التقييم الكمي لخلايا المناعة في الأنسجة النخاع الشوكي المصاب بواسطة التدفق الخلوي : رواية عن استخدام أسلوب خلية تنقية

Summary

معقد الكمي للالتهاب الخلوية في الجهاز العصبي المركزي اصيب / المرضية التي التدفق الخلوي بواسطة دهن / المايلين الحطام يمكن أن يكون لها نفس الحجم والتحبب إلى الخلايا ، وتقليل الحساسية / الدقة. لقد أحرزنا تقدما في طريقة إعداد خلية لإزالة الحطام الميلين وتحسين الكشف عن خلية التدفق الخلوي في النخاع الشوكي المصاب.

Abstract

اكتشاف خلايا مناعية في النظام العصبي المركزي اصيب (CNS) باستخدام تقنيات شكلية أو النسيجي لم تقدم دائما التحليل الكمي الحقيقي للالتهاب الخلوية. التدفق الخلوي هو طريقة بديلة سريعة لتحديد الخلايا المناعية في المخ أو العمود الفقري إصابة أنسجة الحبل السري. تاريخيا ، استخدمت لقياس التدفق الخلوي الخلايا المناعية التي تم جمعها من الدم أو الطحال أو الغدة الصعترية فصلها ، وفقط عدد قليل من الدراسات التي حاولت تحديد الخلايا المناعية في الحبل الشوكي المصاب عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الطازجة أنسجة الحبل فصلها. ومع ذلك ، يتركز فصل أنسجة الحبل الشوكي مع الحطام الميلين يمكن أن يكون مخطئا لخلايا وتقليل عدد الخلايا الموثوقية التي حصل عليها عداد الكريات التدفق. لقد أحرزنا تقدما في طريقة إعداد الخلية باستخدام نظام التدرج OptiPrep الدهون بشكل فعال على الحطام / الميلين من خلايا منفصلة ، وتوفير quantifications حساسة وموثوق بها من الالتهاب الخلوي في النخاع الشوكي أصيب التدفق الخلوي. كما هو موضح في دراستنا الأخيرة (بيك ونغوين وآخرون ، 2010 فبراير الدماغ ؛ 133 (بط 2) :. 433-47) ، وكان إعداد OptiPrep زيادة حساسية الخلايا للكشف عن الالتهابات الخلوية في الحبل الشوكي المصاب ، مع تهمة أنواع معينة من الخلايا رابطا مع شدة الإصابة. الأهم من ذلك ، شريطة استخدام هذا الأسلوب من رواية توصيف الأولى من الالتهاب الحاد والمزمن الخلوية بعد اصابات النخاع الشوكي لتشمل دوام كامل لكريات الدم البيضاء متعددة النوى (PMNs ، العدلات) ، الضامة / الدبقية الصغيرة ، وخلايا T على مدى فترة تتراوح بين 2 ساعة ل 180 يوما بعد الاصابه (نقطة في البوصة) ، وتحديد المرحلة الثانية من رواية مفاجئة الالتهابات الخلوية. قد توصيف دقيق لالتهاب الخلوية باستخدام هذا الأسلوب توفير فهم أفضل للneuroinflammation في الجهاز العصبي المركزي المصاب ، وتكشف عنصرا هاما من neuroinflammation متعدد الأطوار التي قد تكون حاسمة بالنسبة لتصميم وتنفيذ استراتيجيات عقلانية العلاجية ، بما في ذلك القائمة على الخلية والدوائية التدخلات لاصابات النخاع الشوكي.

Protocol

1. تفكك نسيج الحبل الشوكي

1. شرائح الحبل الشوكي T8 - T10 من الجرحى غير كدمة أو الحبل الشوكي المصاب (الإصابة في T9) سبراغ داولي الفئران تم تشريح وفصل ميكانيكيا مع مقص الجميلة في HBSS في درجة حرارة الغرفة ، كما هو موضح سابقا ^1. قبل أن تفارق الأنسجة ، تم الاحتفاظ بها كلها أعمدة النخاع الشوكي على الجليد الجاف لمدة 5 دقائق قبل استخراج شرائح الحبل T8 - T10.
2. تم انتشال قطع النسيج بواسطة الطرد المركزي (1 دقيقة ، 1000 دورة في الدقيقة ، ودرجة حرارة الغرفة) وفصلها إنزيمي مع التربسين 2.5 ملغ و 5 ملغ كولاجيناز في بورصة دبي للطاقة 5 مل (وسائل الإعلام Dulbecco في التعديل النسر) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل سحن (~ 10 مرات في درجة حرارة الغرفة) مع ماصة باستير الزجاج (9 بوصة).
3. تم ادراج 10 مل من مصل DME + 10 ٪ بقري جنيني لخلايا لمنع الأنشطة الأنزيمية ثم تم تصفيتها من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر. بعد الدوران السريع ، وكان بيليه معلق الخلية في 6 مل من HBSS وoverlayed على حلول متدرجة OptiPrep المبينة أدناه.

2. إيجاد حلول متدرجة OptiPrep

1. شيد OptiPrep المخففة التي تمييع OptiPrep 01:01 العازلة مع اجتماعات الأطراف (0.15 م كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي اجتماعات الأطراف ، ودرجة الحموضة 7.4).
2. وأدلى أربعة OptiPrep حلول متدرجة عن طريق خلط 350 ، 250 ، 200 ، أو 150 OptiPrep المخفف ميكرولتر مع HBSS إلى الحجم النهائي من 1 مل (الجدول 1).
3. وببطء وحذر وضعت الحلول الأربعة في طبقات في أنبوب مخروطي 15 مل مع تمييع الأقل في الجزء السفلي والأكثر مخفف على رأس (1A الشكل).

3. فصل الدهون / المايلين الحطام من الخلايا

1. والطبقات بعناية 6 مل من الخلايا في العمود الفقري في فصل HBSS على رأس حلول متدرجة OptiPrep.
2. وكان طرد الخلايا التي تحتوي على أنبوب وحلول متدرجة (15 دقيقة ، 1900 دورة في الدقيقة ، أو 726 إطار التعاون الإقليمي ، و 20 درجة مئوية) باستخدام جهاز طرد مركزي 5810R إيبندورف مع الدوار سوينغ قادوس (A - 4 - 62) ، وفصل حل الخلية في طبقات متميزة مع الدهون / المايلين الحطام (أعلى من 7 مل أنبوب) ، تليها 3 طبقات من الخلايا العصبية ، وخلايا التهابية ، والدبق ، وخلايا الدم الحمراء في بيليه. على الرغم من العثور على خلايا معظم التهابات ، بما في ذلك حيدات ، الضامة ، المحببة PMN ، والخلايا الليمفاوية في بيليه ، يمكن العثور على بعض الكبيرة الحجم تنشيط البلاعم في طبقات فوق بيليه.
3. كان يستنشق بعناية طبقة الدهون الحطام / الميلين (أعلى 7 مل) ، وإزالتها. تم غسلها ثم الخلايا ومعلق في HBSS 2.5 مل واستخدامها لimmunolabeling أدناه.

4. Immunolabeling من الخلايا المناعية المحددة لالتدفق الخلوي

1. وكانت الخلايا (500 ميكرولتر) تم جمعها من الاستعدادات الحبل الشوكي مكعبات ومعلق في كلوريد الأمونيوم 0.85 ٪ (المخفف في الماء المقطر) لمدة 5 دقائق لليز خلايا الدم الحمراء.
2. وجرفت المياه الخلايا مع 500 ميكرولتر HBSS وسدت ثم لمدة 30 دقيقة في الأرانب العادي أو مصل الفأر في درجة حرارة الغرفة.
3. وجرفت المياه الخلايا وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة (المضادة للأرنب PMN FITC والكيماوية الدقيقة والعلمية ؛ ماوس مكافحة الفئران ED1 اليكسا 488 ، Serotec ؛ أو الماوس لمكافحة الفئران CD3 اليكسا 488) أو isotype مفتش في محلول مخفف HBSS (كلها في التخفيف 1:100) ، كما هو موضح سابقا ^1.
4. وجرفت المياه الخلايا مرتين بعد كل خطوة أعلاه ثم معلق في 300 HBSS ميكرولتر بعد الخطوة النهائية.

5. التقييم الكمي الخلية التدفق الخلوي

1. وتم تحليل العينات في عداد الكريات FACS Calibur التدفق (بيكتون ديكنسون -) باستخدام خلية برنامج كويست. وكانت قراءة أحداث 5000 في العينة بالنسبة لجميع العينات ، واستكمل تحليل البيانات مع القمة (DakoCytomation).
2. وضعت بوابات التحكم بتدفق cytometric باستخدام مفتش isotype الخلايا المسماة خلايا النخاع الشوكي أو من الحيوانات السيطرة يصب لتعيين القيم الأساسية للتطبيع عبر نقاط الوقت كما هو موضح سابقا ^1. وأعرب عن القيم يعني من الخلايا المسمى ايجابيا كما في المئة (± SEM) من العينة كلها.

6. ممثل النتائج :

تم تقييم قدرة أي التدرج لإزالة الحطام OptiPrep الميلين وتحسين الكشف عن خلية المناعة التدفق الخلوي عن طريق قياس PMNs الشوكي عند 1 نقطة في البوصة (1B الشكل) ، ذروة ذكرت سابقا من تسلل PMN ^1-3 بعد اصابات النخاع الشوكي. بدلا من ذلك ، والنخاع الشوكي تشريح مماثل دون فصلها إنزيمي OptiPrep - ازالة الحطام الميلين وقيمت بالمثل في موازية لعمليات التسلل التي PMN التدفق الخلوي. كما ذكرت سابقا لدينا ¹ ، كان هناك تحول في الموقف من الأحداث في عينات المعزولة مع أسلوب التدرج OptiPrep تنقية مقارنة تفارق الأنزيمية وحدها ، مما يدل على نسبة PMNs اكتشافها في عينات مع الحطام الميلين سليمة لم يكن سوى جزء ضئيل (0.5 ٪) النسبة المئوية للPMNs الكشف عن (5.1 ٪) في purif OptiPrepالعبوات الناسفة العينات (الشكل 1B). هذه البيانات تشير إلى أن الحطام الميلين في الأنسجة يمكن أن تحجب الاستعدادات قراءات تدفق cytometric ، وتثبت أن إزالة الحطام الميلين يعزز حساسية الكشف عن الخلايا المناعية في الحبل الشوكي إصابة الأنسجة.

وقد وضع حساسية نظام التدرج OptiPrep للكشف خلية في الحبل الشوكي المصاب ، وتتميز نحن التغيرات في تسلل الخلوية خلال فترة تتراوح ما بين 2 إلى 180 نقطة في البوصة ساعة ، وأنشأ استجابة الرواية متعدد الأطوار الالتهاب الخلوي بعد اصابات النخاع الشوكي التي شملت PMNs ، الضامة / الدبقية الصغيرة وخلايا تي. كما أكدت الدراسات السابقة ^1-3 ، PMNs دخلت لأول مرة في سلك 2 ساعات ما بعد الإصابة ، وبلغت ذروتها في 1 نقطة في البوصة (الشكل 2 و 4). الضامة / الدبقية الصغيرة من ناحية أخرى ^1،4،5 ، لم تكتشف في الحبل الشوكي المصاب حتى 3 نقطة في البوصة ، وبلغت ذروتها في البداية في 7 نقطة في البوصة (الشكل 3 و 4). من المستغرب أن نظهر للمرة الأولى التي الضامة / الدبقية الصغيرة ذروته في 60 نقطة في البوصة second الوقت وظلت مرتفعة من خلال 180 نقطة في البوصة (الشكل 3 و 4). مشابهة لالضامة / الدبقية الصغيرة ، تي الخلية كان من المتوقع أن يبلغ ذروته تسلل ^05-07 يوليو نقطة في البوصة ، ولكن التدفق الخلوي لم يكشف أي تغييرات في عدد خلايا T في أول 7 نقطة في البوصة ، على الرغم من الكشف عن عدد مرتفع من الخلايا التائية في الساعة 9 نقطة في البوصة (1.6 ٪) (الشكل 4). بينما كان عدد خلايا T - تناقص بنسبة 10 نقطة في البوصة ، لوحظ وجود خلايا T الثابتة من خلال 180 نقطة في البوصة الاستجابة ، في الوقت الذي وصفت 4.4 ٪ من الخلايا لCD3 (الشكل 4).

معا ، وهذه البيانات تدل على الاستجابة المعتمدة على الزمن المتعدد المراحل الالتهاب الخلوي بعد اصابات النخاع الشوكي (الشكل 4) ؛ كانت تتكون في المراحل الأولية من الالتهاب الخلوي للقمة في وقت مبكر من PMNs 1 نقطة في البوصة تليها ذروة ED1 + الضامة / الدبقية الصغيرة 7 نقطة في البوصة وT خلايا 9 نقطة في البوصة ، بينما كانت تتألف مراحل لاحقة من جميع السكان three الخلوية ارتفاع بعد 14 نقطة في البوصة والمستمرة من خلال 180 نقطة في البوصة ، مع الذروة الثانية البارزة الضامة / الدبقية الصغيرة عند 60 نقطة في البوصة. وقد تم التحقق من صحة هذه الدراسة timecourse والبيانات الكمية التي تم إنشاؤها بواسطة التدفق الخلوي سابقا ، وتبين نتائج مماثلة للبيانات التي تم جمعها من التجسيم الكمي للimmunolabeled أقسام الحبل الشوكي ^1.

الجدول 1. إعداد التدرج OptiPrep لازالة الحطام الميلين. مصنوعة أربعة حلول متدرجة OptiPrep باستخدام HBSS وOptiPrep المخفف (1:1 تخفيف OptiPrep والمماسح).

الشكل 1. الكثافة التدرج OptiPrep منفصلة معظم المايلين / الحطام من اصابة في العمود الفقري خلايا الأنسجة / الحبل وتحسين المناعة تقييم الخلية التدفق الخلوي. (أ) فصلت المايلين / الحطام من الخلايا (الخلايا العصبية ، والخلايا المناعية الدبقية) بعد الطرد المركزي لفصل الأنسجة الحبل الشوكي من خلال التدرج OptiPrep تليها تطلع المايلين / الحطام طبقة. (ب) عدد PMN في النخاع الشوكي المصاب ، والتي تبين زيادة الحساسية في الكشف عن PMNs بعد إزالة الأنقاض (الطالب اختبار t ، ع = 0.0001). تم تعيين جميع البوابات تدفق cytometric باستخدام الخلايا المسمى من الحيوانات لم يصب ، ن = 5 في المجموعة ، يعني ± SEM. وكانت قراءة أحداث 5000 في العينة بالنسبة لجميع العينات وأعرب عن القيم يعني من الخلايا المسمى ايجابيا كما في المئة (± SEM) من العينة كلها.

الشكل 2. الكشف عن تسلل PMN في الحبل الشوكي المصاب عن طريق التدفق الخلوي. بعد إصابة معتدلة كدمة (200 دينار) في T9 ، PMNs سرعان ما دخلت في النخاع الشوكي بدءا 2 ساعات (B) في مرحلة ما بعد الإصابة وتبلغ ذروتها 1 نقطة في البوصة (C). تم تعيين جميع البوابات تدفق cytometric باستخدام خلايا من حيوانات لم يصب المسمى (A).

الشكل 3. الكشف عن الضامة / تسلل الخلايا الدبقية الصغيرة في الحبل الشوكي المصاب عن طريق التدفق الخلوي. بعد إصابة معتدلة كدمة (200 دينار) في T9 ، ED1 + البلاعم / دبقية صغيرة العدد المتزايد في الحبل الشوكي المصاب ابتداء من الساعة 3 نقطة في البوصة (D) ، بلغت ذروتها الحاد في 7 نقطة في البوصة (E) ، انخفض إلى مستويات منخفضة عند 14 نقطة في البوصة (F) وارتفع الى ذروة قبل الثانية في نقطة في البوصة 60 (G) ، وبقي في النخاع الشوكي اصيب ما يصل الى 180 نقطة في البوصة (H). أظهرت العلامات مفتش الرقابة isotype من الخلايا في العمود الفقري 7 نقطة في البوصة (ب) الحد الأدنى من الأجسام المضادة لوضع العلامات وهناك اختلاف الخلفية للخلايا الأجسام المضادة المسماة في الفترة من 2 ساعة بعد اصابة (C) أو لم يصب الحيوانات (A). تم تعيين جميع البوابات تدفق cytometric باستخدام الخلايا المسمى من الحيوانات لم يصب.

الجدول 2. عينات من الحيوانات في التجارب timecourse. الوقت للحصول على كل نقطة (0 ساعة إلى 180 نقطة في البوصة) ، تلقى خمسة حيوانات معتدل إصابة كدمة (200 دينار) في T9 ،وقيمت أنسجة الحبل الشوكي التي التدفق الخلوي لأعداد PMNs ، ED1 ⁺ الضامة / الدبقية الصغيرة ، وCD3 ⁺ الخلايا التائية. ومع ذلك ، تم انتشال جميع العينات الحيوانية لا بنجاح لPMN (4-5) ، ED1 (3-5) ، وCD3 (4-5) تدفق التحليلات cytometric.

الشكل 4 ألف timecourse الالتهاب الخلوي في النخاع الشوكي بعد إصابة معتدلة كدمة (200 دينار) في T9. وفقا لتقييم التدفق الخلوي ، وعدد PMNs ، ED1 ⁺ الضامة / الدبقية الصغيرة ، وCD3 ⁺ الخلايا التائية ذروته الحاد (1،7 و 9 نقطة في البوصة ، على التوالي) ، واستمرت بشكل مزمن في النخاع الشوكي المصاب. ن = 3 إلى 5 في المجموعة ، يعني ± SEM.

Discussion

معقد استخدام الخلوي لقياس تدفق الخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي بواسطة دهن / المايلين المحتوى والحطام. بالإضافة إلى التدخل في خصوصية والضد ملزمة ، يمكن أن يكون الحطام الميلين حجم وخصائص مشابهة لتحبيب الخلايا المناعية ، وخفض حساسية ودقة قياس ^8. طريقة التحضير خلية الرواية الموصوفة هنا هي فعالة في إزالة الأنقاض ويحسن بالتالي الميلين حساسية التدفق الخلوي للكشف عن تغيرات في التهاب الخلوية في الحبل الشوكي المصاب. سمح استخدام هذا الأسلوب الرواية على سبيل المثال ، وإزالة الأنقاض النخاعين هذا الأسلوب الكشف المعززة للخلايا المناعية الأنزيمية مقارنة تفارق alone.Critically ، وتوصيف الأولى من الالتهاب الحاد والمزمن الخلوية بعد اصابات النخاع الشوكي لتشمل دورة زمنية كاملة للPMNs ، حددت الضامة / الدبقية الصغيرة ، وخلايا تي يصل إلى 180 نقطة في البوصة ، والمرحلة الثانية من رواية الالتهابات الخلوية. قد تكون هذه النتائج الهامة مكون من متعدد الأطوار neuroinflammation ستكون حاسمة لتصميم وتنفيذ استراتيجيات عقلانية العلاجية ، بما في ذلك التدخلات سواء خلية القاعدة والدوائية لاصابات النخاع الشوكي.

وقد تم استخدام نظام التدرج OptiPrep على الحطام منفصلة من خلايا الدم في ⁹ أو تنقية الخلايا العصبية من الدماغ لأغراض الثقافة خلية ¹⁰ ، ولكن علينا تعديل هذا النظام وطريقة متقدمة لفصل الحطام الميلين من خلايا النخاع الشوكي فصلها ، وسمح سرعة وأكثر دقة القياس الكمي للالتهاب الخليوي عن التدفق الخلوي. هذا الأسلوب مع التدفق الخلوي من المرجح أن تقدم تقدما ملموسا في مجال البحوث الالتهاب بعد إصابات الجهاز العصبي المركزي أو الحالات المرضية ، حيث أن معظم الدراسات التي تتميز فقط الالتهابات الخلوية في الجهاز العصبي المركزي باستخدام التقنيات الشكلية والنسيجية التي ليست خلية من نوع معين ، أو لا يمكن توفير صحيحا دائما الكمية التقييم. علاوة على ذلك ، وقد حاول عدد قليل من الدراسات الأخيرة لتحديد الخلايا المناعية في الحبل الشوكي المصاب عن طريق التدفق الخلوي باستخدام أنسجة جديدة الحبل ^11،12 فصلها أو خلايا مفصولة نظام التدرج Percoll ¹³ ، إلا أن هذه الدراسات أظهرت إما منخفضة أو غلة الخلية حساسة الكشف عن الخلايا المناعية.

في المقابل ، قدمت الخلية التدرج OptiPrep طريقة التحضير لأول مرة ، والتقييم الكمي حساسة وموثوق بها عن طريق التدفق الخلوي للتغيرات الالتهاب الخلوي استجابة لشدة الإصابة ومتدرج على مدى timecourse مدد تصل إلى 180 نقطة في البوصة. حساسية وموثوقية تحليل تدفق cytometric تعتمد أيضا على نوعية الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن أنواع الخلايا المناعية محددة ، والتدفق الخلوي لا تسمح المعايير الشكلية للتمييز مزيد من أنواع الخلايا. تم اختبار الأجسام المضادة لخصوصية ، PMNs الخلايا الدبقية الصغيرة / الضامة أو T - يخبر جيدا في التدفق الخلوي لPMNs البريتوني والبلاعم السنخية في الثقافة والخلايا في الحبل الشوكي المصاب ^1،2 الأنسجة. جنبا إلى جنب مع نظام التدرج OptiPrep ، وقد ساهمت هذه الأجسام المضادة المستخدمة في التدفق الخلوي للجيل من التحليل الكمي والزماني للالتهاب الخلوية التي قدمت رؤية جديدة للديناميات المكروية اصابات النخاع الشوكي ، وحددت للمرة الأولى استجابة موسعة متعدد الأطوار الالتهاب الخلوي. قد يكون هذا رد الفعل المتعدد المراحل من خلايا النخاع الشوكي بعد أن تكون هامة للتحقيق في دور أنواع معينة من الخلايا موجودة في أوقات محددة بعد الإصابة أو توليد التدخلات العلاجية ضد أنواع معينة من الخلايا التي يمكن أن تؤدي إلى تفاقم الإصابات. وعلاوة على ذلك ، قد تساعد هذه النتائج في وضع الأساس المنطقي المناسب للتدخلات المخدرات أو خلية مقرها الأمثل لاصابات النخاع الشوكي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
OptiPrep	فيشر العلمية	NC9182490
HBSS	سيغما	H1387
الأرنب مكافحة الفئران PMN (FITC)	دقيقة الكيميائية والعلمي	AIFAD51140
ماوس لمكافحة الفئران ED1 (اليكسا فلور 488)	عبد Serotec	MCA341A488
ماوس لمكافحة الفئران CD3 (FITC)	عبد Serotec	MCA772F
التربسين	سيغما	T9935
كولاجيناز	سيغما	C5138
بورصة دبي للطاقة	سيغما	D1152
MOUSE IgG1 (اليكسا فلور 488)	عبد Serotec	MCA1209A488
مصل بقري جنيني	Hyclone	SH30070.03
مصل الأرنب	جاكسون ImmunoResearch	011-000-120011-000-120
مصل الفأر	جاكسون ImmunoResearch	015-000-120
خلية مصفاة	فالكون دينار بحريني	352340