تحديد أنواع غشاء الميتوكوندريا المحتملة والأوكسجين التفاعلي في الخلايا العصبية الفئران الحية القشرية

Summary

نظهر تطبيق مؤشر مضان ، TMRM ، في العصبونات القشرية لتحديد التغيرات النسبية في كثافة مضان TMRM قبل وبعد تطبيق حافز معين. نعرض أيضا تطبيق H التحقيق مضان ₂ DCF - DA تقييم المستوى النسبي لأنواع الاكسجين التفاعلية في العصبونات القشرية.

Abstract

غشاء الميتوكوندريا المحتملة (ΔΨm) أمر حاسم للحفاظ على وظيفة فسيولوجية من السلسلة التنفسية لتوليد ATP. خسارة كبيرة من الخلايا المنضب ΔΨm يجعل من الطاقة مع الموت لاحقة. أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) مهمة جزيئات الإشارة ، ولكن تراكمها في ظروف مرضية تؤدي الى الاكسدة. مصادر الرئيسيتين لريوس في الخلايا هي السموم البيئية وعملية الفسفرة المؤكسدة. وقد تسببت ضعف الميتوكوندريا والاكسدة في الفيزيولوجيا المرضية لكثير من الأمراض ، وبالتالي ، فإن القدرة على تحديد وΔΨm ريوس يمكن أن توفر مؤشرات مهمة عن حالة الفسيولوجية للخلية وظيفة من وظائف الميتوكوندريا.

ويمكن استخدام عدة تحقيقات فلوري (رودامين 123 ، TMRM ، TMRE ، JC - 1) لتحديد Δψm في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، وكثير من المؤشرات مضان (Dihydroethidium ، Dihydrorhodamine 123 ، H ₂ DCF - DA) يمكن استخدامها لتحديد ريوس . ما يقرب من جميع التحقيقات مضان المتاحة المستخدمة لتقييم ΔΨm أو ريوس واحد الطول الموجي المؤشرات ، التي تزيد أو تنقص حدتها مضان النسبي إلى أن التحفيز الزيادة أو النقصان في مستويات ΔΨm أو ريوس. وهكذا ، فإنه لا بد من قياس كثافة مضان هذه التحقيقات على مستوى خط الأساس وبعد تطبيق حافز معين. هذا يسمح احد لتحديد النسبة المئوية للتغيير في كثافة مضان بين مستوى خط الأساس والحافز. هذا التغيير في كثافة مضان يعكس التغير في المستويات النسبية للΔΨm أو ريوس. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تطبيق مؤشر مضان ، TMRM ، في العصبونات القشرية الفئران لتحديد النسبة المئوية للتغير في كثافة مضان TMRM بين مستوى خط الأساس وبعد تطبيق FCCP ، وهو uncoupler الميتوكوندريا. انخفاض مستويات TMRM مضان الناتجة عن المعالجة FCCP تعكس الاستقطاب من إمكانات غشاء الميتوكوندريا. علينا أن نبين كيفية تطبيق مضان التحقيق H ₂ - DA DCF لتقييم مستوى ريوس في الخلايا العصبية القشرية ، أولا في الأساس ثم بعد تطبيق H ₂ O _2. يمكن أن يكون هذا البروتوكول (مع تعديلات طفيفة) تستخدم أيضا لتحديد التغيرات في ΔΨm وريوس في أنواع مختلفة من الخلايا والخلايا العصبية في المناطق المعزولة من الدماغ الأخرى.

Protocol

1. خلية ثقافة

1. يتم عزل الخلايا العصبية القشرية ونمت باستخدام تقنيات الموصوفة سابقا ومطلي على أطباق الثقافة مع قاع زجاج (شركة ماتيك ، آشلاند ، MA) مغلفة بولي - D - يسين وlaminin ^1.

2. إعداد الحلول الأسهم للتحقيقات TMRM الفلورسنت وDCF H ₂ - DA

1. إعداد محلول المخزون 10 ملم من TMRM بحل 5.0 ملغ من TMRM في 1 مل من dimethylsulfoxide اللامائية. دوامة لمدة 1 دقيقة. ثم ، وجعل aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية ، وحماية من الضوء ، واستخدام غضون شهر واحد.
2. المقبل ، وإعداد محلول المخزون 10 ملم من H ₂ - DA DCF عن طريق إذابة 4.87 ملغ من H ₂ - DA DCF في 1 مل من DMSO اللامائية. وبالمثل ، فإنه لدوامة 1 دقيقة. ثم ، وجعل aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية ، وحماية من الضوء ، واستخدام غضون أسبوع واحد.

3. العصبونات القشرية مع الفئران تحميل TMRM وDCF H ₂ - DA

TMRM هو potentiometric ، الخلية المنفذة للمؤشر الفلورسنت التي تتراكم في الداخل سلبيا للغاية المكلف الميتوكوندريا. من المهم استخدام تركيزات منخفضة (10-50 نطاق نانومتر) من TMRM لتجنب تبريد السيارات من TMRM الميتوكوندريا. ثم ، يمكن الإشارة مضان من TMRM تكون مباشرة المشترك المتصلة ΔΨm عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية. وفقدان أسباب ΔΨm TMRM تسرب من الميتوكوندريا مما أدى إلى فقدان كثافة مضان. H ₂ - DA DCF غير قابلة للاختراق الخلية المسبار تحويلها إلى DCF - DA esterases بواسطة الخلايا ، والنتائج أكسدة في DCF الفلورسنت. وينبغي اختبار النهائي للتركيز H ₂ - DA DCF يتراوح ما بين 20-10 ميكرومتر وتجريبيا في الخلايا العصبية المتأتية من مناطق الدماغ المختلفة منذ تركيزات عالية تحميل قد يؤدي إلى تشبع مضان DCF حتى في حالة عدم وجود H ₂ O _2. فإن وجود أي أكسدة داخلية أم خارجية (، مثل النيتريك أكسيد الهيدروجين بيروكسيد ،) DFC زيادة كثافة مضان. أدناه ، ونحن نقدم بروتوكول للتحميل العصبونات القشرية مع الفئران وTMRM H ₂ - DA DCF.

1. لتحميل الخلايا العصبية الفئران القشرية مع TMRM ، أولا ، وغسل الخلايا العصبية مثقف 3 مرات مع العازلة Tyrode ل(تراكب النص : السل : 145 مم كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، 10 الجلوكوز ملم ، 1.5 ملم CaCl ₂ ، 1 ملم MgCl ₂ ، و 10 HEPES مم ؛ ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم). ثم ، وإعداد 20 نيوتن متر من TMRM بواسطة تمييع الأسهم TMRM 10 ملي 1 / 1000 في أوقات السل ثم إضافة 2 ميكرولتر من TMRM المخفض 1 مل من السل. احتضان مع الخلايا العصبية لمدة 45 دقيقة TMRM في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد 45 دقيقة ، وتركيب الطبق الثقافة على مسرح المجهر وبدء التصوير.
2. لتحميل العصبونات القشرية الفئران مع H ₂ DCF - DA ، وغسل الخلايا العصبية مثقف 3 مرات مع السل. المقبل ، وإعداد 2 من ₂ ميكرومتر H - DA DCF بواسطة تمييع 10 مم H ₂ - DA DCF الأسهم 10/01 مرات في السل وثم إضافة 2 ميكرولتر من المخففة H ₂ - DA DCF في 1 مل من السل. ثم ، مع احتضان الخلايا العصبية ₂ H - DA DCF لمدة 45 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد 45 دقيقة ، وغسل الخلايا العصبية 4 مرات بالسل لإزالة الزائدة مؤشر الفلورسنت قبل الحصول على الصور.

4. يعيش التصوير من الخلايا العصبية مع TMRM المحتضنة لتحديد ΔΨm

1. لأداء التصوير العيش من الخلايا العصبية المحتضنة مع TMRM ، مبائر المجهري المسح بواسطة أشعة الليزر (تراكب النص : LSM 510 ، كارل زايس شركة) ، وذلك مع تطبيق برنامج زمني سلسلة حية ، يستخدم. تطبيق منخفضة الدقة والموهنة ليزر الطاقة (تراكب النص : دقة منخفضة : 256 × 256 ؛ الليزر الطاقة : 1 ٪) لتقليل الوقت اللازم للحصول على صور وتجنب photobleaching.
2. . المقبل ، وضبط التركيز في الخلايا العصبية التي شنت محملة TMRM باستخدام الضوء المنعكس. فحص مضان TMRM الإضاءة في 514 نانومتر ، والكشف على 570 نانومتر. تعيين كسب الكشف عن الكاميرا فقط دون مستوى التشبع.
3. مرة واحدة والتي تشمل جميع المعلمات القرار ، وقوة الليزر ، والحصول على الكشف عن الكاميرا ، والفاصل الزمني الفاصل بين الحصول على صور يتم تعيين ؛ لا تغيير هذه الإعدادات بين التجارب. المقبل ، وتغير هذا المجال. البدء في جمع الصور.
4. لاختبار التغيرات في ΔΨm ، يمكن تطبيق المنبهات مثل 1 ميكرومتر من FCCP أو 2 ميكروغرام / مل من oligomycin ، والتي سوف يزيل الاستقطاب بشكل كبير أو hyperpolarize إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، على التوالي. وسوف تنعكس هذه التغيرات نقصان في كثافة مضان TMRM بالمقارنة مع كثافة مضان الأساس في حالة FCCP ، أو زيادة في شدة TMRM مضان في حالة oligomycin.

5. يعيش التصوير من الخلايا العصبية المحتضنة مع DCF ² H - DA لتحديد ريوس

1. لأداء التصوير العيش من الخلايا العصبية المحتضنة مع H ₂ DCF - DA ، أولا ، تركيب الطبق الثقافة على مسرح المجهر. ضبط التركيز من الخلايا لناجي ينعكس الضوء. دراسة DCF مضان بواسطة الإثارة في 488 نانومتر ، والانبعاث في 515 نانومتر.
2. المقبل ، وضبط قوة الليزر إلى 5-7 ٪ ، والحصول على كشف ، والقرار 256 × 256. لا تغيير هذه الإعدادات بين التجارب. ثم ، تعيين الترددات للحصول على صور حية باستخدام برنامج السلسلة الزمنية.
3. حدد الحقل الجديد والبدء في الحصول على الصور. للكشف عن تغيرات في مستويات ريوس ، وعلاج الخلايا مع 100-200 ميكرومتر من H ₂ O _2. وسوف ينعكس ذلك زيادة في كثافة مضان DCF مقارنة مع مستوى خط الأساس.

6. تحليل البيانات

1. استخدام المنطقة لمصلحة (تراكب النص : ROI) أداة من برنامج LSM لتحديد المجالات. ثم ، وقياس كثافة أو TMRM ريوس مضان. حدد من مناطق رويس رويس الميتوكوندريا أو من خلايا الجسم كله في الخلايا المصورة لقياس كثافة مضان من TMRM أو ريوس ، على التوالي.
2. حساب متوسط ​​كثافة مضان من جميع رويس كل خلية لTMRM أو من الهيئات خلية كاملة لجميع الخلايا المصورة للروس من أجل كل نقطة زمنية. حدد المناطق المجاورة للخلايا لحساب كثافة مضان الخلفية. أخذ قياسات عديدة ، وحساب متوسط ​​كثافة الخلفية.
3. طرح مضان الخلفية متوسط ​​كثافة من كثافة مضان متوسط ​​رويس في كل خلية لكل نقطة زمنية باستخدام Microsoft Excel. بعد طرح كثافة الخلفية ، تطبيع كثافة TMRM أو DCF مضان إلى مضان الأساس باستخدام هذه الصيغة (تراكب النص : ΔF FF = _س / _س س F 100 ، حيث F = كثافة مضان في أي نقطة زمنية ، للحصول على خط الأساس مضان =). ثم ، استخدم قطعة سيغما برنامج لتوليد المؤامرة تبين التغيرات في كثافة مضان على مر الزمن.

7. ممثل النتائج

ويبين الشكل 1A صورة مضان من العصبونات القشرية الفئران مع TMRM المحتضنة. إضافة FCCP ، وهو uncoupler الميتوكوندريا ، يؤدي إلى الاستقطاب الميتوكوندريا وفقدان كثافة مضان TMRM (الشكل 1B). ومضان TMRM مستوى خط الأساس لا يزال مستقرا قبل إضافة FCCP (أول 350 ثانية ؛. الشكل 1C). التحليل الكمي للتغيرات مضان TMRM بمرور الوقت أن هناك انخفاضا كبيرا في مضان TMRM بعد إضافة FCCP (الشكل 1C).

1D الرقم يدل على صورة مضان من الخلايا العصبية الفئران القشرية محملة DCF. بالإضافة إلى ذلك زادت من ₂ نتائج H ₂ O في DCF كثافة مضان في الهيئات الخلية (الشكل 1E). مستوى خط الأساس لم يتغير مضان DCF (أول 120 ثانية) قبل تطبيق H ₂ O _2. الوقت الفاصل بين قياسات مضان DCF تظهر مستوياته ثابتة ، مما يزيد من العلاج بعد ₂ H ₂ O (الشكل 1F).

الشكل 1. تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات ريوس الخلايا العصبية في الفئران الحية القشرية. (أ) صورة الممثل مضان من العصبونات القشرية محملة TMRM. بعد المسح الأساس TMRM مضان ، تم علاج الخلايا العصبية مع FCCP protonophore (1 ميكرومتر). إلى اليمين هو شريط من شدة pseudocolor مضان TMRM مع أقصى مشرق الأصفر والأسود تمثل الحد الأدنى من وحدتها ، على التوالي. فقدان مضان TMRM من المناطق الميتوكوندريا يشير إلى انهيار ΔΨm على العلاج FCCP (لوحة باء). تمثيل كمية التغير في كثافة TMRM مضان في نقاط زمنية مختلفة قبل وبعد العلاج FCCP يظهر في لوحة جيم (د) صورة من الخلايا العصبية الفئران الإسفار القشرية محملة H2DCF - DA. بعد تحديد خط الأساس DCF مضان ، تم علاج الخلايا مع 200 ميكرومتر H ₂ O ₂ ، وجرى تقييم التغيير في مضان DCF. زيادة في مضان DCF تعكس الزيادة في مستويات ريوس على العلاج ₂ H ₂ O (E). ويظهر التحليل الكمي للتغيير في مضان DCF ، قبل وبعد العلاج ₂ H ₂ O ، في شريط لوحة مقياس واو = 10 ميكرومتر

Video.7.1 -- labmedia 2704_Joshi.avi
يعيش التصوير خلية من الخلايا العصبية في TMRM القشرية قبل وبعد اضافة الهدف باستخدام FCCP 40X. كثافة pseudocolor يظهر الحد الأقصى (أصفر مشرق ، وذلك قبل إضافة FCCP) وانخفاض (اللون الأحمر ، وبعد إضافة FCCP) TMRM كثافة مضان بعد إضافة FCCP. انقر هنا لمشاهدة الفيديو

الفيديو. 7.5 -- labmedia 2704_Joshi.avi
يعيش التصوير خلية من الخلايا العصبية في DCF القشرية قبل وبعد إضافة ₂ H ₂ O باستخدام الهدف 40X. الأساس DCF ومضان أخضر فاتح اللون في أجسام الخلايا ويزيد من H2O2 بالإضافة العاصمةF كثافة مضان إلى اللون الأخضر الساطع. انقر هنا لمشاهدة الفيديو

Discussion

قدمنا ​​إجراء خطوة بخطوة يصف كيفية تحديد ΔΨm وريوس في العصبونات القشرية الفئران باستخدام المؤشرات TMRM الفلورسنت وDCF H ₂ - DA ، على التوالي. لأنواع الخلايا الأخرى ، فمن المهم تحديد تجريبيا تركيز النهائي والوقت لتحميل TMRM أو H ₂ - DA DCF. بوجه عام ، تتراوح التركيزات TMRM 2-20 نانومتر ، وفترة حضانة الخلية يختلف مع TMRM 20-60 دقيقة. تركيز النهائي من H ₂ - DA DCF يتراوح 2-10 ميكرون ، وحضانة الخلايا في محلول يحتوي على تحميل هذا المؤشر يختلف 30-45 دقيقة.

من المهم لتحسين قوة الليزر وسرعة مسح أخذ الصور لتجنب كل الصور سمية للخلايا والتغيرات في كثافة مضان (على سبيل المثال من الخفقان مضان TMRM) في غياب أي حافز. وينبغي ضبط الأمثل الضوئية نتيجة في إشارة مضان التي لم تنته أو تحت المشبعة (العتبة) في غياب التحفيز. تتحقق الظروف المثلى لجمع الصور من حقل محدد في السلطة ليزر خاص وسرعة الفحص عندما تكون هناك أي تغييرات في كثافة مضان لجنة التحقيق في ظل غياب أي حافز لمدة 10-15 دقيقة من التصوير الحي.

مضان تحقيقات أخرى لتحديد ΔΨm رودامين تشمل 123 ورباعي إيثيل الميثيل رودامين استر (TMRE). ومع ذلك ، تم العثور عليها لكبح عمليات التنفس في ² الميتوكوندريا المعزولة. الأهم من ذلك ، TMRM له أي تأثير على التنفس الميتوكوندريا في تركيزات منخفضة ⁽²⁾ ولقد الضيائية منخفضة وphotobleaching ³ بالمقارنة مع تحقيقات أخرى. H ₂ - DA DCF يعد مؤشرا جيدا لريوس كما يتم الاحتفاظ جيدا في الخلايا ، ويعترف للأكسدة أنواع عدة ، مثل البيروكسيدات ، وأكاسيد فائقة ، وأكسيد النيتريك ^4.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
طبق زجاج أسفل الثقافة	شركة ماتيك	P35G - 1.5 - 14 - C
NbActive4	BrainBits	NbActive4
TMRM	Invitrogen	T668
H 2 DCF - DA	Invitrogen	C400
كلوريد الصوديوم	سيغما	S6191
بوكل	سيغما	P3911
CaCl 2 • 2H 2 O	سيغما	C3306
MgCl 2 • 6H 2 O	سيغما	M2670
D - غلوكوز	سيغما	G6152
HEPES	Invitrogen	15630