تلفيق Micropatterned الهلاميات المائية لأنظمة الثقافة العصبية الديناميكية باستخدام الطباعة التصويرية إسقاط القناع

Summary

موصوفة تقنيات بسيطة لإنتاج أنظمة السريع لmicrofabricated ثقافة العصبية باستخدام جهاز رقمي لديناميكية micromirror قناع الطباعة الحجرية الإسقاط على ركائز الثقافة العادية الخلية. قد تكون هذه النظم ثقافة تكون أكثر تمثيلا للهندسة البيولوجية الطبيعية ، ويمكن تكييف التقنيات وصف للعديد من التطبيقات.

Abstract

على نحو متزايد ، منقوشة بيئات زراعة الخلايا أصبحت تقنية ذات الصلة لدراسة الخصائص الخلوية ، والعديد من الباحثين يعتقدون في حاجة لبيئات 3D تمثل في التجارب المختبرية التي تحاكي أفضل في الصفات المجراة ^1-3. وقد أظهرت الدراسات في مجالات مثل أبحاث السرطان ⁴ ، ⁵ الهندسة العصبية والقلبية الفيزيولوجيا ⁶ ، والتفاعل خلية مصفوفة ^7،8 سلوك الخلية تختلف اختلافا كبيرا بين الثقافات التقليدية ويبني أحادي الطبقة 3d.

وتستخدم الهلاميات المائية والبيئات 3D بسبب مرونتها والتنوع والقدرة على التركيب الجزيئي ترزي خلال functionalization ^12/09. العديد من التقنيات المتبعة لإنشاء بنيات والخلية الداعمة للمصفوفات ، بما في ذلك electrospinning ¹³ ، طوابع الاستومر ¹⁴ ، ¹⁵ الطباعة النافثة للحبر ، photopatterning المضافة ¹⁶ ، الإسقاط الضوئية الرئيسية ثابتة الطباعة الحجرية - ¹⁷ ، ودينامية microstereolithography قناع ^18. للأسف ، هذه الأساليب تشمل عدة خطوات الإنتاج و / أو المعدات التي لا قدرة على التكيف بسهولة إلى الخلية التقليدية وطرق زراعة الأنسجة. التقنية المستخدمة في هذا البروتوكول تتكيف مع هذا الأخير طريقتين ، وذلك باستخدام جهاز micromirror الرقمية (DMD) لإنشاء (Photomask) الزجاجية دينامية محددة للهندسيا يشابك الهلاميات المائية (PEG) بولي (جلايكول الإثيلين) ، الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية من خلال البلمرة الراديكالية الحرة بدأت. في "2.5D" الناتجة هياكل توفير بيئة مقيدة 3D للنمو العصبي. علينا اتباع نهج هيدروجيل المزدوجة ، حيث PEG بمثابة هيكل الخلية المنطقة مقيدة للتوريد إلى هلام الذاتي تجميع خلاف ذلك ولكن لا شكل خلية تساهلا من صنع إما من Puramatrix أو agarose. العملية بسيطة وسريعة تلفيق خطوة واحدة وهو تكرار للغاية وتكييفها بسهولة للاستخدام مع الطرق التقليدية لزراعة الخلايا وركائز.

يمكن إدراجها explants النسيج كله ، مثل العقد الجذرية الجنينية الظهري (DRG) ، في بنيات هيدروجيل مزدوج لفحوصات تجريبية مثل ثمرة neurite. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تغليف الخلايا في فصل هيدروجيل photocrosslinkable البلمرة أو ذاتية ، أو التقيد بشكل انتقائي لدعم نفاذية الغشاء الخلوي باستخدام photopatterning تقييدا. باستخدام DMD ، أنشأنا هيدروجيل يبني حتى 1MM ~ سميكة ، ولكن رقيقة (<200 ميكرون) كانت محدودة هياكل الربط بواسطة التبريد الأكسجين للتفاعل البلمرة الراديكالية الحرة. بعد ذلك قمنا بتطوير تقنية الاستفادة من وجود طبقة من النفط فوق السائل الذي سمح البلمرة بلمرة رقيقة بنية الربط.

في هذا البروتوكول ، ونحن تصف خلق السريع للنظم هيدروجيل 3D لإنتاج الخلايا العصبية microfabricated والثقافات الأنسجة. ويبني هيدروجيل أثبتت المزدوج هنا تمثل تنوعا في النماذج المختبرية التي قد تكون مفيدة للدراسات في علم الأعصاب التي تنطوي على بقاء الخلية ، والهجرة ، و / أو النمو neurite والتوجيه. وعلاوة على ذلك ، كما يمكن أن تعمل على بروتوكول لكثير من أنواع الخلايا والهلاميات المائية ، والتطبيقات المحتملة على حد سواء متنوعة واسعة.

Protocol

1. DMD الإعداد

1. تقام كل لوحة DMD ، دليل ضوء الأشعة فوق البنفسجية (مع ميزاء) و4X عدسة الهدف عموديا على طاولة الاهتزاز العزلة.
2. ينبغي تعديل دليل ضوء الأشعة فوق البنفسجية بحيث يضرب الضوء على مجموعة مرآة بزاوية 45 درجة بالنسبة إلى الطائرة من المرايا ، و24 درجة تحت الطائرة من المرايا (الشكل 1).
3. هي التي شنت العدسة الهدف بحيث تكون المسافة من نائب العضو المنتدب لعدسة الهدف يتوافق مع طول بؤري المرتبطة العدسة.
4. يتم وضع مقلوب تحت المجهر عدسة موضوعية ، بحيث تركز الضوء المنعكس من DMD يمكن تصور من خلال المجهر. وينبغي أن المسافة من عدسة الهدف على السطح البلمرة تتوافق تقريبا المسافة عمل العدسة. ويمكن بعد ذلك المرحلة على المجهر يمكن استخدامها لضبط هذه المسافة إلى التركيز بدقة الصورة. قد تختلف هذه المسافة على سطح البلمرة المختار.

2. يبني هيدروجيل المزدوج للثقافات يزدرع الأنسجة

ألف التصاق DRG يزدرع

1. معطف جدران 6 مغلفة جيدا الكولاجين إدراج الثقافة الخلية (كورنينج) مع X - هطول أمطار ، مع الحرص على تجنب الغشاء نفسه. (بدلا من ذلك ، يمكن استخدام قلم حاجز مسعور).
2. هيدرات يدرج بين عشية وضحاها مع 1.5 مل من التصاق المتوسطة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2. التصاق المتوسطة متوسطة neurobasal مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ ، 1 ٪ البنسلين / ستربتوميسين 0.5mM L الجلوتامين ، و 20 ميكروغرام / مل NGF.
3. حصاد الجذرية الظهرية الجنينية العقد (DRG) من الجراء E - 15 الفئران. وينبغي أن يدرج على مطلي DRG الكولاجين 6 - جيدا مغلفة ، ما يصل الى أربعة في إدراج.
4. إدراج احتضان لمدة 2 ساعة للسماح للDRG التمسك الغشاء.

باء بلمرة ضوئية المنشأ الحيوي قناع

جهاز micromirror الرقمية (DMD) هو 1024 × 768 مجموعة من المرايا الفردية ، مماثلة لتلك التي في التلفزيونات الإسقاط ، الأمر الذي يعكس الضوء بشكل انتقائي على أساس موقف المرآة. لأغراضنا ، يتم استخدام DMD الضوء على نمط (UV) فوق البنفسجية على photocrosslinkable الهلاميات المائية ، وخلق هيدروجيل specifiable هندستها بطريقة بسيطة وسريعة. الشكل 1 يصور الإعداد من مسار الضوء ونائب العضو المنتدب للأشعة فوق البنفسجية. على الرغم من إعلان الدوحة الوزاري لدينا وحدة قائمة بذاتها ، ويمكن أيضا أن يكون الجهاز متكامل للاستخدام مع المجاهر القائمة طويلة.

1. إزالة كافة السائل الفائض من إدراج وإضافة 500 ميكرولتر المتوسطة البلمرة داخل إدراج. البلمرة المتوسطة يحتوي على 10 ٪ PEG (MW 1000) وبنسبة 0.5 ٪ Irgacure 2959 الذائبة في المتوسط ​​neurobasal تستكمل مع 20 ميكروغرام / مل NGF والقلم 1 ٪ / بكتيريا.
2. وضع الجهاز تحت إدراج DMD على شريحة أمطار - X الزجاج المعالجة.
3. تحميل الصور المناسبة باللونين الأسود والأبيض ليتم استخدامها ك "الضوئية الرئيسية" في إعلان الدوحة الوزاري ، من خلال استخدام البرنامج يتضمن واجهة المستخدم الرسومية ALP - 3 الأساسية. لأغراضنا ، تم اختيار الشكل bifurcating للسماح لتنفيذ نظم التوجيه neurite.
4. باستخدام مجهر مقلوب عن التصور ، محاذاة explants الأنسجة مع المكان المناسب على الضوئية الرئيسية باستخدام مصدر الضوء المرئي المنعكس من DMD.
5. تبديل مصدر الضوء المرئي لمصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، وتسليط الضوء على الحل حتى PEG يشابك كافية. (للاطلاع على ظروف معينة و 5.0 واط / سم ² الحادثة على DMD ، ويمكن الانتهاء يشابك في اقل من 55 ثانية). كرر لجميع DRG الأربعة على إدراجه.
6. يغسل كل إدراج ثلاث مرات مع DPBS معقمة و 1 ٪ القلم بكتيريا.
7. إضافة 1.5mL المتوسطة النمو تحت إدراج خلية ثقافة ، والسماح للتوازن في حاضنة لمدة 30 دقيقة. متوسط ​​النمو المتوسطة neurobasal تحتوي على B - 27 2 ٪ ، 1 ٪ القلم / بكتيريا ، 0.5mM L الجلوتامين ، و 20 ميكروغرام / مل NGF.

جيم هيدروجيل الثانوية

Puramatrix

1. لتطبيقات الخلايا العصبية ، هو المخفف Puramatrix 1 ٪ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة إلى 0.15 ٪ في العقيمة O ₂ H وتستكمل مع laminin ميكروغرام / 1 مل قابلة للذوبان.
2. يجب إزالة جميع وسائل الإعلام الفراغات الزائدة من الربط ، والتي تحتوي على explants DRG ، وذلك باستخدام القطن المعقم غيض التطبيقية ، Kimwipe ، أو micropipette.
3. يضاف إلى فراغات Puramatrix الربط مع micropipette من أجل ملء الفراغ دون فيضان. اعتمادا على حجم الفراغ ، وعادة ما يستخدم ~ 1 ميكرولتر لكل بناء.
4. Puramatrix تبدأ عملية التجميع الذاتي فور اتصال مع محلول الملح الفسيولوجي ، أي الربط متورمة ، ولكن يضاف 1.5 مل من متوسط ​​النمو تحت إدراج وضعها في حاضنة لمدة ساعة واحدة لضمان تهليم الإجمالي.
5. في البداية ، Puramatrix حامضي قليلا ، وتغير ذلك وسائل الاعلام بعد ساعة واحدة للسماح للتوازن درجة الحموضة.
6. تغييرات مطلوبة وسائل الاعلام تقريبا كل 48 ساعة. كن حذرا من أن جميع وسائل الاعلام هووأضاف تحت إدراج ، لحماية سلامة Puramatrix ضعيفة ميكانيكيا.

Agarose

1. لتطبيقات الخلايا العصبية ، هو المخفف agarose إلى حل 1 ٪ في متوسط ​​النمو وضعها في حوض الحمام 60 درجة مئوية الماء حتى يذوب تماما agarose (~ 1 ساعة). وتستكمل ثم حل مع 1 ميكروغرام / مل laminin للذوبان.
2. يجب إزالة جميع وسائل الإعلام الزائدة من فراغات PEG.
3. يضاف إلى فراغات Agarose PEG من أجل ملء الفراغ دون فيضان. اعتمادا على حجم الفراغ ، وعادة ما يستخدم ~ 1 ميكرولتر لكل بناء.
4. 1.5 مل من متوسط ​​النمو قبل المبردة (8 ° C) في لوحة 6 - جيدا ، ويتم نقل إدراج agarose تحتوي على وسائط الإعلام المبردة وحفظها في الثلاجة عند درجة 8 على الأقل ثلاث دقائق للسماح للagarose هلام.
5. أخيرا ، يتم نقل إدراج الى 1.5 مل من وسط النمو قبل تحسنت (37 درجة مئوية) والحفاظ عليها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، مع التغييرات المطلوبة وسائل الإعلام كل 48 ساعة.

3. المزدوج تغليف هيدروجيل خلية 3D

التغليف المزدوج هيدروجيل المناسب عند استخدام أي هلام الذاتي تجميع. الجل photocrosslinkable ، في هذا الربط الحالة ، بمثابة الدعم الهيكلي للعرض هندسية من هلام الذاتي تجميع ، على سبيل المثال أو Puramatrix agarose. بعض من الأساليب ، وتحديدا نوع من الجل واختيار الضوئية الرئيسية ، سيعتمد على تطبيق معين المطلوب.

1. قناع الحمل المناسبة على DMD. لبقائنا تطبيق الخلية ، ونحن ببساطة اختارت عرضا اسطواني Puramatrix للمساعدة في تصوير الخلايا. قد يشير الباحثون دراسة الخلية تكون مهتمة في الهندسة compartmental للسماح لنشر جزيئات الكيميائي. بالإضافة إلى ذلك ، تم عرض تقريبي لتطبيق الشريان لتمثيل ممكن للبحث عن الأوعية الدموية.
2. علاج جدران ثقافة إدراج البوليستر زنزانة مع X - المطر ، ومكان تحت المطر على DMD X - الشرائح المغلفة.
3. إضافة 500 ميكرولتر المتوسطة البلمرة لإدراجه. حمل يشابك PEG عن التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 55 ثانية.
4. يغسل ثلاث مرات مع DPBS معقمة و 1 ٪ القلم بكتيريا.
5. إزالة جميع وسائل الإعلام الزائدة من فراغات PEG.
6. تدور باستمرار في كثافة الخلايا المطلوب في بيليه. ويجب الحرص على إزالة كافة المتوسطة من الخلية بيليه قبل الاختلاط ، كما Puramatrix يبدأ التجميع الذاتي فور اتصال مع محلول ملحي. تستكمل تعليق الخلايا داخل Puramatrix 0.15 ٪ المخفف في العقيمة O ₂ H مع السكروز 10 ٪.
7. حقن Puramatrix / خلية / السكروز الخليط داخل فراغات في PEG.
8. إضافة 1.5 مل من متوسط ​​النمو تحت إدراج ، والسماح لهلام داخل الحاضنة لمدة ساعة.
9. تغير وسائل الاعلام بعد ساعة واحدة ، و ~ كل 48 ساعة بعد ذلك.

4. خلية واحدة تغليف هيدروجيل 3D

ومن شأن التغليف هيدروجيل واحد يكون من المناسب لأي حالة حيث يمكن فحص الخلايا داخل لهيدروجيل photocrosslinkable.

1. قناع الحمل المناسبة على DMD. دراسات لبقاء الخلية ، ونحن مرة أخرى اختار قناع الأساسية دائرية تمثل الاسطوانة. مرة أخرى يمكن أن أقنعة مماثلة لتلك التي تظهر في أسلوب 4 تطبيقها للحقل البحوث المناسبة.
2. علاج خلية ثقافة إدراج البوليستر مع X - المطر ، ومكان تحت المطر على DMD X - الشريحة المغلفة.
3. يمكن إضافة أي تركيز على الخلايا المطلوبة مباشرة إلى الحل PEG 10 ٪ ، والخلط جيدا لضمان توزيع متجانس.
4. إضافة 500 ميكرولتر المتوسطة البلمرة لإدراجه. حمل يشابك PEG عن التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 55 ثانية.
5. يغسل ثلاث مرات مع DPBS معقمة و 1 ٪ القلم بكتيريا.
6. تمتلئ المتوسطة النمو على حد سواء أدناه ، وعلى أعلى إدراج ، وتغيير كل ~ 2 يوما.

5. رقيقة البلمرة السينمائي هيدروجيل

1. قناع الحمل المناسبة على DMD.
2. علاج الكولاجين المغلفة الخلية البوليستر إدراج الثقافة مع X - المطر ، والمطر والمكان على X - الشرائح المغلفة.
3. إضافة كافية لتغطية المتوسطة البلمرة فقط الجزء السفلي من إدراج (~ 250-300 ميكرولتر لإدراج لوحة 6 أيضا). السماح لوسائل الإعلام في اختراق الغشاء لإدراج 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. إزالة الزائدة المتوسطة البلمرة من إدراج مع micropipette أو Kimwipe. إضافة كمية كافية من الأشعة فوق البنفسجية شفافة تماما النفط لتغطية الجزء السفلي من إدراجه. السماح للجلوس لإدراج 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، لفترة كافية من النفط لتشكيل طبقة مميزة فوق البلمرة تشبع المتوسطة الغشاء إدراج.
5. وضع وإدراج شريحة تحت DMD. حمل يشابك PEG عن التعرض للأشعة فوق البنفسجية. نظرا لركاكة طبقة الربط ، ويمكن الانتهاء يشابك في اقل من 15 ثانية في 5.0 واط / سم ² على الحادث DMD.
6. اغسل إدراج ثلاث مرات مع DPBS معقمة و 1 ٪ القلم بكتيريا. (إذا كان استمرار وجود رواسب دهنية هو مصدر قلق ، يمكن إضافة المنظفات معتدل مثل توين 20 (1 ٪) لغسل المنطقة العازلة).
7. تخزين إدراجها في لوحة الثقافة الأنسجة 6 - جيدا. إضافة إلى نمو الخلايا المتوسطة مع وقف التنفيذ ، في التركيز المطلوب ، وماصة حجم كاف لتعليق الخلية داخل الخلية إدراج الثقافة للحصول على كثافة الخلية المطلوبة. ثم ، يضاف ما يكفي من النمو المتوسط ​​تحت إدراج للحفاظ على بقاء الخلية بالكامل (~ 1،5 مل).
8. بعد 48 ساعة المنقضية ، وغسل إدراج ثلاث مرات مع DPBS معقمة و 1 ٪ القلم بكتيريا إلى طرد أي خلايا unadhered. تغيير وسائل الإعلام تقريبا مرة كل 48 ساعة.

6. ممثل النتائج

أمثلة هيدروجيل المزدوجة التي تحتوي على ثوابت explants DRG معروضة في الشكل 2. لاحظ أن تقتصر الهجرة الخلوية والإرشاد neurite إلى المنطقة الخلية متساهلة للهيدروجيل المزدوج بناء. الشكل 3 يصور الخلايا تنفصل مغلفة بالمثل داخل بنيات هيدروجيل المزدوجة. نظرا للطبيعة الديناميكية للDMD الضوئية الرئيسية ، يقتصر هندسة المتاحة للتغليف فقط من أبعاد وقرار البصريات. وكان من الممكن أيضا التغليف خلية داخل هيدروجيل a photopolymerizable واحد ، PEG ، وتم إجراء اختبار قابلية العيش / قتيلا كما يتضح في الشكل 4. والمقصود في التغليف PEG فقط كمثال على ذلك ، والربط لا تمثل بيئة مثالية للخلايا العصبية. ولذلك ، فإن بقاء الخلية التي تحققت في الربط يبني لدينا منخفضة مفهوم. أخيرا ، تظهر أمثلة على استخدام الأفلام PEG كما طبقة رقيقة تقييدا ​​للالتصاق خلايا منقوشة على إدراج ثقافة الخلية في الشكل 5. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم أمثلة عن النتائج الممكنة "سيئة" في الشكل 6.

النتائج لا تمثل سوى جزء صغير من الاستخدامات المحتملة للأساليب تطويرها في المختبر. ويراد منها اظهار مدى سهولة ، وبراعة واستمرارية النهج الذي نتبعه ، ويمكن أن تعامل على أنها "إثبات المبدأ" للباحثين لوضع التعديلات المحتملة الخاصة.

الشكل 1. توضيح تخطيطي لمسار الخفيفة المستخدمة لضوئيه. أقحم : ضوء الأشعة فوق البنفسجية ينير DMD بزاوية 45 درجة ، وأقل من 24 درجة الطائرة من الصفيف المرآة.

الشكل 2. النمو وصفت والانتشار في DRG تحتوي على ثوابت هيدروجيل المزدوجة. م) صور تصوير يبني بلمرة PEG (الرمادي) مع neurites المسمى مع تويولين الثالث بيتا (الأخضر) ، دابي نواة الخلية الملون (الأزرق). ترد في explants DRG Puramatrix ويقع في مناطق دائرية من نمط ، مع تزايد neurites نحو التشعب (ق).

الشكل 3. يبني هيدروجيل المزدوجة التي تحتوي على الخلايا مع المسمى AM calcein ، علامة الخلية الحية ، بعد 48 ساعة في المتوسط ​​النمو. م) متنوع الأشكال PEG ، مليئة Puramatrix فصل الخلايا العصبية التي تحتوي على DRG (~ 5x10 ³ خلية / مل).

الشكل 4. هيدروجيل واحدة تحتوي على بناء الخلايا الحية مع المسمى AM Calcein (الخضراء) والخلايا الميتة المسمى مع إيثيديوم homodimer - 1 (الحمراء) بعد 24 ساعة في المتوسط ​​النمو (5x10 ³ خلية / مل).

الشكل 5. PEG خلية تقييدا ​​بلمرة باعتبارها طبقة رقيقة باستخدام "نمط اختبار" الالتزام بشكل انتقائي خلايا نأت إلى غشاء الكولاجين المغلفة من يدعم منفذ. A ، B) وصفت خلايا حية بعد 48 ساعة مع Calcein AM (الأخضر) ، بينما وصفت الخلايا الميتة مع إيثيديوم homodimer - 1 (الحمراء). الحد الأدنى من خلية التصاق يحدث في المنطقة التي تحتوي على فيلم PEG رقيقة.

الشكل 6. صور الممثل نتائج غير مرغوب فيها. أ) بلمرة الجزئي للPEG ، مما أدى إلى الربط غير صالحة للاستعمال بناء. البلمرة غير لائق يمكن أن تحدث بسبب وجود الغضروف المفصلي في المتوسط ​​قبل البوليمر ، وكميات كافية من البلمرة المتوسطة ، وعدم كفاية التعرض للأشعة فوق البنفسجية أو التركيز غير لائق للبصريات. ب) صورة تصور يبني بلمرة PEG (الرمادي) مع neurites المسمى مع تويولين الثالث بيتا (الأخضر) ، دابي نواة الخلية الملون (الأزرق). كانت قادرة على النمو neurites خارج القنوات PEG منقوشة. غالبا ما يحدث هذا في حالة أن يفيض Puramatrix على أعلى نسبة PEG خلال الحقن.

Discussion

ويمكن استخدام الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة من قبل أي محقق تسعى بسيطة وقابلة للتكرار نظم ثقافة الخلية. نظريا ، ويرجع ذلك إلى مجموعة واسعة من الهلاميات المائية المتاحة photopolymerizable ، يمكن تكييف البيئة للسماح للاستخدام مع أي نوع من الخلايا ، بما في ذلك explants النسيج كله. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النظام المزدوج هيدروجيل تسمح للسيطرة المكانية تحسن في عرض الهلاميات المائية المصير البلمرة ، والتي تميل لتشكيل الأشكال غير متبلور من تلقاء نفسها. في "2.5D" الناتجة هيدروجيل micropatterned يبني تقديم مصفوفة 3D للنمو العصبي عرضت في تكوين 2D تمكن التقييم المجهرية مريحة. ويمكن أيضا الركيزة التي يتم بلمرة المواد الهلامية تكون متنوعة ، مما يسمح لقدر أكبر من التحكم في التصميم التجريبي. هي الأمثل طرقنا للاستخدام مع خلية ثقافة تدعم نفاذة ، كما رأينا جدوى تحسين الشكل (4) مقارنة البلمرة على الشرائح الزجاجية (لا تظهر البيانات). ومع ذلك ، قد تكون السطوح البلمرة أخرى أكثر قابلية للتطبيق لتطبيقات مختلفة : تلفيق على الشرائح الزجاجية المستخدمة في التجارب على microfluidics أو تشكيلات التجميعية الخلية ، على سبيل المثال.

وقد أدت تجربتنا مع هذه النظم الثقافة لتحديد المجالات المحتملة للصعوبة. أولا ، هناك حاجة تقنيات الحذر للحفاظ على عقم ويبني. نظرا لطبيعة ضخمة من الإعداد DMD ، فمن الصعب أن تعمل الخطوات البلمرة تحت ظروف معقمة. لمكافحة هذه المشكلة ، فإن الخطوة شطف وصفها في طرق غير مفيدة ، وينبغي استخدام المضادات الحيوية في جميع وسائل الإعلام. بالإضافة إلى ذلك ، سمك النهائي وشكل بناء بلمرة تعتمد بشكل كبير على سلوك السائل من الخليط قبل البوليمر ، وجود الغضروف المفصلي يمكن أن يؤدي إلى بنيات هلام أن تكون رقيقة جدا أو غير كامل بلمرة (الشكل 6). ويمكن اتخاذ خطوتين للحد من تشكيل هلالة داخل إدراج ثقافة الخلية. لالهلاميات المائية سميكة (> 200 ميكرون) ، والطلاء بسيطة من X - المطر حول الجدار داخل إدراج كافية. ومع ذلك ، كما هو موضح أعلاه لفترة وجيزة ، ليبني رقيقة (<200 ميكرون) ، مطلوب طبقة النفط إلى كل من التقليل من هلالة وينفي تبريد الأوكسجين من البلمرة الراديكالية الحرة. ووجد القرار أن تعتمد على السمك ، مع انخفاض في حجم ميزة تتحقق مع المواد الهلامية سمكا بصورة متزايدة. القرار تباينت أيضا اعتمادا على ما إذا كان يمثل ميزة إيجابية أو سلبية الإغاثة في هيدروجيل. ومع ذلك ، حققنا القرار كافية ليبني مع أحجام ميزة الحد الأدنى على مقياس من ميكرومتر 100 ~ باستخدام المجهر أهداف فقط كما تركز البصريات.

وقد أظهرت التجارب أن لدينا ثوابت هيدروجيل المزدوج الموصوفة هنا تمثل أساسا ممتازا لتشكيل نماذج في المختبر الأساسية للنمو neurite والتوجيه. التقنية المستخدمة micropatterning هو تكييف أساليب ^18،19 القائمة ، ولكن لدينا مجموعة المتابعة أكد بسيطة لتنفيذ تصميم وإنتاج الأمثل ليبني هيدروجيل المزدوج على إدراج ثقافة الخلية ؛ إدراج خلية ثقافة وحيوية لتحسين سلامة الخلية وكذلك كما يشابك حول explants الأنسجة الملتصقة سابقا. ويقتصر نطاق النتائج التي أبدتها مصالح مختبرنا ، إلا أننا نعتقد أن الأساليب المذكورة في هذا المنشور ستكون مفيدة للباحثين يبحثون عن وسيلة رخيصة وسريعة وسهلة نسبيا لاستخدامها في تصنيع خلية ثقافة 3D النماذج.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Micromirror Device	Texas Instruments	DLPD4X00KIT
Collagen Coated Transwell Permeable Support	Corning	3491	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Polyester Transwell Permable Support	Corning	3412	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000-036
L-glutamine	Invitrogen	25030-164
Nerve Growth Factor	Invitrogen	13257-019
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
B-27 Supplement	Invitrogen	17504-044
DPBS	Invitrogen	14190-250
Puramatrix	BD Biosciences	354250
PEG 1000	Polysciences, Inc.	15178
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals	0298913AB
Oil	Have used both canola oil and silicon oil		Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation
OmniCure Series 1000	EXFO
Rain-X