدى النتائج الجيدة تظهر ممثل فصل قليلا على هضبة وكما حبة المحمول تحرر نفسها من حبة الراسية بسبب تأثير الجاذبية ، وسوف تظهر في الرسم البياني أكثر الانفصال. استمر هذا الوضع حتى يتم التوصل إلى الذروة لطيفة وهو ما يسمى د _ماكس ويبدأ المنحنى الهابط العودة مرة أخرى إلى خط الأساس د _دقيقة [الشكل 1]. في ظروف مثالية ، وهذا التوقيع هو متناظرة. وتتمثل احدى النتائج غير تمثيلية اظهار رسم بياني يظهر مع أنماط غير متماسكة لا د متميزة _{دقيقة كحد أقصى} ، د ، د نمط _دقيقة ، أو أنها سوف تظهر الفواصل التي هي أوامر من حجم مرتفع جدا لجزيء واحد يدل ربما كان هناك قطعة من الغبار بين الخرز ، أو ربما أنه كان مجرد حبة المحمول لا يعلق على الاطلاق. عملية للعثور على الزوج ، وإطلاق النار عليه ، معالجتها وتحليلها لديها ثغرات كثيرة حيث يتم وقف اعدام حبة أزواج غير لائق بها. لذا ، اذا كان لديك إلى نهاية العملية برمتها ويكون لديك طول جزيء التي تنسجم مع نتائج سابقة ، يمكن للمرء أن يكون واثقا جدا بأن الزوج حبة الأصلي هو ممثل ويمكن تضمينه في النتائج. في يوم جيد ، ويمكن أن يؤخذ حوالي نصف حبة من خلال اطلاق النار أزواج لتصبح نقطة بيانات المشروعة. على سبيل المثال ، من المعروف طول فائف ملفوف من الميوسين وMF30 MF20 بين الأضداد ، على أساس البيانات وفؤاد م ، والبيانات تقترب من 100 نانومتر ^2،7،8،9. إذا كانت النتيجة عدة مرات هذا الطول ، وقد تجمع العينة. النتائج المقدمة هنا هي من التجارب القياسية التناوب GFS ويبرهن على وجود مسافة 96 نانومتر ± 5 نانومتر ، [الشكل 2] الذي يتفق بشكل وثيق مع قياسات MF30 (الذي يربط في نهاية - N من الميوسين subfragment - 2) وMF20 (الذي يربط في meromyosin الضوء) على الضد المسافة الميوسين استنتاجها من قيم الأدب [الشكل 3].

تكوين شخصية GFS 1. وصفت أجزاء كبيرة من GFS.

الشكل 2. تخطيطي مبدأ GFS. يظهر الجانب الأيسر من النقطه الوسطى حبة المحمول على مسافة لا تقل عن النقطه الوسطى من حبة الراسية. كما يتم استدارة GFS ، الجوال حبة ينسجم مع ناقلات الثقل الذي يشغل أيضا بالتوازي مع محور جزيء المربوطة. في هذا الموقف ، والمسافة بين centroids من الخرز النقالة والراسية وصلت الى الحد الأقصى. أعلى اليمين يظهر شريحة تمثيلية من فيلم GFS. أسفل اليمين هو صورة تناوب GFS تمر.

الشكل 3 تظهر نتيجة الممثل د _دقيقة على الجهة اليسرى من الرسم البياني ؛ د _{كحد أقصى} في الفصل النسبي 17.78 ميكرون ، والعودة إلى د _دقيقة حول خط الأساس من حوالي 17.75 ميكرون الفصل النسبي بين الخرز.

الشكل 4. الممثل نتيجة تجربة التناوب GFS تظهر المسافة بين MF20 MF30 الأضداد ومتوسط ​​96 نانومتر. وهذا يمثل والمدة التقريبية للS2.

الشكل 5. الميوسين ديمر الثاني يستخدم لإظهار المرفقات ممكن للاستخدام مع GFS بما في ذلك الأجسام المضادة و / أو المرفقات أكتين. الاحتمالات المختلفة مرفق يسمح لمختلف الاستراتيجيات GFS لقياس مختلف المناطق ، أو لتطبيق عمودي أو موازية لقوة المجال قضيب من ديمر الميوسين.

Discussion

عند تحويل الفيلم إلى تمثيل thresholded رقميا ، من الأهمية بمكان بالنسبة لصورة thresholded للحفاظ على المنطقة نفسها في كل إطار من الفيديو. لأن الزوج في حبات الخرز التحرك بشكل مستقل عن بعضها البعض ، يمكن لأي انحراف في مجالات thresholded أيضا أن يسبب المسافات النسبية بين centroids من الخرز إ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyltriethoxysilane	Polysciences, Inc.	919-30-2
Acetone	Fisher Scientific	A18P-4
Pyridine	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	G7776
Glycine	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Sodium azide	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	MSI	E9884
Nitrocellulose	Sigma-Aldrich	60443
N-N Dimethyl Formamide	Extracted from Large New	D4254
Rabbit skeletal myosin II	Zealand White Rabbits (7-8)	NA
MF30 antibody (9-10)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MF30
MF20 antibody (6)	Hybridoma Bank	MF20
Lab microscope	Boreal	WW57905M00
Equatorial mount	Celestron	CG-5
Digital video cam	Sony Corporation	XCDV60
Caliper release	Cabelas	IA-415482
Compression spring	Jones Spring Co.	723
Extension spring	Jones Spring Co.	770
ImageJ	National Institutes of Health	NA
Fire-i drivers & application	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	NA