ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

Summary

علينا إثبات وجود في الجسم الحي بروتوكول electroporation transfecting لمجموعات واحد أو عقدة صغيرة من الخلايا الشبكية (RGCs) وغيرها من أنواع الخلايا الشبكية في الفئران بعد الولادة أكثر من مجموعة واسعة من الأعمار. القدرة على التسمية والتلاعب وراثيا RGCs بعد الولادة في الجسم الحي هو أداة قوية للدراسات الإنمائية.

Abstract

استهداف وتنقيح التوقعات RGC إلى الدماغ المتوسط ​​هو نظام النموذج الشعبي وقوية لدراسة أنماط كيفية الربط الدقيق لشكل العصبية خلال التنمية. في الفئران ، ويتم ترتيب التوقعات retinofugal بطريقة الطبوغرافية وشكل العين طبقات معينة في النواة الركبية الجانبية (dLGN) من المهاد وأكيمة فخمة (SC). وعادة ما يتم وضع هذه الأنماط دقيقة من الإسقاطات التي يدرسها retinofugal وسم سكان RGCs مع الأصباغ الفلورية واستشفاف ، مثل الفجل البيروكسيداز ^1-4. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب الخشنة جدا لتوفير نظرة ثاقبة التغييرات التنموية في التشكل الفردية RGC محواري الشجرة التي هي أساس تشكيل الخريطة شبكي التوضع. كما أنها لا تسمح للتلاعب الجيني للRGCs.

في الآونة الأخيرة ، أصبح electroporation وسيلة فعالة لتوفير تحكم دقيق المكاني والزماني للتسليم من الجزيئات المشحونة في شبكية العين ^11/05. البروتوكولات الشبكية الحالية electroporation لا تسمح للتلاعب الجيني وتتبع التوقعات retinofugal من كتلة واحدة أو قليل من RGCs في الفئران بعد الولادة. فقد قيل أن في فترة ما بعد الولادة electroporation فيفو ليست طريقة سليمة للtransfecting RGCs منذ كفاءة منخفضة للغاية وضع العلامات ، وبالتالي يتطلب تستهدف الأعمار الجنينية عند الأسلاف RGC تشهد التمايز والانتشار ^6.

في هذا الفيديو تصف لنا في بروتوكول electroporation فيفو لتسليم المستهدفة من الجينات ، shRNA وdextrans الفلورسنت لRGCs الفئران بعد الولادة. هذا الأسلوب يوفر فعالة من حيث التكلفة وسريعة وسهلة نسبيا منصة لفحص كفاءة المرشحين من الجينات تشارك في العديد من جوانب التنمية بما في ذلك تراجع المحوار العصبية ، المتفرعة ، التصفيح ، وتجديد وتشكيل المشبك في مراحل مختلفة من التطوير الدائرة. باختصار نحن هنا وصف أداة قيمة التي ستوفر مزيدا من الإيضاحات عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء الحسي التنمية الخريطة.

Protocol

1. معدات لانشاء Electroporation

1. الأقطاب : نحن دومون تعديل رقم 5 لاستخدام الملقط والأقطاب الكهربائية.
   1. منفصلة وتحطيم ملقط.
   2. سلك لحام في نهاية كل أوسع الشق. التفاف الأسلاك المرفقة وشوكات مع الشريط العازل ترك ما يقرب من 25-30 ملم من غيض من شوكات المكشوفة.
   3. تعديل وضع ملقط معا مرة أخرى مع أي هل البلاستيك المناسبة (مثل زر) بين اثنين إلى توفير شوكات عمل الربيع.
2. المعدات الكهربائية : نحن نستخدم مشجعا الكهربائية لإيصال النبضات الحالية لelectroporation ورصد الذبذبات الصوتية لتأكيد والموجي وعدد من البقول التي يجري تسليمها.
   1. بتوصيل سلك من الشق من ملقط لدواسة القدم التي ترتبط أيضا في سلسلة مع منشط. على دواسة القدم بمثابة التبديل. الاكتئاب عند اكتمال الدائرة انها لelectroporation.
   2. بتوصيل سلك من الشق الآخر في مشجعا الكهربائية.
   3. توصيل منشط للورصد الذبذبات الصوتية.
3. Micropipette حاقن وانشاء : نحن نستخدم الزجاج الحادة ماصات سحبت ونظام Nanoinject حاقن الثاني لحقن كميات صغيرة جدا من الحمض النووي أو حل صبغة مباشرة في شبكية العين.
   1. جبل حاقن النظام على micromanipulator من 3 محاور.
   2. سحب ماصات زجاجية مع تفتق طويل وطرف صغير.
   3. اعادة ملء ماصة انسحب مع الزيوت المعدنية وآمنة لحاقن (لمزيد من التفاصيل انظر Nanoinect دليل التعليمات الثاني).
   4. باستخدام مقص حاد microdissecting ^قطع غيض من ماصة ، وخلق فتحة صغيرة (~ 2-3 ميكرومتر).
   5. ملء ماصة مع المبلغ المطلوب من خلال حقن محلول غيض من ماصة. طالما ان سلامة يحمل الطرف ، ويمكن استخدامه لحقن متعددة والحيوانات.
      ملاحظة : ط) ضمان أن يتم تحميل ما يكفي من الحقن في حل مثل هذه النصائح التي لم تحقن ردم الزيوت المعدنية في العين. ب) والثاني Nanoinject النظام والمعدات الالكترونية المستخدمة محددة في هذا الفيديو ليست مهمة لتحقيق النجاح في وضع العلامات RGCs. ويمكن أيضا حقن مصنوعة من الأجهزة الأخرى مثل picospritzer وelectroporation مع التحفيز والتشجيع مشتركة أخرى يمكن استخدامها لRGCs التسمية.

2. البلازميد حلول لوصفها RGC

1. لوصفها مجموعات صغيرة من RGCs : نحن نستخدم بناء EGFP الترميز (~ 2-3 ميكروغرام / ميكرولتر) تعزيز البروتين الفلوري الأخضر) الخاضعة لسيطرة أحد المروجين CAG (دجاج β - أكتين المروج مع محسن CMV الفورية المبكرة). غير الموسومة EGFP مع تسلسل palmitoylation 43 - GAP (نمو بروتين يرتبط - 43) استهداف لغشاء الخلية (mut4EGFP) ^12. هذا ويشار إلى أنه بناء pCAG - gapEGFP.
2. لوصفها خلية واحدة : نحن نستخدم مزيج من اثنين من بنيات. الموجه الأول هو مروج CAG الدافعة لجنة المساواة العرقية recombinase (pCAG - لجنة المساواة العرقية ، Addgene [كامبريدج ، MA] البلازميد 13775) ⁽¹³⁾ والثاني يحتوي على ناقلات الكاسيت STOP floxed تليها غشاء استهدفت EGFP (pCAG - LNL - gapEGFP). يستخدم pCAG - لجنة المساواة العرقية (~ 0.15-ng/μL) في تركيز حوالي 1،000-10،000 أضعاف أقل من pCAG - LNL - gapEGFP (~ μgμL 1-2) ، حصر قوية التعبير EGFP على عدد صغير من الخلايا (بحكم المنخفض نسبيا ، لجنة المساواة العرقية pCAG التركيز).

3. حقن في شبكية العين والبروتوكول Electroporation

1. يوم بعد الولادة 0 (P0) لالجراء P5 هي تخدير بواسطة حرارة الجسم ، في حين أن الفئران الأكبر سنا من P5 هي حقنة تخدير مع داخل الصفاق (0.7 مل / كغ) من مزيج من الكيتامين (4.28 ملغ / مل) ، زيلازين (0.82 ملغ / مل) وآسيبرومازين (0.07mg/ml) ^14.
2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية ونصائح الكهربائي في حبة تعقيم الساخنة. بارد في وقت لاحق سواء في المياه المالحة عقيمة قبل استخدامها لتجنب الضرر الحراري للعين.
3. الماوس مكان تحت نطاق تشريح وموقف حاقن.
4. بالنسبة للفئران أصغر سنا من P14 (قبل فتح العين) ، وفتح الجفن جراحيا عن طريق قطع على طول الجفن من فتح في المستقبل مع مقص تشريح الدقيقة الربيع ^ب.
5. جعل مقلة العين تبرز جزئيا عن طريق تطبيق الضغط بلطف حول العين مع نصائح من ملقط ^ج.
6. عقد في عين المكان بواسطة معسر برفق الجلد حول مقلة العين.
7. ضبط وتحقيق micromanipulator ماصة على مقربة من مقلة العين.
8. اضغط على دواسة القدم ، والتي يتم توصيلها إلى نظام Nanoinject الثاني ، لطرد بضع قطرات من محلول الحقن ، وبالتالي تحقق من عدم انسداد ماصة.
9. مع من ناحية الاستقرار في مقلة العين ، نقل micromanipulator ان هذه غيض من الزجاج ماصة تخترق الظهارة الصبغية الشبكية ويدخل في شبكية العين.
10. حقن قصرIRED مبلغ حل عن طريق الضغط على دواسة القدم لنظام Nanoinject الثاني. على سبيل المثال ، لتسمية واحدة RGCs نجعل حقنة واحدة من 4.6nL - 2.3.
11. التراجع عن ماصة والمكان بعناية نصائح الكهربائي مباشرة عبر موقع الحقن وخفض دواسة القدم لمشجعا لاستكمال الدائرة وelectroporate العين. نحن عادة استخدام النبضات مربع مع ضبط قوة 25V ، 50msec المدة ، 1sec إربا. وتطبق 10 البقول (5 نبضات من كل الاقطاب) ليتم تطبيقها الفئران الأكبر سنا من البقول وP4 6 (3 نبضات من كل الاقطاب) لP0 على الفئران P3.
12. دفع برفق مقلة العين مرة أخرى إلى مأخذ وتطبيق مرهم عيني عقيم حول خفض الجفون.
13. الحيوانات مكان على منصة الحرارة درجة الحرارة للرقابة وعلى الانتعاش الكامل ، بما في ذلك إعادة التدفئة الكافية والتنقل ، والعودة إلى الحيوانية والدتهما.
14. رصد الحيوانات كل 12 ساعة لتوقيع أي ضائقة أو ألم أو انزعاج ، مثل فقدان الحركة ، وموقف غير طبيعي أو عدم العريس. لا ينبغي أن الجولات المتكررة من الحقن والتخدير وelectroporation سيتم تنفيذه على نفس الحيوان.

4. تلاحظ

1. طريقة الحقن وصفها في هذا الفيديو هو "أعمى" الحقن. فمن الممكن تصور حجم ومكان الحقن عند العمل مع الفئران البيضاء والحلول الملونة (الجاذبة أو حل البلازميد مع كميات ضئيلة من اللون الأزرق بسرعة). ومع ذلك ، مع سلالات الفئران يمكن المصطبغة موقع الحقن لا يمكن تصور مباشرة ، وبالتالي فمن الصعب وصف ما إذا كان أحد لفظيا وصلت الى المكان المقصود في شبكية العين أو إلى أي مدى ينبغي لأحد أن نقل ماصة لاستهداف طبقة RGC على وجه التحديد. لذا ، فإننا ننصح بشدة المستخدمين الجدد للبدء أولا حقن الفئران البيضاء الجاذبة في هذه الحقن منذ يمكن تصور على الفور في شبكية العين ، ويمكن استخدامها بوضع العلامات على إسقاطات RGC لشبكية العين والدماغ لتقييم نوعية الحقن. إعداد صلاح الغيدان 10 ٪ في N ، N - ثنائي ميثيل الفورماميد (100 ٪) لحقن التنسيق. يجب على المستخدمين بمجرد يتقن هذا الإجراء تكون قادرة على استهداف RGCs باستمرار مع حلول الحمض النووي البلازميد واضحة في الفئران مصطبغة.
2. ويمكن استخدام طريقة الحقن وصفها في هذا الفيديو لجعل التنسيق الحقن الجاذبة لتسمية المجموعات الصغيرة من الخلايا لدراسة retinotopy (4.6nL التسميات بضع مئات RGCS) ¹⁴ وRGCs التسمية بالجملة مع fluorophores (Alexa555 ، 488 الخ) لمترافق باء الكوليرا الوحيدات السم لدراسة العين محددة العزل ، باستثناء الخطوة electroporation في # 10 أعلاه. ينصح أقصى حجم حقن مجموع 3uL - 2 لكبار السن من الفئران P14 و 1 2uL مقابل أقل من الفئران P14 من أي حل.
3. يمكن ردم ماصات مع الحلول ليتم حقنه تليها الردم مع الزيوت المعدنية قبل تركيب ماصة على حاقن وكسر الحافة. هذا مفيد خصوصا عند استخدام تركيز عالية حلول الحمض النووي (~ 6ug/uL) ، والتي هي عامة لزجة وصعبة جدا لتحميل من غيض من ماصة.
4. إذا كان انسداد ماصة الزجاج ، بعناية يمسح غيض ماصة مع مسحة القطن المنقوعة في الماء لحلول الحمض النووي والإيثانول (100 ٪) عن حلول (صلاح الغيدان) صباغة.
5. بعد الحقن في العين ، والتراجع عن الحافة ماصة من مقلة العين واضغط على دواسة القدم لحقن مرة أخرى. هذا هو لتأكيد أن لا يحصل انسداد تلميح أثناء عملية الحقن. إذا تم الاستغناء عن أي حل ، فمن المرجح تماما أن الحقن لم يكن ناجحا. ومع ذلك ، لا ينبغي أن تؤخذ على أنها علامة المطلق بأن الحقن لم يكن ناجحا. قد المجرب حقن نفسه مرة أخرى إذا كان العين هو المطلوب مواقع متعددة الحقن ووضع العلامات على عدد أكبر من الخلايا.
6. لوصفها RGCs واحد ، تعيين سرعة الحقن البطيء في خانة السيطرة Nanoinject. هذا أيضا يقلل من كمية من محلول يحقن في شبكية العين والنظام وقتا أكثر في هذا الإعداد إلى الاستغناء عن الحل بينما يتم في الوقت نفسه تراجع غيض من الماصات الزجاج بسرعة من مقلة العين.
7. Electroporation من اليوم بعد الولادة 0-3 (P0 الى P3) الفئران يتطلب عناية إضافية نظرا لأنه من السهل جدا أن تلف العين (وهذا يصبح واضحا بعد بضعة أيام من التعافي ، وعندما عين واضح هو أصغر من المعتاد). خفض عدد من البقول والجهد لتطبيقها ينصح الفئران حديثي الولادة المبكرة. بعد P4 ، ومقل العيون هي أكثر مقاومة للضرر من electroporation.
8. في إصدارات لدينا خبرة موجهة من الغشاء EGFP أو RFP ('gapEGFP" ، راجع ¹²⁾ هي أفضل بكثير من GFP معدلة لدراسة التوقعات retinofugal إلى الدماغ. ومع ذلك ، pCAG - tdTomato ، التي تفتقر إلى غشاء استهداف التعديل ، كما تعمل بشكل جيد (الشكل 1E). بالإضافة ، يمكن أيضا الأصباغ الفلورية ديكستران مترافق يمكن استخدامها لتسمية RGCs باستخدام بروتوكول electroporation المذكورة أعلاه.
9. عادة ، فإن 9 من كل 10 الحقن يؤدي إلى RGCs المسمى ، على الرغم من فقط حوالي 15 ٪ من عمليات الحقن مع النهج المزدوج سوف البلازميدالنتيجة في RGC واحد فقط وصمها. ويمكن زيادة عدد الحالات الناجحة عن طريق حقن الحمض النووي في مواقع متعددة في عين واحدة أو عن طريق حقن البلازميدات ترميز البروتينات الفلورية مختلفة في كل عين.

5. ممثل النتائج

ولوحظ RGC الوسم في جميع الأعمار ، بدءا من P2 إلى P25 ، مع وضع العلامات في EGFP RGCs بواسطة 24hrs بعد electroporation التعبير والحفاظ عليها لثلاثة أسابيع على الأقل بعد ترنسفكأيشن.

يمكن التشعبات fluorescently المسمى (الشكل 1A ، B) والعرش محواري (الشكل 1F) من RGCs احد يمكن تصور واضح وإعادة بنائها.

وبصرف النظر عن RGCs ، يمكن استخدام هذه التقنية لتسمية أنواع أخرى مثل خلايا الشبكية الخلايا الأفقية ، وخلايا بين القطبين ، ومختلف أنواع فرعية عديم الاستطالات الخلية (الشكل 1C)

هذا الأسلوب لا تتداخل مع دوام العادي من الصقل خريطة البصرية كما يتضح من retinotopy العادية في SC (الشكل 1E).

في جميع الأعمار ، وأدى حوالي 90 ٪ من الحالات ، وهي الحقن ذات الحجم الصغير (~ 2.3 4.6nL) من pCAG - gapEGFP التعبير في RGCs قليلة (1D الشكل).

في حوالي 15 ٪ من التجارب باستخدام حقنة واحدة من لجنة المساواة العرقية ، وpCAG البلازميدات تركيبة pCAG - LNL - gapEGFP للحيوان الواحد ، أدت إلى واحد بما في ذلك وضع العلامات العصبية في الشبكية RGCs (الشكل 1A ، B ، D) وغيرها من أنواع الخلايا مثل عديم الاستطالات الخلايا (الشكل 1C).

الشكل 1 -- ألف ، باء المسمى أمثلة من واحد EGFP خلايا الشبكية العقدة (رئيس السهم مشيرا الى محور عصبي) في شبكية العين شقة في جبل ما بعد الولادة لمدة 14 يوما (P14) جيم مثال واحد من الخلية عديم الاستطالات النجمي في P8 د. وتم electroporated كتلة من الخلايا العصبية للشبكية EGFP المسمى بما RGCs عديم الاستطالات وخلايا الشبكية في شقة في جبل P14 RGCs هاء. الظهرية والبطنية في العين اليمنى والمسمى مع EGFP RGCs والزمانية وبطني في العين اليسرى وكان مطلي المسمى مع tdTomato في P1. ويمكن رؤية المناطق المستهدفة (النجمة) التي شكلتها RGCs المسمى في موقعها الصحيح في الطوبوغرافي SC في P9 (جبل بأكمله ، مخطط بيضاء). F. مثال واحد من EGFP المسمى RGC الشجرة (2 - D الإسقاط) في مقطع سهمي (250 ميكرون سميكة) من اتفاقية استكهولم (الخط المنقط). من أجل الوضوح والصور في (D) و (F) قد تم تحويلها إلى الرمادي والمقلوب. أشرطة النطاق (ميكرومتر) : (أ) -- (D) ، (F) : 100 ؛ (E) : 500

Discussion

في هذا الفيديو إثبات وجود لنا في بروتوكول electroporation المجراة أن النتائج في مجموعات واحدة من العلامات أو صغيرة من الخلايا العصبية للشبكية في الفئران بعد الولادة مع الحمض النووي الترميز يبني البروتينات الفلورية. مستنسخة مجموعات صغيرة من إسقاطات RGC fluorescently المس...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
المواد	شركة	فهرس العدد
دومون # 5 الملقط	أدوات العلوم غرامة	11252-20
محفز كهربائي	العشب آلات	نموذج S4
مرسمة الذبذبات	اجيلنت	نموذج 54621A
رصد الصوت	العشب آلات	نموذج AM8B
مجتذب	سوتر الآلات	نموذج P - 97
Vannas المقص	العالم آلات دقيقة	14003
المقص الصغير ب	تيد بيلا	1347
دومون AA الملقط ج	أدوات العلوم غرامة	11210-20
النظام الثاني Nanoinject	دروموند العلمية	3-000-204
الزجاج الماصات	دروموند العلمية	3 - 000 - 203 - G / X
دواسة القدم	دروموند العلمية	3-000-026
الزيوت المعدنية	سيغما الدريخ	M3516
صلاح الغيدان	Invitrogen	D - 383
N ، N - ثنائي ميثيل الفورماميد	سيغما	D4551