Transcriptome تحليل خلايا مفردة

Summary

نحن في هذه المقالة وصف طريقة بسيطة لحصاد واحد من الخلايا العصبية من ثقافات الجرذان الأولية واللاحقة تحليل transcriptome به آرنا التضخيم. هذا النهج هو تعميم إلى أي نوع من الخلايا.

Abstract

كثير من تقنيات تحليل الجينات التعبير تعتمد على المواد المعزولة من السكان غير متجانسة من الخلايا من أنسجة أو خلايا الخليط في الثقافة. ^1،2،3 في حالة من الدماغ ، مثل مناطق قرن آمون تحتوي على ترتيبات معقدة لأنواع مختلفة من الخلايا ، ولكل منها ملامح متميزة مرنا. القدرة على حصاد الخلايا واحد يسمح لمزيد من العمق في التحقيق في الخلافات بين الدول وداخلها الجزيئية السكان الخلية. نحن تصف طريقة بسيطة وسريعة لحصاد الخلايا لمزيد من المعالجة. وتستخدم ماصات غالبا ما تستخدم في عزل الكهربية (باستخدام الطموح) خلية من الاهتمام ودائع مريح هو داخل أنبوب إيبندورف لمزيد من المعالجة مع أي عدد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية. يمكن تعديل البروتوكول لدينا محصول من التشعبات من الثقافة الخلية أو الخلايا الفردية حتى من شرائح حادة.

نحن أيضا وصف أسلوب التضخيم آرنا كتطبيق في اتجاه مجرى النهر الرئيسي للالعزلة خلية واحدة. وقد تم تطوير هذا الأسلوب من قبل مختبرنا كبديل لغيرها من تقنيات تحليل الجينات التعبير مثل النسخ والخلف أو في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). ^{4،5،6،7،8} هذا الأسلوب يوفر لتضخيم خطية من مذيل بعديد الأدينيلات RNA مع بداية femtograms فقط من المواد ونتج عن ذلك مبالغ ميكروغرام من الحمض النووي الريبي العقاقير. المادة تضخيم خطي يقدم تقدير أكثر دقة من التضخيم PCR الأسي من الوفرة النسبية للعناصر transcriptome للخلية معزولة. الإجراء الأساسي يتكون من مجموعتين من التضخيم. لفترة وجيزة ، تأسست فيها بوليميريز RNA T7 موقع مروج [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل في ضعف النصوص التي تم إنشاؤها من مرنا. تتم بعد ذلك بين عشية وضحاها في النسخ المختبر (IVT) التي تفاعل البلمرة T7 RNA تنتج العديد من النصوص العقاقير من [كدنا] مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل. الجولة الثانية تكرر هذه العملية ولكن مع بعض الاختلافات الفنية منذ البداية هي مادة الحمض النووي الريبي العقاقير. ذلك هو المعيار لتكرار الجولة الثانية ، مما أدى في ثلاث جولات من التضخيم. في كثير من الأحيان ، يتم تنفيذ الجولة الثالثة في رد فعل المختبر باستخدام النسخ triphosphates نوكليوزيد biotinylated بحيث يمكن تهجين الحمض النووي الريبي العقاقير المنتجة والكشف على ميكروأري. ^7،8

Protocol

1. خلية ثقافة

مختبرنا يستخدم الابتدائي الثقافات الفئران العصبية الحصين للتجارب أدناه. فيما يلي وصف لبروتوكول لتعديل بانكر كيف يتم إنشاء هذه الخلية الثقافات والحفاظ عليها. ⁹ وهناك ، بطبيعة الحال ، مصممة على عدد من التباديل شاملة من تقنيات زراعة هذه الخلايا والتي أنشئت لأية وسيلة للاحتياجات المحددة للمختبر خاص أن يوفر وإمدادات صحية باستمرار من الخلايا يمكن أن تكون بديلا مناسبا.

1. وضعت خمسة ، على مدار تعقيمها ، coverslips 12 ملم في 35 ملم وطبق المغلفة مع 80 ميكروغرام / مل بولي - D - يسين (MW 70-150،000) في بورات العازلة O / N ، تشطف بالماء (خلية ثقافة الصف) ، ثم مغطاة 1 ميكروغرام / مل في Laminin بورات العازلة O / N ثم تشطف بالماء مرة أخرى. يضاف NG سائل الإعلام (MEM مع أملاح ايرل وGlutaMAX تستكمل مع الجلوكوز (0.6 ٪ ث / ت) والبنسلين (100 U / مل) ، وستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل) ، الحصان المصل (10 ٪ V / V)) والأطباق يتم تخزينها في حاضنة (5 ٪ CO ₂ عند 37 درجة مئوية). وPDL150/laminin بمثابة الركيزة لعزل الخلايا العصبية في النمو على أن يكون أحادي الطبقة. يمكن المغلفة coverslips تصل إلى أسبوعين قبل الطلاء.
2. في يوم من الطلاء ، ومطلي الخلايا العصبية الجنينية الأولية من الفئران الحصين يوم 18 NG في وسائل الإعلام عن طريق إضافة 1.5 مل من الخلايا 100000 / مل تعليق. أربع إلى ست ساعات بعد الطلاء ، ويتم التعامل مع كل طبق 35 ملم مع 0.75 ميكرولتر من 5 ملم السيتوزين بيتا - D - arabinofuranoside (آرا - C) لمنع نمو الخلايا الدبقية أي تلوث. أربع وعشرين ساعة في وقت لاحق ، تم تغيير وسائل الاعلام لطلاء MEM مع أملاح ايرل والجلوتامين L - تستكمل مع 0.6 ٪ W / V الجلوكوز والصوديوم البيروفات 1 ملم ، وB27. ويسمح للخلايا أن تنمو لمدة أسبوعين على الأقل قبل استخدامها في أي تجارب للسماح للتنمية كاملة من العمليات.

2. إعداد الماصات

مذكرة بشأن RNases : الجلد واللعاب ، وحتى التنفس هي المصادر الرئيسية للRNases ، والإنزيمات التي تحط من الحمض النووي الريبي. فمن الضروري أن يكون لاحظ ريبونوكلياز تقنية خالية من هذه النقطة في البروتوكول بحيث لا تصبح عينة ملوثة RNases وتتحلل بعد ذلك. وهذا يشمل ارتداء القفازات دائما عند التعامل مع العينات والكواشف ، لم يتحدث خلال عينات أو الكاشفة ، واستخدام صناديق جديدة من نصائح ماصة معقمة والأنابيب. في كثير من الأحيان ، يتم تطهير الماصات التي ليست حصرا للعمل المعين من قبل الجيش الملكي النيبالي المسح عليهم بمحلول معالجة ريبونوكلياز مثل AWAY ريبونوكلياز (الاحيائية الجزيئية). ومع ذلك ، فإن هذه الحلول منع أي ردود أفعال المتلقين الأنزيمية ولذلك فمن المهم أيضا لمنع تلوث العينات الخاصة بك مع هذه العلاجات.

1. الأوتوكلاف 1.5 ملم القطر الخارجي ماصات زجاجية (OD).
2. باستخدام مجتذب micropipette ، وسحب ماصات إلى القطر المناسب للتسجيلات الكهربية ، والتي قد تختلف استنادا مجتذب الخاص ، خيوط ، وماصات ¹⁰ الحجم تحمل ليست حرجة للغاية حيث سيتم تقسيم غيض قبل جمع الخلية.
3. متجر بعناية ماصات في بيئة خالية من الغبار حيث النصائح سوف تبقى على حالها (استخدام مثالي جرة تخزين micropipette).
4. لكسر غيض بطريقة تخضع للمراقبة ، عقد kimwipe مشدود بين أصابعك في يد واحدة وبلطف شديد فرشاة غيض من ماصة عبر العصور 1-2 الورق. ينبغي أن يكون الافتتاح حوالي 75-100 ٪ من حجم الخلية المستهدفة. ضبط هذه الخطوة حتى يمكنك تحقيق النتيجة المرجوة.

3. تستعد الثقافة وانابيب ، وميكروسكوب

1. إعداد العدد المرغوب فيه من 1.7 مل أنابيب إيبندورف. إضافة 2 ميكرولتر من ، برنامج تلفزيوني العازلة حبلا الأول إذا هو أن تكون المواد المستخدمة في التكبير خلية واحدة ، أو أي حل آخر لتخزين المواد المقطوع.
2. للحصاد ، وسوف تحتاج إلى مجهر الضوء مع هدف 40X مزودة micromanipulator. استخدام حامل ماصة مع أنابيب مرنة الرائدة بعيدا عن حاملها. لصق الأنبوب على سطح مستقر لمنع الحركة غير المرغوب فيها من خلال جمع ماصة. في نهاية الأنبوب ، اضافة الى وجود إبرة بحيث يمكن تركيبها حقنة 1 مل مع اتصال Luer للقفل وغيرت في ما بين المستخدمين.
3. إذا باستخدام coverslips ، والعمل مع واحدة ساترة في وقت واحد. إذا لزم الأمر ، نقل ساترة واحد لطبق جديد * 35 ملم تحتوي على برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام في الاختيار. وتعد الخلايا خارج الحاضنة ، وأكثر سوف تصبح غير صحية ، وأكثر الملامح مرنا إرادتهم التي تحيد عن خلية سليمة. فمن الأهمية بمكان للحفاظ على صحة الخلايا على coverslips غيرها من ابقائها في الحاضنة عندما لا يعمل معهم. العمل في اسرع وقت ممكن مع خلايا من خارج الحاضنة.

* مع الإعداد لدينا فمن الضروري استخدام غطاء طبق منذ 35 ملم على جدران صحن الفعلية مرتفعة جدا للسماح السليم للنهوض micropipette نحو coversliص

4. حصاد خلايا

1. تأمين micropipette في حامل micropipette. يضعوا micropipette حامل لإدراج على micromanipulators. حددت لنفسها هدف 40X.
2. مكان الطبق على المسرح المجهر والعثور على المنطقة من الخلايا مناسبة للحصاد. في حالة من العصبية الأولية الثقافات ، يجب أن تكون خلية معزولة نسبيا من جيرانه لمنع الحصاد من الخلايا المحيطة بها و / أو العمليات. سكان النصوص مرنا بين سوما والعمليات تختلف ، لذلك اذا كانت مهتمة في mRNAs جسدية فقط ، والرعاية التي ينبغي اتخاذها لمنع تلوث سوما مع العمليات. مكان الخلية التي ترغب في موسم الحصاد في وسط ميدان العرض.
3. استخدام micromanipulator للنهوض micropipette نحو الحل في طبق في مسار الضوء. انخفاض غيض ماصة في الحل. تطبيق الضغط الايجابي من هذه النقطة التي تهب من خلال حقنة طفيفة. ننظر من خلال العدسة. ينبغي أن تبدو وكأنها ماصة الظل في مجال الرؤية. أعلى بكثير من الطائرة من الخلايا ، وضبط الموقف من طرف ماصة حتى وجوده ضمن مجال الرؤية والتركيز على الطرف ماصة باستخدام المقابض الخشنة التركيز. عند هذه النقطة ، ينبغي تقييم حجم لو حملت من ماصة كبيرة جدا أو صغيرة جدا. وسوف حصاد ممارسة يوفر القدرة على تحديد ما إذا كان قد تحقق حجم الصحيح تتحمل في هذه المرحلة.
4. الآن ، ودفع ماصة باتجاه الطائرة من الخلايا. من المهم أن لا يتم المتقدمة غيض عجل جدا ، الامر الذي ادى الى كسر في المنطقة التي ترغب في جمع. لمنع هذا ، استخدم التركيز الخشنة للمضي قدما في تنسيق الطائرة قبل التقدم نحو غيض ماصة الخلايا باستخدام micromanipulators. عندما كنت على مقربة من الخلايا ، استخدم التركيز يرام حتى كلا من الخلايا وغيض ماصة في التركيز. وقف تطبيق الضغط الايجابي قبل أن تصل الطائرة من الخلايا لمنع تهب عليهم الخروج من ساترة.
5. استخدام micromanipulators لموقف الطرف ماصة بحيث يكون لمس سوما الخلية التي ترغب في الحصاد.
6. باستخدام محقنة ، تطبيق لطيف الامتصاص عن طريق الفم حتى يدخل الخلية غيض ماصة. إذا كانت الخلية التي لا تدخل في ماصة ، حرك بلطف طرف أقرب إلى الخلية ونزولا حتى يرفع من ساترة.

5. إنقاذ الخلية

1. استخدام micromanipulator للتحرك على الفور حتى ماصة والخروج من الحل.
2. إزالة ماصة من حامل.
3. الاستمرار على 1.7 مل أنبوب إيبندورف في يد واحدة وكسر بلطف غيض من ماصة على جانب الأنبوب نحو القاع. (الهدف للعلامة 0.1 مل).
4. مع طرف كسر تركزت داخل الأنبوب ، اضافة الى وجود إبرة تعلق على حقنة مل 1-3 في افتتاح قمة ماصة. كساد الغطاس بسرعة مما اضطر الحل في للرش ماصة للخروج الى الأنبوب. وينبغي أن تبقى الخلية في الطرف جدا من ماصة وهذا ينبغي أن تكون كافية لطرد صحيح الخلية. يجب الحرص على عدم لمس أي تلميح إلى السائلة على جانبي الأنبوب وعمل شعري سيجلب الظهر السائل في ماصة.
5. تدور بسرعة إلى أسفل محتويات الأنبوب باستخدام microfuge سطح المكتب وتجمد على الفور (مخزن في -80 درجة مئوية) أو مكان على الجليد لمزيد من المعالجة (الأفضل).

6. آرنا التضخيم

1. الجولة الأولى 1 التوليف حبلا [كدنا] :
   إنشاء مرنا / الهجينة [كدنا].
   1. لكل ميكرولتر 5 من خلية واحدة حجم المجموعة ، إضافة 1X التالية لجمع أنبوب (على الجليد). يمكن زيادتها لتصل ردود الفعل جمع كميات أكبر (2X عن 10 مجلدات جمع ميكرولتر ، الخ). خلق مزيج الرئيسي بضرب الكواشف التالية من قبل عدد من أنابيب جمع 10-20 ٪ زائد لحساب pipetting الخطأ. القيام بذلك عن كل ردود الفعل اللاحقة في الإجراء ampification آرنا.
      • على الجليد
      • 1.2 ميكرولتر dNTP ل(2.5 ملي مول لكل منهما)
      • 2.4 ميكرولتر 5X العازلة حبلا الأولى
      • T7 - 0.3 ميكرولتر بنسبة ضئيلة (DT) التمهيدي (100 نانوغرام / ميكرولتر)
      • 1.2 DTT ميكرولتر (100 ملم)
   2. جعل حجم ما يصل الى 10،25 ميكرولتر مع المياه مجانا nuclease. ماصة المزيج وتدور به لفترة وجيزة microfuge.
   3. احتضان لمدة 5 دقائق عند 70 درجة مئوية إلى تفسد أي هيكل الثانوي للمرنا. المكان فورا على الجليد لمدة لا تقل عن 5 دقائق.
   4. إضافة (مرة أخرى باستخدام مزيج الرئيسي) :
      • 0.3 RNasin ميكرولتر (40 U / ميكرولتر)
      • 0.45 ميكرولتر مرتفع الثالث (200 U / ميكرولتر)
      • 1 ميكرولتر المياه nuclease مجانا
   5. ماصة المزيج لفترة وجيزة وزيادة ونقصان. احتضان لمدة 1 ساعة على 42 درجة مئوية.
   6. احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإبطال نشاط مرتفع. يستمر إلى الخطوة التالية.
2. الجولة الثانية 1 التوليف حبلا [كدنا]
   إنشاء الاشعال RNA من جزء من مرنا مرنا الهجين / الحمض النووي للمساعدة في تركيب سو [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل المزدوج.
   1. • على الجليد
      • إلى 12 ميكرولتر رد فعل حبلا الأولى ، إضافة :
      • 8 ميكرولتر المياه nuclease مجانا
      • 7.5 ميكرولتر 5X العازلة حبلا الثانية
      • 0.75 مزيج dNTP ميكرولتر (2.5 ملي مول لكل منهما)
      • 0.25 ميكرولتر يغاز الحمض النووي (10 U / ميكرولتر)
      • 1 الحمض النووي بوليميريز ميكرولتر الأول (يو 10 / ميكرولتر)
      • 0.25 ميكرولتر ريبونوكلياز H (يو 2 / ميكرولتر)
      مزيج دقيق من قبل pipetting وتدور لفترة وجيزة. احتضان لمدة 2 ساعة على 16 درجة مئوية.
   2. إضافة : 1 ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي T4 (5 U / ميكرولتر). مزيج من قبل فترة وجيزة pipetting وزيادة ونقصان. احتضان أكثر 10 دقيقة في 16 درجة مئوية.
   3. تنظيف رد الفعل باستخدام MinElute Qiagen عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع تعديلات طفيفة : ¹¹ اغسل 2 مرات مع 500 ميكرولتر العازلة غسل بدلا من 1 750 ميكرولتر مع الوقت. أزل في الماء nuclease الحرة.
   4. التركيز على استخدام 2-4 ميكرولتر Speedvac أو عن طريق الترسيب الايثانول. لهطول الأمطار الإيثانول ، والجليكوجين بمثابة الناقل الحمض النووي ويتم استخدامه عند عجل كميات صغيرة من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. الصوديوم من خلات الصوديوم يساعد على تحييد شحنة سالبة من العمود الفقري الحمض النووي ، والمساعدة في هطول الأمطار. ليس من الضروري لجعل مزيج رئيسية للالامطار الروتينية.
      • إضافة الماء DEPC 29 ميكرولتر
      • 2 ميكرولتر الجليكوجين (5mg/mL)
      • 1 / 10 حجم (3 ميكرولتر) 3M خلات الصوديوم
      • 2.5 حجم (~ 250 ميكرولتر) الباردة الإيثانول بنسبة 100 ٪
      مزيج جيد. يعجل في -80 درجة مئوية (30 دقيقة. إلى O / N).
   5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   6. إزالة طاف بيليه ويغسل مع الايثانول ميكرولتر 800 70 ٪. تأكد تماما لطرد بيليه إما عن طريق pipetting vortexing أو للمساعدة في التخلص من الملح الزائد.
   7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف والهواء الجاف لمدة 15-20 دقيقة.
   8. Resuspend في 4 ميكرولتر من المياه المجانية nuclease. في مخزن -20 أو -80 درجة مئوية أو الاستمرار في الخطوة التالية.
3. الجولة (1) في النسخ المختبر (IVT) :
   توليف الحمض النووي الريبي من العقاقير المروج T7 أدمجت في [كدنا] مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل.
   1. يتم تنفيذ هذا التفاعل باستخدام MEGAscript Ambion T7 عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة إلا المحجمة عن ميكرولتر 10 بدلا من رد فعل 20 ميكرولتر ^(12). ولا بد من تجميع هذا التفاعل في درجة حرارة الغرفة وإبقاء المنطقة العازلة في درجة حرارة الغرفة خلال التجمع. وسوف تزود المنطقة العازلة يعجل الحمض النووي إذا كان البرد الجليدي. إبقاء NTPs ومزيج الأنزيم على الثلج عندما لا تكون قيد الاستعمال.
      • في درجة حرارة الغرفة
      • [كدنا] نقل معلق الذين تقطعت بهم السبل لمضاعفة أنبوب PCR رقيقة الجدران.
      • إضافة 4 ميكرولتر NTP مزيج (18.75 ملي لكل منهما)
      • 1 ميكرولتر العازلة رد فعل 10X
      • 1 ميكرولتر مزيج انزيم 10X
   2. احتضان 14 ساعة عند 37 درجة مئوية في thermocycler (الأفضل) أو الحاضنة.
   3. ويمكن تنظيف هذا التفاعل حتى باستخدام طريقتين مختلفتين تليها تركيز العينة باستخدام Speedvac هطول الأمطار أو الايثانول. لتنظيف استخدام عدة ، انتقل إلى ألف طريقة لتنظيف مع استخراج القياسية الفينول / كلوروفورم ، انتقل إلى الطريقة ب.
   4. أسلوب A :
      1. تنظيف تفاعل استخدام عدة AMBION Megaclear حسب تعليمات الشركة الصانعة مع بعض التعديلات ¹³ : اغسل 2 مرات مع 500 ميكرولتر العازلة غسل بدلا من 1 750 ميكرولتر مع الوقت. شطف للخطوة ، إضافة 50 ميكرولتر من المياه nuclease مجانا إلى وسط العمود ، في احتضان 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تدور في ل10000 ز 1 دقيقة. تكرار في أنبوب جديد. الجمع بين eluates. التركيز على عينة 2-4 ميكرولتر باستخدام Speedvac أو عن طريق الترسيب الايثانول.
      2. لهطول الأمطار الإيثانول : يستخدم خلات الأمونيوم بدلا من خلات الصوديوم في هذه الحالة لأنها فعالة في منع المشاركة في التساقط من النيوكليوتيدات الحرة مع الحمض النووي. وهذا أمر مهم بسبب التركيز العالي لانها تستخدم في التفاعل NTP IVT ، والتي يمكن أن تحول دون ردود فعل المتلقين.
         • إضافة الماء DEPC 50 ميكرولتر
         • 2 ميكرولتر الجليكوجين (20 ملغ / مل)
         • 0.6 وحدات التخزين (37.2 ميكرولتر) 5M خلات الأمونيوم
         • 2.5 حجم (~ 180 ميكرولتر) الباردة الايثانول
      3. يعجل في -80 درجة مئوية (30 دقيقة. إلى O / N) *.
      4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      5. إزالة طاف بيليه ويغسل مع الايثانول ميكرولتر 800 70 ٪ (في المياه مجانا nuclease). تأكد تماما لطرد بيليه لإزالة كل من الملح الزائد.
      6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      7. إزالة طاف والهواء الجاف 15-20 دقيقة.
      8. Resuspend بيليه في 4 nuclease ميكرولتر المياه مجانا.
   5. الطريقة الثانية :
      1. بدلا من ذلك ، يمكن تنظيف آرنا مع استخراج القياسية الفينول / الكلوروفورم.
         • إضافة الماء DEPC 50 ميكرولتر
         • 2 ميكرولتر الجليكوجين (20 ملغ / مل)
         • 0.6 وحدات التخزين (37.2 ميكرولتر)5M خلات الأمونيوم
         • 1 حجم (98 ميكرولتر) الفينول : كلوروفورم : كحول أيزو أميلي 25:24:1 (معايرتها إلى 7،8-8،0 درجة الحموضة)
      2. دوامة لمدة 15 ثانية. أجهزة الطرد المركزي مقابل 1.5 دقيقة في نصف السرعة القصوى في جدول microcentrifuge العلوي. نقل الطبقة العليا مائي لأنبوب جديد يحتوي على وحدات التخزين 2.5 (245 ميكرولتر) من الايثانول الباردة.
      3. يعجل في -80 درجة مئوية (30 دقيقة. إلى O / N).
      4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      5. إزالة طاف بيليه وتغسل بالايثانول ميكرولتر 800 70 ٪ (في المياه مجانا nuclease). تأكد تماما لطرد بيليه لإزالة كل من الملح الزائد.
      6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      7. إزالة طاف والهواء الجاف 15-20 دقيقة.
      8. Resuspend بيليه في 4 nuclease ميكرولتر المياه مجانا.
         
         * يجوز للتجميد في هذه العينة درجة الحرارة خلال حضانات بين عشية وضحاها. وقد تبين أن هذا يمكن أن تزيد في الواقع نتاج الأحماض النووية.
4. الجولة الأولى 2 التوليف حبلا [كدنا]
   1. • على الجليد
      • إضافة 1 الاشعال عشوائية ميكرولتر (0.05 ملغ / مل) *
   2. الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. المكان فورا على الجليد لمدة لا تقل عن 5 دقائق.
   3. • إضافة 2 ميكرولتر 5X العازلة حبلا الأولى
      • 1 DTT ميكرولتر (100 ملم)
      • 0.5 ميكرولتر dNTP ل(2.5 ملي مول لكل منهما)
      • 0.5 RNasin ميكرولتر (40 U / ميكرولتر)
      • 1 ميكرولتر مرتفع الثالث (200 U / ميكرولتر)
   4. مزيج دقيق من قبل pipetting وتدور لفترة وجيزة. السماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. هذه الخطوة مطلوبة للسماح بتمديد الاشعال العشوائية قصيرة قبل تنفيذ رد فعل عكس النسخ.
   5. احتضان لمدة 30 دقيقة في 42 درجة مئوية.
   6. 5 دقائق على حرارة 95 درجة مئوية لتفسد في الحمض النووي الريبي DNA / RNA الهجينة. مكان على الجليد لمدة لا تقل عن 5 دقائق. المحل في -20 درجة مئوية ، أو -80 درجة مئوية ، أو أن تواصل على الفور إلى الخطوة التالية.
      
      * تركيز الاشعال العشوائي هو المهم. إذا كان تركيز عال جدا ، وسوف يكون المنتج أكثر اقتطاع مع كل جولة من التضخيم.
5. الجولة الثانية 2 التوليف حبلا [كدنا]
   1. • على الجليد
      • إضافة 2 ميكرولتر T7 - ​​بنسبة ضئيلة (DT) التمهيدي (10 نانوغرام / ميكرولتر) *
   2. الحرارة لمدة 5 دقائق على 70 درجة مئوية. المكان فورا على الجليد لمدة لا تقل عن 5 دقائق. تدور لفترة وجيزة.
   3. • إضافة 43.5 ميكرولتر المياه مجانا nuclease
      • 15 ميكرولتر 5X العازلة حبلا الثانية
      • 1.5 مزيج dNTP ميكرولتر (2.5 ملي مول لكل منهما)
      • 2 بوليميريز الحمض النووي ميكرولتر الأول (يو 10 / ميكرولتر)
   4. مزيج دقيق من قبل pipetting وتدور لفترة وجيزة. احتضان لمدة 2 ساعة على 16 درجة مئوية.
   5. إضافة 2 ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي T4 (5 U / ميكرولتر)
   6. مزيج دقيق من قبل pipetting وتدور لفترة وجيزة. احتضان أكثر 10 دقيقة في 16 درجة مئوية.
   7. تنظيف رد الفعل باستخدام Minelute Qiagen عدة كما هو الحال في القسم 6.2.3.
   8. تركز ل04/02 ميكرولتر مع هطول الأمطار أو Speedvac الإيثانول كما في القسمين 6.2.4 إلى 6.2.8.
      
      * ملاحظة تركيز مختلفة من الأسهم بنسبة ضئيلة - T7 (DT) مقارنة التمهيدي الجولة الاولى التوليف الشق الثاني [كدنا].
6. الجولة 2 في النسخ المختبر
   تنفيذ كما في القسم 6.3.
   1. تكرار مقاطع 6،4-6،6 العدد المرغوب فيه من المرات. علما بأن كل جولة لاحقة من النتائج التضخيم في المنتجات أقصر آرنا. وينبغي أن يقتصر عدد جولات من التضخيم لهذا السبب. عادة ، واثنين الى ثلاث جولات من التضخيم هي كافية لتضخيم المادة تحصد من خلية واحدة لإجراء تحليل ميكروأري. في حالة تحليل ميكروأري ، يتم تنفيذ رد فعل IVT ثالث جولة باستخدام الحمض النووي الريبي التضخيم البورشيد TotalPrep كيت وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. يتضمن هذا الإجراء البيوتين المسمى UTP في آرنا ثم يستخدم للكشف على شريحة ميكروأري.
   2. قياس تركيز آرنا الجولة الثالثة باستخدام Nanodrop أو Bioanalyzer اجيلنت مع مجموعة RNA نانو.

7. ممثل النتائج

يمكن أن تكتمل الحصاد الناجح من خلية واحدة من ثقافات العصبية الأولية في أقل من 2 دقيقة ، اعتمادا على الكفاءة (انظر الشكل 1). ومع ذلك ، فإن الوقت المناسب لموسم الحصاد تختلف بين الأنظمة والتدخل مع التلاعب التجريبية. تعريض خلية واحدة لإجراء آرنا (انظر الأرقام 4A و 4B) ينتج كميات ميكروجرام من الكل آرنا تضخيمها وتنتج ذروة مميزة واسعة عند تحليلها مع bioanalyzer (انظر الشكل 3). يمكن أن تكتمل في ثلاث جولات على الأقل لمدة ثلاثة أيام ، مما يسمح للتحليل سريع وحيدة الخلية التعبير الجيني.

الشكل 1. ظاهر هو مثال لنجاح موسم الحصاد من الخلايا العصبية معزولة. نحن سيليالمديرية المنطقة ذات الكثافة المنخفضة نسبيا (A) ومتقدمة نحو غيض ماصة الخلية المطلوب (B). الصورة الثالثة (C) يبين كان حصاد مجال الرؤية بعد الخلية. علما أن عمليات المحيطة تبقى على ساترة.

الشكل 2. ظاهر هما صورا لنصائح ماصة ، والتي هي غير ملائمة لحجم حصاد فعالة. هذه النصائح سوف يؤدي إلى عدم اكتمال حصاد (A) وحصاد المحيطة الوسط (ب) على التوالي.

ينصح الرقم 3. وبعد الحصاد والتضخيم التحليل ، وذلك باستخدام bioanalyzer لدراسة توزيع وكمية من الحمض النووي الريبي تضخيمها. وهناك تضخيم الناجح من خلية واحدة العائد المادي مجموع المبالغ في ميكروغرام منخفضة ، وسوف يكون التوزيع الذي تم بشكل سلس واسعة.

4 شخصيات ، وتظهر مخططات من الدور الاول (A) والجولة الثانية (باء) من إجراء آرنا.

Discussion

ملاحظات وأخطاء

• قد ترغب في اتخاذها قبل وبعد عرض الصور التي تم عزل الخلايا المستهدفة والتي تم يمسها في غبش المتبقية.
• إذا كان حل الكثير من يدخل ماصة كما كنت الحصاد ، يمكنك استخدام طريقة 3 Luer لوك التجهيزات والمكبس للحقنة لاجراء الضغط الايجابي في الأنابيب. فإن حجم المطلوب تختلف مع نوع من المعالجة ولكن ما يصل إلى 5 ميكرولتر ينبغي أن يكون على ما يرام بالنسبة لمعظم التطبيقات.

نصائح عامة حول التقنيات البيولوجية الجزيئية

• دوامة جميع أنابيب الأسهم وتدور عليهم قبل إضافة إلى رد الفعل. NEVER الانزيمات الدوامة.
• ردود الفعل مزيج دقيق قبل إضافة انزيم لضمان أن المخزن هو في التركيز السليم.
• الانزيم في الحفاظ على مخزون -20 درجة مئوية إذا كان ذلك ممكنا باستخدام stratacooler. خلاف ذلك ، وإزالة الحق قبل الاستخدام ، والحفاظ على الجليد ، والعودة فورا إلى -20 درجة مئوية.
• يمزج دائما الرئيسي عند إعداد أكثر من رد فعل للحد من الأخطاء pipetting. حساب حجم المطلوبة استنادا إلى عدد من العينات وتضيف 10-20 ٪.
• تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية إلى تأخير التدهور. الحمض النووي الريبي هو الأكثر استقرارا المخزنة في المخزن المؤقت لapurination تؤخر من الحمض النووي الريبي الذي يحدث في الظروف الحمضية.

عام الخطوط العريضة للإجراءات آرنا

ويوضح الشكل 4A الجولة الأولى من الإجراء آرنا. في رد فعل حبلا الأول ، الجزء بولي - T من التمهيدي (DT) T7 - ​​بنسبة ضئيلة لتحديد الأنواع مرنا (مستطيل أبيض طويل) ملزمة لذيول polyA. ومذيل بعديد الأدينيلات أيضا بعض microRNAs وسوف يتم القبض على هذا الإجراء. الأهم من ذلك ، ومع ذلك ، فإن الرناوات الأكثر وفرة في الخلية ، الرنا الريباسي ، لا. هذه جزئية بمثابة التمهيدي للالناسخ العكسي لتجميع حبلا التكميلية لل[كدنا] (الطويل المستطيل الرمادي) باستخدام مرنا كقالب. الجزء التمهيدي من T7 (DT) T7 - ​​جزئية تتضمن بوليميريز RNA T7 المروج في الإطار مع العقاقير تسلسل مرنا للانطلاق. ويستخدم هذا لاحقا في رد فعل في المختبر النسخ.

المقبل ، ومرنا في مرنا الهجين / الحمض النووي التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة محملئا جزئيا H ريبونوكلياز خلق الحمض النووي الريبي "الاشعال" (مستطيلات صغيرة بيضاء) مشابهة إلى شظايا أوكازاكي إنشاؤها في متخلفة حبلا توليف الحمض النووي. البلمرة DNA الأول يستخدم لتجميع شظايا الحمض النووي الريبي DNA الوزراء باستخدام الحمض النووي مكملة لمرنا كقالب. عندما تصل إلى تفتيت الحمض النووي الريبي المقبل ، في 5 'إلى 3' nuclease النشاط يزيل ribonucleotides واستبدالها deoxyribonucleotides. يضاف إلى الحمض النووي يغاز ligate أي فروع فيها استبدال حبلا الرائدة ليست كاملة. يضاف T4 البلمرة DNA لملء في المناطق التي كانت بمثابة شظايا الحمض النووي الريبي الاشعال الأولية لالبلمرة DNA أنا خلق كليلة العضوية المزدوجة [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل التي تتم تنقيته ثم قبل تنفيذ رد فعل IVT.

في رد فعل IVT ، T7 بوليميريز RNA بربط المروج T7 دمجها المزدوج تقطعت بهم السبل [كدنا] ويجمع جزيئات الحمض النووي الريبي العقاقير (مستطيلات سوداء طويلة) باستخدام حبلا الشعور كقالب. هذا بمثابة خطوة التضخيم التي تنتج الآلاف من جزيئات الحمض النووي الريبي العقاقير من كل جزيء الذين تقطعت بهم السبل المزدوج [كدنا] (الشكل 4A).

الجولة الثانية ، كما هو مبين في الشكل 4B ، ويبدأ مع رد فعل عكس النسخ التي تختلف قليلا عن تلك الجولة الاولى منذ البداية هي العقاقير RNA (مستطيل أسود خالص) ، ويفتقر إلى ذيل مذيل بعديد الأدينيلات أنه كان مستهدفا من قبل T7 - ​​بنسبة ضئيلة (DT) التمهيدي في الجولة الاولى. لذلك ، وتستعد هذا التفاعل مع الاشعال العشوائي (مستطيلات صغيرة رمادية) والحمض النووي الريبي التشويه والتحريف لاحقا. وتستعد ثم رد فعل من جانب الشق الثاني التمهيدي (DT) T7 - ​​بنسبة ضئيلة ، والذي يربط تسلسل بولي في نهاية A - 3 'من الحمض النووي الريبي الشعور إنشاؤها في رد فعل عكس النسخ السابقة. يتم تنفيذ رد فعل آخر IVT بنفس الطريقة كما في الجولة الاولى. وعادة ما يتم تكرار هذه الجولة الثانية على الأقل مرة واحدة لتحقيق ثلاثة جولات من التضخيم من خلية واحدة.

تطبيقات

يمكن ترجمتها التقنيات التي قدمناها في هذه المقالة إلى عدد كبير من التطبيقات. يمكن تعديل بروتوكول العزلة خلية واحدة لاستخدامها في شرائح حادة. ¹⁴ على الرغم من أن أكثر تحديا من الناحية التقنية ، وتطبق المبادئ نفسها في إعداد هذا البديل. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم تعديلها بشكل طفيف في حجم ماصة ، يمكن إجراء تسجيلات لعلم وظائف الأعضاء من الخلايا قبل الحصاد السماح بإجراء تحقيق جيدا للسيطرة الآليات الجزيئية وراء مخرجات الفسيولوجية. آخر تعديل طفيف هو عزل العمليات سوما من الخلية. ¹⁵ لهذا التطبيق ، وجمع الهيئات خلية واحدة ماصة ثم نعود مع ماصة الطازجة وجمع 100-300 dendrit المحددةوفاق أو المحاور في أنبوب جمع ^(16).

بمجرد أن يتم حصاد الخلايا ، ويمكن إجراء مقارنات بين تركيزات مرنا وبين مختلف مكونات وحتى داخل نفس الخلية السكان. دمج biotinylated - UTP آرنا في الجولة الثالثة يسمح للتحليل [ميكروأري لتحديد هذه الكميات المتوفرة مرنا نسبيا. يمكن أيضا أن التركيبة السكانية الأصلية مرنا يتحدد بعد العملية آرنا باستخدام التسلسل التالي جيل. يمكن أيضا أن تستخدم آرنا تضخيم لتأكيد دراسات الخلايا تحويل النمط الظاهري الذي يتم transfected مجموعة كاملة من mRNAs من نوع خلية واحدة إلى نوع من الخلايا المختلفة من أجل إحداث الانتقال من النمط الظاهري من النوع الأخير إلى أن الخلية من السابق ، الإجراء الذي وضعه مختبر والمعروف TIPeR ^(17). هذه الدراسات مفيدة بشكل خاص لدراسة الحالات المرضية والظواهر الخلية ومثل هذه الدراسات ما زالت جارية في الوقت الراهن في المختبر. لا يمكن أن يؤديها RT - PCR أو qPCR على المواد تضخيم لتأكيد تعبير عن خلية محددة الجينات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء تقييمات لكفاءة ترنسفكأيشن أو تنبيغ على مستوى خلية واحدة.

المزايا والقصور

كما جاء في الملخص ، والعزلة واحدة من الخلايا لتحليل يلغي الآثار المشاهدة في المتوسط ​​مع تحليل للسكان الخلية غير المتجانسة. هذه الآثار متوسط ​​تركيزات تحريف مرنا داخل خلية واحدة أكثر من النصوص التي تمثل في المتوسط ​​وفيرة والخروج ومنع الكشف عن محاضر منخفضة وفرة كثيرة. يمكن أن تستخدم التدفق الخلوي لفرز الخلايا الفردية ، ولكن هذا الأسلوب يتطلب معرفة علامات معينة الخلايا ومعدات باهظة الثمن. microdissection التقاط ¹⁸ ليزر الأشعة فوق البنفسجية سواء مع أو الأشعة تحت الحمراء نظم الليزر microdissection التقاط تسمح للخلية واحدة ، وحتى التقاط التحت خلوية ولكنها تتطلب الخلايا التي تهم أن يكون موجودا على سطح المقاطع رقيقة جدا ^(19). مماثلة لالتدفق الخلوي ، ليزر microdissection التقاط كما يتطلب معدات باهظة الثمن.

واحدة من الفوائد الرئيسية لتقنية جمع الكهربائي القائمة المذكورة أعلاه هو أنه يمكن الحصول على بيانات قيمة الكهربية من خلية من الفائدة قبل الحصاد ، مما يسمح للتحليل وظيفي وtranscriptome التي يتعين القيام بها في الخلية نفسها. ²⁰ A السلبي للتقنية لدينا أنها لا تتطلب خبرة في استخدام micromanipulators. سوف المحققون على دراية micromanipulators تجد هذه التقنية بديهية جدا ، ولكن مع عدم وجود أفراد هذه التجربة سوف تحتاج لتصبح مريحة مع الحركات الدقيقة المطلوبة.

المتأصلة في أي أسلوب التضخيم هو تضخيم التفضيلية لبعض النصوص على أساس حجم وتكوين النوكليوتيدات. ^4،6،7 تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) التقنيات التي تعتمد مثل عكس النسخ بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (RT - PCR) والتضخيم السريع ل[كدنا] تاريخ (العرق) نتيجة التضخيم في الأسي النصوص ، في حين أن تضخيم النتائج آرنا الإجراء في تضخيم الخطية. وهكذا ، واحدة من أهم مزايا هذا الإجراء آرنا يكمن في قدرتها على الحفاظ على أفضل وفرة نسبية من النصوص التي كتبها مرنا فقط تضخيم خطيا أي أخطاء أو التحيزات التي تحدث في عملية التضخيم في مقابل تضخيم الأخطاء بشكل كبير وقال والتحيز.

الإجراء آرنا مقرونا تحليل ميكروأري يسمح للمقارنة بين تركيزات مرنا بين الخلايا واحد من التشكل مماثلة أو مختلفة ، معالجة أو غير معالجة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقديم مواد تضخيم لتسلسل الجيل القادم. ^5،8 ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر في مثل هذه التحليلات لأنه ، في المقابل الى استخدام بادئات عشوائية لإجراء العملية ، الإجراء بنسبة ضئيلة من DT معبي المذكورة أعلاه التضخيم من التحيزات "3 نهايات مرنا والنتائج عموما في تقصير طفيف في المواد اللاحقة تتضخم مع كل جولة. وينبغي توخي الحذر في تحليل النتائج ميكروأري مع الأساليب القياسية كما تغيب بعض المكالمات كاذبة يمكن أن تنشأ عن تقصير بعض الشيء المادي تضخيمها. بالإضافة إلى ذلك ، في حين تتابع نتائج ستوفر بالفعل 5 كامل قد 'تسلسل معظم مرنا الأصلي ، 5' ينبغي تفويتها تسلسل بعض مرنا. لهذه الأسباب ، ينبغي أن يقتصر عدد جولات من التكبير.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spiegelgas coverslips	Carolina Biological	63-3029
Nunc 35x10 mm culture dishes	Fisher Scientific	12-565-90
Water for cell culture	Lonza Inc.	17-724Q	For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips
Poly-D-Lysine MW70-150K	Sigma-Aldrich	6407
Laminin, ultrapure	BD Biosciences	354239
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0252
MEM with Earle’s salts and glutamax	Invitrogen	41090-101	For plating cells
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8769
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Horse serum	Invitrogen	16050
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C1768
MEM with Earle’s salts and L-glutamine	Invitrogen	11095-098	For growing cells
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)	Kimble Chase	34500 99	Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained.
HBSS	Invitrogen	14175	Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)
1ml syringe	BD Biosciences	309628
Needle	BD Biosciences		Gauge depends on the diameter of the pipettes
dNTP mix	Amersham	28-4065-51
dt-T7 oligo	Custom	Midland Certified
Second strand buffer (5x)	Invitrogen	Y01129
DTT			Supplied with second strand buffer
E.coli DNA Ligase	Invitrogen	100002324
DNA polymerase I	Invitrogen	100004926
Rnase H	Invitrogen	18021-071
Megascript T7 kit	Ambion	AM1334
Random primers	BMB	11034731001
Superscript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	56575	in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT
MEGAclear Kit	Ambion	1908
MinElute Reaction Cleanup Kit	Qiagen	28206
T4 DNA polymerase	Invitrogen	100004994
Rnasin	Promega Corp.	N251B
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit	Ambion	AMIL1791
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-87	Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook
Micromanipulator	Olympus Corporation		Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models
Pipette Holder	Warner Instruments	MP-S15A	Will vary with micromanipulator and pipette O.D.
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511