ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Summary

الضوئية القرار المجهر الضوئي (OR - PAM) هو عبارة عن تقنية ناشئة قادرة على استيعاب التناقضات التصوير الضوئي في الجسم الحي مع القرار الخلوية والحساسية. هنا ، ونحن نقدم تعليمة تصور بشأن البروتوكولات التجريبية OR - PAM ، بما في ذلك مواءمة نظام تكوين النظام ، نموذجية في الجسم الحي الإجراءات التجريبية ، ومخططات التصوير وظيفية.

Abstract

وقد المجهر الضوئي ، وتوفير معلومات قيمة على المستويين الخلوي وعضية ، اعترف على نطاق واسع التكنولوجيا يعتبر الطب الحيوي مواتية. والدعائم الأساسية في الجسم الحي من ثلاثية الأبعاد (3 - D) المجهر الضوئي ، المجهر مضان single-/multi-photon والبصرية التماسك الرسم السطحي (أكتوبر) أظهرت حساسية غير عادية لمضان يتناقض نثر والبصرية ، على التوالي. ولكن ، على النقيض من امتصاص الأنسجة البيولوجية الضوئية ، والتي بترميز المعلومات الأساسية الفسيولوجية / المرضية ، لم يتم بعد تقييم.

وقد أدى ظهور photoacoustics الطب الحيوي لفرع جديد من المجهري البصرية الضوئية القرار المجهر الضوئي (OR - PAM) ¹ ، حيث تركز أشعة الضوئية للحد من الانحراف لتحقيق الخلوية ¹ أو حتى قرار التحت خلوية المستوى ² الجانبي. باعتباره مكملا قيما لتكنولوجيات القائمة المجهر الضوئي ، OR - PAM يجلب اثنين على الاقل من المستجدات. الأول والأهم من ذلك ، OR - PAM يكشف تناقضات امتصاص البصرية مع حساسية غير عادية (أي 100 ٪). الجمع بين الأصالة والمعاصرة مع OR - ³ أو مضان المجهر مع الضوئية نثر المستندة ⁴ أكتوبر (أو كليهما) يوفر خصائص بصرية شاملة من الأنسجة البيولوجية. الثانية ، OR - PAM بترميز امتصاص الموجات الصوتية البصرية في ، على النقيض من العمليات البصرية النقية في مضان المجهري وأكتوبر ، ويوفر خلفية خالية من الكشف. كشف الصوتية في حزب الأصالة والمعاصرة ، أو يخفف من آثار تشتت بصري على تردي الإشارة ويلغي بطبيعة الحال تدخلات ممكنة (أي crosstalks) بين الإثارة والكشف ، وهي مشكلة شائعة في مضان المجهري نظرا للتداخل بين الإثارة والأطياف مضان.

فريدة من نوعها للتصوير الضوئي الامتصاص ، وقد أثبتت OR - PAM التطبيقات الطبية الحيوية واسعة منذ اختراع ، بما في ذلك ، ولكن ليس على سبيل الحصر ، الأعصاب ^{5 ، 6} ، طب العيون ^{7 و 8 و} البيولوجيا الوعائية ⁹ ، و ¹⁰ الأمراض الجلدية. في هذا الفيديو ، ونحن نعلم تكوين النظام والمواءمة بين الأصالة والمعاصرة ، أو فضلا عن الإجراءات التجريبية لتصوير الاوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي وظيفية.

Protocol

1. نظام التكوين

1. البصري تشعيع
   1. مصدر الإشعاع الضوئي : الصمام الثنائي ضخ الصلبة للدولة نابض الليزر (INNOSLAB ، Edgewave) وصبغ ليزر (CBR - D ، السيرة).
   2. وتركز عدسة مكثف من قبل (LA1131 ، Thorlabs) لتمر من خلال ثقب صغير 50 ​​ميكرومتر (P50C ، Thorlabs) : شعاع الليزر الناتج (7 نانوثانية نبض العرض).
   3. يتم وضع الثقب بعيدا قليلا عن بؤرة العدسة المكثف لمباراة قطر الثقب مع قطر شعاع الأساسية في الوضع المكاني لتصفية فعالة.
   4. شعاع تصفيتها هو الموهن من تصفية محايدة الكثافة (NDC - 50C - 2M ، Thorlabs) ثم إضافة إلى واحد من الألياف البصرية وضع (P1 - 460A - FC - 2 ، Thorlabs).
   5. إخراج الألياف يملأ الفتحة الخلفية هدفا المجهر (RMS4X ، Thorlabs) لتحقيق التركيز حيود محدودة البصرية 2.6 ميكرومتر ~ في الطول الموجي من 570 نانومتر.
2. الكشف بالموجات فوق الصوتية
   1. محول بالموجات فوق الصوتية : 50 ميغاهرتز وسط تردد (V214 - BB - RM ، أوليمبوس ، NDT).
   2. يتم إرفاق محول بالموجات فوق الصوتية لالموحد محلية الصنع الصوتية البصرية شعاع ¹¹ للكشف عن الموجات فوق الصوتية ، والتي تتماشى مع محوري حيود الأشعة الضوئية محدودة.
   3. هي الأرض كروية وتجويف للخروج من قاع الموحد لإنتاج عدسة الصوتية. هذه العدسة الصوتية له فتحة عددية قدرها 0.5 في الماء ويعطي قطر الصوتية البؤرية من 43 ميكرومتر في وسط تردد 50 ميغاهرتز.
   4. يتم محاذاة البؤر الضوئية والصوتية confocally لزيادة حساسية الكشف.
3. اقتران الصوتية
   1. يعمل بالموجات فوق الصوتية اقتران الجافة لتجنب غمر حيوانات التجارب في مجال المياه ، والتي كانت تستخدم في وقت مبكر نظم التصوير الضوئي ^12.
   2. يتم فتح نافذة التصوير في الجزء السفلي من طبق بيتري (9 سم في القطر) ومختومة مع غشاء شفاف البولي بالموجات فوق الصوتية وبصريا.
   3. هلام بالموجات فوق الصوتية (صورة واضحة ، SonoTech) بين الغشاء البولي اثيلين والكائن إلى أن الأزواج تصوير الضوئي ولدت موجة من الاعتراض على طبق بيتري ، والماء منزوع الأيونات في طبق بتري الأزواج كذلك موجة لرئيس المغمورة التصوير OR - PAM .
4. إلكترونيات
   1. إشارة يتم تضخيمه الضوئي الكشف عنها بواسطة محول بالموجات فوق الصوتية من قبل اثنين من مكبرات الصوت تتالي (ZFL 500LN ، ميني الدوائر)
   2. هو إشارة رقمية تضخيمها من قبل الحصول على بيانات 14 بت (دق) متنها (14200 CompuScope ، غيج العلوم التطبيقية) بمعدل عينة من 200 MS / ثانية.
5. نظام المسح الضوئي
   1. يتم التحكم ثنائية الأبعاد (2 - D) النقطية مسح الرأس التصوير OR - PAM على طول الطائرة (س ص) الأفقي جهاز كمبيوتر شخصي ، والذي يطلق على كل من مجلس دق والليزر المضخة. مزامنة إشارة الزناد مع اشارة عقارب الساعة التدريجي من مجلس دق.
   2. يتم تعريف سريع للمحور الماسح 2 - D واتجاه مسح مستعرضة (B - المسح).
   3. يمكن الحصول على تسلسل من B - مسح الصور عن طريق ترجمة الرأس على طول محور التصوير البطيء لتكوين صورة الحجمي ، التي يمكن الاطلاع عليها سواء في تقديم 3 - D المباشرة أو في إسقاط الحد الأقصى لسعة 2 - D (MAP) صورة .

2. نظام التوافق

1. استخدام الموجات فوق الصوتية نبض الصدى وعاكس بالموجات فوق الصوتية لتحديد موقع الطائرة الاتصال الصوتي (أي تأخير الوقت من إشارة الزناد إشارة إلى نبض الصدى أقصى بالموجات فوق الصوتية). مطلوب هذه الخطوة التي يتعين القيام بها مرة واحدة فقط عند بناء نظام OR - PAM.
2. تعظيم كفاءة اقتران الألياف أحادية النمط.
3. تطبيق هلام بالموجات فوق الصوتية على رأس كائن استيعاب بصريا (على سبيل المثال ، قطعة من الشريط الأسود) وإرفاق برفق تحت نافذة التصوير في طبق بتري ملئت ماء منزوع الأيونات.
4. تخفيض رأس التصوير في الماء ، وإزالة فقاعات الهواء محاصرين تحت العدسة الصوتية.
5. ضبط مدير التصوير الضوئي حتى إشارة للكائن هو استيعاب طائرة من الاتصال الصوتي ، والتي يمكن أن يحكم من التأخير الصوتية.
6. ضبط الوضع الرأسي (أي موقف ض) هدف المجهر لتحقيق أقصى قدر من السعة للإشارة الضوئي ولدت من كائن مسطح. السعة مكبر إشارة إلى أن يتم محاذاة التركيز البصري السمعي مع التركيز في الاتجاه الرأسي.
7. توفيق أوضاع الأفقي (أي x و y وظيفة) هدف المجهر الضوئي حتى إشارة ولدت من الهدف يظهر نمط متماثل. التماثل يوحي بأن يتم محاذاة التركيز البصري السمعي مع التركيز في الاتجاه الأفقي.
8. كرر الخطوات من 2.6 و 2.7 حتى يتم تحسين إشارة الضوئي في كل من التماثل والسعة.

3. A سا الإجراء التجريبي في mple فيفو OR - PAM من الماوس الأذن الأوعية الدموية

1. غير مطلوبة هذه الخطوة من أجل الفئران عارية. تخدير الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من كوكتيل [وصفة : 1 مل الكيتامين (100 ملغ / مل) ، و 0.1 مل زيلازين (100 ملغ / مل) ، و 8.9 مل المالحة ؛ الجرعة : 0.1 ml/10 ز]. حلق الشعر في الأذن ، وكذلك يزيل الشعر الشعر المتبقية مع كريم SURGI (الفئة # : 82565 ، الاميركية الدولية للصناعات) قبل تنظيفها بالماء منزوع الأيونات. علما بأن إزالة الشعر من هذا القبيل قد تهيج الجلد قليلا الأوعية الدموية ، وبالتالي يتم تنفيذ أفضل قبل 24 ساعة من التجربة المزمعة.
2. بدوره على نظام الليزر الضوئي ، والتحقق من المحاذاة النظام.
3. تخدير الفأر مع 3 ٪ isoflurane المتبخرة من استنشاق الغاز (معدل تدفق نموذجي هو 1،0-1،5 لتر / دقيقة ، اعتمادا على وزن جسم الحيوان) ، والحفاظ على التخدير مع 1 ٪ isoflurane في كافة مراحل التجربة. ينصح الطبية الصف الهواء كما استنشاق الغاز للحفاظ على الماوس في حالة فسيولوجية طبيعية.
4. نقل الماوس إلى مرحلة المجسم ، والتحكم في درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية مع وسادة التدفئة.
5. تتسطح الأذن الماوس على لوحة بلاستيكية وتطبيق طبقة من الهلام الموجات فوق الصوتية في أعلى الأذن. تجنب احتباس فقاعات الهواء داخل الجل. ثم ، ضع الأذن التصوير تحت النافذة ورفع ببطء في المرحلة الحيوانية إلى أن اتصالات الموجات فوق الصوتية هلام الجزء السفلي من الغشاء البولي اثيلين. مطلوب اللاصقة اللينة بسبب الضغط على الأذن ضد الغشاء قد يؤثر على تدفق الدم في الأذن.
6. المشبك a نبض oximeter في ساقه الماوس أو الذيل لمراقبة حالتها الفسيولوجية ، وتطبيق مرهم للعين لمنع جفاف والتلف العرضي ليزر للعيون الماوس.
7. خفض رأسه حتى يتم التصوير عدسة مغمورة في الماء منزوع الأيونات الصوتية ، وإزالة فقاعات الهواء محاصرين تحت العدسة الصوتية.
8. التحقق من فلوينس الليزر للتأكد من وجوده ضمن معايير السلامة ليزر للمعهد الوطني الأمريكي للمعايير ^13. ينبغي أن فلوينس الليزر لا تتجاوز 20 مللي جول / سم ² ، وهو ما يترجم إلى 80 نيوجيرسي الطاقة نبضة ليزر عندما تركز شعاع الليزر في 150 ميكرون تحت سطح الجلد.
9. ضبط الليزر لوضع الخارجي الزناد وبدء المسح الضوئي للمحاكمة. ضبط الموقف ض الرأس حتى التصوير الضوئي أقواهما هو من الطائرة الاتصال الصوتي.
10. تعيين المعلمات الصحيح المسح والبدء في الحصول على الصور الرسمية.
11. بعد التجربة ، وإيقاف ليزر ، ورفع الرأس التصوير خارج الماء منزوع الأيونات ، وانخفاض في المرحلة الحيوانية إلى إطلاق سراح الفأر ، وتنظيف الأذن الفأر مع الماء منزوع الأيونات ، إيقاف نظام التخدير وتحكم في درجة الحرارة ، وتفريغ الماوس من مرحلة المجسم.
12. إذا كان المطلوب تصوير المتكررة ، ووضع الماوس في حاضنة مع درجة حرارة البيئة التي حددت في 37 درجة مئوية. عودة الماوس إلى منشأة الحيوان بعد أن يستيقظ بشكل طبيعي. خلاف ذلك ، اتبع بروتوكولات الحيوانية لeuthanatize والتخلص منها.

4. وظيفية أو حزب الأصالة والمعاصرة ، من التركيز الكلي وتشبع الأوكسجين من الهيموغلوبين

1. الأوكسي هيموغلوبين (HBO ₂₎ وديوكسي هيموغلوبين (HBR) هي الأشكال الرئيسيتين من الهيموغلوبين ، والغالب المصدر الضوئي الذاتية في النطاق الطيفي المرئي. HBO ₂ و HBR ومتميزة الأطياف امتصاص البصرية ، وبالتالي يمكن أن تكون متمايزة طيفيا لقياس التركيز الكلي على حد سواء (HBT) وتشبع الأوكسجين (SO ₂₎ من الهيموغلوبين ^5. هنا مجموعتان من المبادئ التوجيهية للمساعدة في اختيار المناسب للموجات الضوئية قياسات ₂ بحيث :
2. يجب أن يتم تحديد موجات داخل Q - الفرقة من الهيموغلوبين طيف الامتصاص (أي 550-600 نانومتر) لضمان وجود ما يكفي من الإشارات إلى نسبة الضوضاء والاختراق الكافي.
3. ينصح موجات حيث معاملات امتصاص HBO ₂ و HBR يملك الفرق واضح (على سبيل المثال ، HBR المهيمنة نانومتر 561 و HBO ₂ - المهيمنة 578 نانومتر).

إلى جانب ذلك ₂ ، يمكن حساب HBT بإضافة [HBR] و [HBO _2] معا ، أو يمكن قياسه مباشرة على موجات isosbestic من الأطياف الانقراض المعامل المولي من الهيموغلوبين (مثلا ، 530 نانومتر ، 545 نانومتر ، 570 نانومتر ، و 584 نانومتر) ¹⁴ ، حيث HBR وHBO ₂ متساوية معاملات المولي الانقراض.

5. ممثل النتائج :

هو مبين في الشكل رقم 1 هو تشريح الأوعية الدموية وذلك في ₂ الأذن الماوس يعيشون عراة التقط بواسطة الطول الموجي المزدوج (561 و 570 نانومتر) أو حزب الأصالة والمعاصرة. والحصول على الصور النمطية الوقت لذلك الطول الموجي المزدوج ₂ قياسات مثل هذه المنطقة من الفائدة (حجم الصورة : 10 ملم × 10 ملم ، وحجم الخطوة : 2.5 ميكرومتر × 5 ميكرون) هو ~ 80 دقيقة.

p_upload/2729/2729fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. المجهر الضوئي في الاستبانة فيفو الضوئي. صور خريطة (أ) تركيز الهيموغلوبين مجموع يظهر تشريح الأوعية الدموية (المكتسبة في 570 نانومتر) و (ب) الأكسجين تشبع الهيموجلوبين (المكتسبة في 561 نانومتر ونانومتر 570) في أذن الفأر عارية. (C) عن قرب في المنطقة محاصر في لوحة (A). شريط النطاق في لوحة (أ) ينطبق على كل من (أ) و (B)

Discussion

في هذا الفيديو ، ونحن نقدم تعليمات مفصلة بشأن البروتوكولات التجريبية OR - PAM ، بما في ذلك تكوين النظام ، والمحاذاة النظام ، والإجراءات التجريبية النموذجية. وقد مكن حزب الأصالة والمعاصرة أو التسمية خالية من موسع دراسات أداء الاوعية الدموية الدقيقة والتمثيل الغذائي على...

Materials