يعيش التصوير الكالسيوم الخلية المشتركة مع وساطة سيرنا إسكات الجينات يحدد كا 2 + قنوات تسرب في غشاء ER وآلياتها التنظيمية

Summary

في شبكية هيولي باطني يلعب دورا رئيسيا في نشوء حيوي في البروتين والكالسيوم. لقد أنشأنا نظاما التجريبية التي تسمح لنا لمعالجة دور قنوات + CA2 وتسرب لتوصيف آلياتها التنظيمية المفترضة. هذا النظام ينطوي على إسكات الجينات بوساطة سيرنا والخلية الحية CA2 + التصوير.

Abstract

في خلايا الثدييات ، وشبكية هيولي باطني (ER) يلعب دورا رئيسيا في نشوء حيوي البروتين والكالسيوم وكذلك في إشارة ^1. وheterotrimeric Sec61 معقدة في الغشاء ER يوفر مسارا مائي لالبروتينية حديثا توليفها في التجويف من لائحة. العمل الأخير من مختلف المختبرات واقترح أن هذا المجمع قد تشكل أيضا heterotrimeric كا عابر ^{2 +} قنوات تسرب ^2-8. كانت الملاحظة الرئيسية لهذه الفكرة التي تطلق من البروتينية الوليدة من الريبوسوم والمعقدة التي Sec61 بوروميسين يؤدي إلى الإفراج عابر كا ^{2 +} من لائحة. علاوة على ذلك ، فقد لوحظ في المختبر أن يشارك البروتين اللمعية ER بيب في منع نفاذية أيون على مستوى ^9،10 Sec61 المجمع. لقد أنشأنا نظاما التجريبية التي تسمح لنا لمعالجة مباشرة لدور مجمع Sec61 المحتملة كما كا قناة ^{+ 2} وتسرب لتوصيف آلياتها التنظيمية المفترضة ^11-13. هذا النظام يجمع بين إسكات الجينات بوساطة سيرنا والخلية الحية كا ^{2 +} التصوير ^13. تعامل مع الخلايا siRNAs الموجهة ضد الترميز والمنطقة غير المترجمة (UTR) على التوالي ، من الجينات أو SEC61A1 سيرنا السيطرة السلبية. في تحليل تكامل ، هي الخلايا المشترك مع ناقلات transfected IRES - GFP التي تسمح للمقاومة سيرنا التعبير عن الجينات SEC61A1 wildtype. ثم يتم تحميلها على الخلايا التي تحتوي على الكالسيوم ratiometric - ^{2 +} مؤشر FURA - 2 لرصد التغيرات في وقت واحد في عصاري خلوي كا ^{2 +} التركيز في عدد من الخلايا عبر مجهر مضان. القياس المستمر للعصاري خلوي كا ^{2 +} يسمح أيضا لتقييم تأثير عوامل مختلفة ، مثل بوروميسين ، مثبطات جزيء صغير ، وعلى thapsigargin كا ^{2 +} التسرب. هذا النظام التجريبي يعطينا فرصا فريدة لط) تقييم مساهمة مختلف البروتينات إلى غشاء ER السلبي كا ^{2 +} هروب من لائحة في مختلف أنواع الخلايا ، والثاني) توصيف البروتينات والآليات التي تحد من هذا كا ^{2 +} السلبي هروب رأس المال ، و ج) دراسة آثار الطفرات المرض المرتبط في العناصر ذات الصلة.

Protocol

1. إعداد الحلول الأسهم

1. يعد الكالسيوم الخالية العازلة (كلوريد الصوديوم 140 ملم ، 5 ملم بوكل ، 1 ملم MgCl ₂ ، 0.5 مم EGTA ، 10 ملم في الجلوكوز 10 ملي KOH - HEPES ، (الرقم الهيدروجيني 7،35)).
2. Solubilize FURA ، 02:00 DMSO في الحصول على الأسهم 1 مم الحل. مزيج باستخدام الدوامة حتى الحل هو متجانس أصفر فاتح. حماية كوب من الضوء. تمييع FURA ، 02:00 محلول المخزون في 1 مل Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين إلى تركيز النهائي من 4 ميكرومتر لتحميل خلايا هيلا.
3. إعداد بوروميسين 12.5 ملي حل الأسهم في الماء المقطر (الرقم الهيدروجيني 7.0). aliquots المحل في -20 درجة مئوية. تمييع بوروميسين 12.5 ملي حل الأوراق المالية في المنطقة العازلة خالية من الكالسيوم إلى التركيز النهائي للبوروميسين ميكرومتر 500.
4. حل thapsigargin DMSO في الحصول على أسهم 1 مم الحل.
5. Solubilize 1 ملغ ophiobolin A في 20 ميكرولتر كلوروفورم ، وبعد ذلك المزيج مع 25 DMSO ميكرولتر. الأنبوب microcentrifuge يظل مفتوحا حتى يتم تبخير الكلوروفورم. وبالتالي هناك تركيز ophiobolin النهائي هو 100 ملم. aliquots المحل في -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، تمييع الأسهم إلى حلول العازلة الكالسيوم حرا في التركيز النهائي من 100 ميكرومتر. وهكذا ، DMSO تركيز النهائي للتصوير الخلايا الحية لا تتعدى 0.1 ٪.
6. حل تريفلوبيرازين في DMSO إلى تركيز من 10 ملم ومخزن في aliquots -20 درجة مئوية. تمييع الأسهم إلى حلول العازلة الكالسيوم حرا في التركيز النهائي من 10 ميكرومتر قبل الاستخدام. وبالتالي تركيز DMSO النهائية لتصوير الخلايا الحية ، مثل لophiobolin ألف ، لا تتجاوز 0.1 ٪.
7. حل siRNAs (SEC61A1 سيرنا وسيرنا SEC61A1 - UTR وسيرنا السيطرة) في الماء ريبونوكلياز مجانا لإعداد المخزون 20 ميكرومتر الحل. مزيج باستخدام الدوامة ومراقبة solubilization بالعين. تخزين 50 aliquots ميكرولتر في -20 درجة مئوية.

2. إسكات الجينات في خلايا هيلا

من أجل دراسة مساهمة بروتين معين لائحة كا ^{2 +} هروب رأس المال ، وهذا الجين منها أن تصمت بكفاءة مع اثنين siRNAs المختلفة (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، أثر إسكات لابد من التغلب عليها عن طريق التعبير عن الجين نوع البرية منها. عادة ما نستخدم siRNAs الموجهة ضد ترميز وغير الترميز المنطقة (UTR) على التوالي ، من الجينات في المصالح. توظيف UTR توجيه سيرنا يوفر طريقة ملائمة للتكامل.

1. البذور 5.2 × 10 ⁵ خلايا هيلا (آي تي سي سي أي. CCL - 2) في طبق ثقافة 6 سم مع زلة تغطية 25 ملم (ما قبل المعالجة مع 200 ميكرولتر من بولي - L - يسين (1 ملغ / مل) لمدة 1 ساعة) في Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين واحتضان عند 37 درجة مئوية في بيئة ترطيب مع 5 ٪ CO ₂ (الحجم النهائي 3،9 مل).
2. Transfect الخلايا مع SEC61A1 سيرنا وسيرنا SEC61A1 - UTR أو سيرنا السيطرة السلبية باستخدام الكاشف HiPerFect وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (تركيز النهائي من سيرنا : 20 نانومتر). لفترة وجيزة ، وإعداد siRNAs الطازج في أنبوب microcentrifuge منفصلة قبل إجراء ترنسفكأيشن الفعلي : أضف 20 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن HiPerFect إلى 4 ميكرولتر من كل سيرنا (20 ميكرومتر) التي حلت في 80 ميكرولتر من OptiMEM. وهذا المزيج بلطف vortexed وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. إضافة مزيج سيرنا (104 ميكرولتر) قطرة قطرة إلى 5.2 × 10 المصنفة خلايا هيلا ⁵ (3.9 مل).
3. بعد 24 ساعة ، وتغيير المتوسط ​​(3.9 مل) ، وtransfect الخلايا للمرة الثانية مع نفس مزيج سيرنا (104 ميكرولتر).
4. تقييم إسكات من خلال تحليل لطخة غربية. ينبغي أن يكون أعلى من 80 ٪. غسل الخلايا من الخلية صحن الثقافة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، وحصادها في DMEM. عدد الخلايا التي تستخدم في مكافحة الكونتيسة خلية الآلي. ليز الخلايا في خلية تحلل العازلة (10 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 3 مم MgCl ₂ ، 0،5 ٪ NP40) تستكمل مع كوكتيل مثبط البروتياز ، (3 ميكروغرام / مل Pepstatin A ، 3 ميكروغرام / مل Leupeptin و 3 ميكروغرام / مل Antipain و 3 ميكروغرام / Chymastatin مل) ، والاختلاط مع SDS - عينة العازلة (60 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 6.8 ، SDS 2 ٪ ، والجلسرين 10 ٪ ، 5 ٪ β - المركابتويثانول ، 0.01 ٪ برومفينول الزرقاء ) للحصول على التركيز النهائي من 10.000 خلية / ميكرولتر. عينات الحرارة عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وبعد ذلك إضافة بعض حبات غلاس ودوامة لمدة 20 دقيقة إلى تفتيت الحمض النووي. 20 ميكرولتر منفصلة من كل عينة من الصفحات SDS Laemmli من نوع (عادة 15 ٪ polyacrylamid للهلام فصل). نقل البروتينات على فصل غشاء PVDF بواسطة electroblotting ("الرطب وصمة عار") في 400 مللي أمبير المستمر لمدة 3 ساعات أو طوال الليل في نقل العازلة (100 ملي Glycin ، 12.5 ملي تريس - HCL). بعد ذلك ، مع كتلة 5 ٪ (W / V) منخفضة من الدهون في الحليب المجفف في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم فضح وصمة عار على الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد محطة - C من Sec61α من الأرانب ومكافحة - β - أكتين الضد من الماوس. تغسل وصمة عار في برنامج تلفزيوني - 100 - TritonX (0.05 ٪) و tأورده في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، على التوالي. تصور الأجسام المضادة الأولية باستخدام ECL الصفيف الماعز المضادة للأرنب مفتش - Cy5 أو ECL الصفيف الماعز مكافحة الفأر مفتش - Cy3 - المتقارن ونظام التصوير الثلاثي - اعصار في تركيبة مع صورة كوانت TL 7.0 البرمجيات. في حالة الجين SEC61A1 ، وينظر عادة تأثير إسكات أقصى 96 ساعة بعد ترنسفكأيشن الأولى. ويرد تجربة تمثيلية في الشكل. 2.

3. تتام من خلايا هيلا

وكان من أجل إنقاذ النمط الظاهري من إسكات SEC61A1 ، إدراج SEC61A1 [كدنا] في موقع استنساخ متعددة (MCS) لموقع pCDNA3 - الداخلي دخول الريباسي (IRES) - GFP النواقل التي تتضمن المضخم للخلايا (CMV) المروج ، والإشراف ، وIRES ، بالإضافة إلى البروتين fluoresecent الخضراء (GFP) تسلسل الترميز.

1. 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن سيرنا الأول ، تبادل المتوسط ​​(3.9 مل) للمرة الثانية وتحويل الخلايا إما مع ناقلات فارغة أو SEC61A1 التعبير البلازميد باستخدام Fugene HD وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (نسبة النهائية للمتجه إلى HD Fugene هو 4 ميكروغرام متجه إلى 16 HD Fugene ميكرولتر). لفترة وجيزة ، وإعداد البلازميدات الطازج في أنبوب microcentrifuge منفصلة قبل إجراء التحويل : إضافة 16 ميكرولتر التحول HD Fugene كاشف إلى 4 ميكروغرام لكل البلازميد التي حلت في 80 ميكرولتر من OptiMEM. دوامة بلطف واحتضان هذا المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. إضافة مزيج البلازميد (0.1 مل) قطرة قطرة إلى المصنف 5.2 × 10 ⁵ خلايا هيلا (3.9 مل).
2. بعد 48 ساعة من التعبير البلازميد ، والأطباق الثقافة خاضعة لمضان المجهري قبل التصوير الكالسيوم والحصاد. إذا لزم الأمر استبدال DMEM بواسطة إشارات لأفضل برنامج تلفزيوني مضان. تسجيل الصور على مضان المجهر مضان مزودة كاميرا CCD تبريده. ويمكن تحديد كفاءة التحول عن طريق قسمة عدد الخلايا عرض GFP مضان من قبل خلايا عدها في وضع brightfield وينبغي أن تكون فوق 80 ٪. ويرد في الشكل نتيجة نموذجية. 3.

4. التصوير الخلية الحية الكالسيوم

1. قبل القياس ، ونقل زلة تغطية المغلفة مع خلايا هيلا transfected في طبق منفصل 3.5 سم الثقافة. تحميل الخلايا مع 4 ميكرومتر FURA - 2 صباحا في DMEM 1 مل لمدة 45 دقيقة عند درجة حرارة 25 مئوية في ^11،12 الظلام.
2. إصلاح غطاء 25 مم الانزلاق في غرفة معدنية وغسل خلايا iMIC مرتين واحتضان العازلة في الكالسيوم الحرة (في كل مرة 300 ميكرولتر).
3. البدء في جمع البيانات على المجهر iMIC الخامس مع الملون بواسطة مثيرة بالتناوب في 340 نانومتر و 380 نانومتر وقياس مضان المنبعثة بنحو 510 نانومتر (تعيين مرشح : beamsplitter ، 565 نانومتر ؛ باعث ، نانومتر 605/70). عينة من الصور التي تحتوي على خلايا 20-50 / 3 الإطار كل ثانية. سجل FURA - 2 اشارات ونسب F340/F380 ، حيث F340 F380 وتتوافق مع كثافة مضان الخلفية تطرح في 340 و 380 نانومتر ، على التوالي.
4. بعد 1 دقيقة ، وعلاج الخلايا مع بوروميسين (500 ميكرومتر) في المخزن ، الكالسيوم الحرة أو مع المخزن نفسه. بدلا من ذلك ، علاج الخلايا مع مثبط جزيء صغير (مثل تريفلوبيرازين ميكرومتر 10 أو 100 ميكرومتر ophibolin A) أو مع عازلة خالية من الكالسيوم.
5. بعد أن يتم إجراء قياسات ratiometric خارج عن 2 أو 10 دقيقة ، إضافة thapsigargin (1 ميكرون) والاستمرار في القياسات.
6. في نهاية المطاف ، cytoslic [كا ^{2 +]} تقدر نسبة من القياسات بواسطة أسلوب المعايرة المعمول بها. ² تحليل البيانات اكسل 2007 والمنشأ 6.1.

5. ممثل النتائج :

حتى الآن ، تناولنا مسألة ما إذا كان إسكات الجين يؤثر SEC61A1 الكالسيوم (كا ^{2 +)} تسرب من لائحة (الشكل 1). وكان إسكات الجين SEC61A1 من قبل اثنين من siRNAs مختلفة في خلايا هيلا لمدة 96 ساعة. بينما لا يكاد يؤثر إسكات نمو الخلايا وقدرتها على البقاء ، وكان نقل البروتين إلى لائحة شبه permeabilized الخلايا تماما تقريبا الكبت. وعلاوة على ذلك ، تأثرت بشدة من الخلايا SEC61A1 إسكاته فيما يتعلق تسرب الكالسيوم ^{+ 2} من لائحة. وقد انعكس تأثير إسكات الجينات التي التعبير عن الجينات SEC61A1. وهكذا ، Sec61 المجمعات التي تكون موجودة في الغشاء ER جميع الخلايا الأنوية شكل كا ^{2 +} قنوات تسرب يمكن أن يتوقع منها أن تلعب دورا حاسما في كا ^{2 +} التوازن. ومع ذلك ، فإن وجود مسام كبيرة مملوءة بالماء ، مع نفاذية أيون غير المنضبط ، التي تشكلت على النحو الذي Sec61 المجمعات في الغشاء ER ، سوف تتدخل بجدية مع الافراج عن تنظيم الكالسيوم من ^{2 +} من التجويف ER في العصارة الخلوية ، آلية أساسية لجواني الإشارة. حددنا (CAM) كالمودولين عزر ملزم في نهاية - N عصاري خلوي من الثدييات التي Sec61α CAM ملزمة ولكن ليس كا ^{2 +} خالية apocalmodulin مع تقارب nanomolar وخصوصية التسلسل. على المستوى الخلوي ، حفزت two الخصوم كاميرا مختلفة كا ^{2 + اطلاق سراح من لائحة في وجود ولكن ليس في عدم وجود قنوات Sec61 (التين 4 و 5). لم يكن لوحظ هذا الأخير عندما كانوا حاضرين Sec61 القنوات التي تحتوي على طفرات في عزر من الذكاء Sec61α. وهكذا ، كا 2 + تشارك - CAM في الحد من تسرب الكالسيوم 2 + من ER (الشكل 6).}

الشكل 1. تدفق التخطيط. انظر النص للحصول على تفاصيل.

الشكل 2. تحليل البيانات لإسكات الكفاءة. تم تقييم إسكات بواسطة تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة التي كانت موجهة ضد Sec61α وβ - الأكتين (تحميل السيطرة). كانت الأجسام المضادة الأولية تصور باستخدام الأجسام المضادة ECL الصفيف الثانوية والتصوير مضان.

الشكل 3. تحليل البيانات لكفاءة ترنسفكأيشن. وسجلت الصور على المجهر مضان مجهزة بكاميرا CCD تبريده. ويمكن تحديد كفاءة التحول عن طريق قسمة عدد الخلايا عرض GFP مضان من قبل خلايا عدها في وضع brightfield.

وعولج لقطات الشاشة الشكل 4. التصوير الخلية الحية من الكالسيوم من خلايا هيلا في وجود مراقبة أو SEC61A1 سيرنا وجود أو غياب الخلايا CAM - خصم ophiobolin هيلا ألف مع سيرنا الموجهة ضد SEC61A1 (B) أو السلبية تحكم سيرنا (A) لمدة 96 ساعة كما هو محدد. تم تحميل هذه الخلايا مع المؤشر الكالسيوم FURA - 2 صباحا والمحتضنة في كا ^{2 +} أضيف عازلة خالية تحتوي على 0.5 ملي EGTA ، ثم عازلة أو ophiobolin A (Ophio A) في المخزن المؤقت واستأنف الحضانة. بعد 10 دقيقة ، كا ^{2 +} بدأ الإفراج عن طريق تطبيق thapsigargin (TG) في غياب كا ^{2 +} الخارجية واصلت الحضانة. واتخذت لقطات الشاشة من التصوير المستمر الكالسيوم في الأوقات المحددة.

الشكل 5. تحليل البيانات ليعيش تجارب الخلايا التصوير الكالسيوم. (أ) التحليل الحركي والكمي لسلسلة من التجارب كما هو مبين في الشكل. 4A. Cytoslic [كا ^{2 +]} وقدرت نسبة من القياسات بواسطة أسلوب المعايرة المنشأة ^2. ويظهر تأثير thapsigargin كما مخطط بار. وعولج دينار بحريني () مع خلايا سيرنا التحكم أو أشارت SEC61A1 - سيرنا لمدة 48 ساعة وتتحول بعد ذلك مع مكافحة ناقلات إما (C) ، أو التعبير SEC61A1 البلازميد (C) ، أو متحولة SEC61A1 التعبير البلازميد (D) كما هو مبين. بعد 48 ساعة ، وقد أجريت تجارب على التصوير الكالسيوم كما في التين 4 و 5A. التحليل الإحصائي للتغيرات في عصاري خلوي كا ^{2 +} تركيز بعد إضافة thapsigargin في مثل هذه التجارب كما هو موضح في المقدمة هي A. تم تعريف القيم P <0.001 كما كبيرا من خلال اختبار ر مزاوج ويشار إلى ثلاثة نانوثانية (***)،النجمية ، وليس كبيرا. يشار إلى أن أعداد الخلايا التي تم تحليلها. وتعطى القيم المتوسط ​​، تمثل أشرطة الخطأ أخطاء القياسي من الوسائل (SEM). نلاحظ أن تم تكييف هذه الأمثلة من المرجع. 13.

الرقم 6 ، وهذه البيانات تشير إلى أن الإفراج عن سلاسل الوليدة من مجمع Sec61 يؤدي فعلا إلى إطلاق سراح الكالسيوم من لائحة وتشكيل nanodomain الكالسيوم حول الفم عصاري خلوي من مجمع Sec61. يرتبط هذا كالمودولين الكالسيوم والكالسيوم كالمودولين إغلاق مجمع Sec61 ".

Discussion

في خلايا الثدييات ، وشبكية هيولي باطني (ER) يلعب دورا رئيسيا في نشوء حيوي البروتين وكذلك في إشارة الكالسيوم. هنا ، وقد وصفت لنا نظام التجريبية التي تسمح لنا للتصدي بشكل مباشر على دور قناة واحدة الكالسيوم ^{+ 2} تسرب محتمل لتوصيف وآلياتها التنظيمية المفترضة ^13. هذا النظام التجريبي يعطينا فرصا فريدة لط) تقييم مساهمة مختلف البروتينات إلى غشاء ER السلبي كا ^{2 +} هروب من لائحة في مختلف أنواع الخلايا ، والثاني) توصيف البروتينات والآليات التي تحد من هذا كا ^{2 +} السلبي هروب رأس المال ، و ج) دراسة آثار الطفرات المرض المرتبط في العناصر ذات الصلة.

نلاحظ أنه ينبغي تحليل الخلايا الوحيد القابل للتطبيق والجدوى الشاملة التي يجب أن تكون فوق 80 ٪. لذلك ، يتم تقييمها بشكل روتيني بقاء الخلية توظيف النووية معرف بقاء الخلية الزرقاء / الخضراء كاشف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. وعلاوة على ذلك ، والتحليل الإحصائي للتغيرات في عصاري خلوي كا ^{2 +} تركيز إلزامي. لذلك ، يجب أن تكون التجارب التي أجريت على أربع دفعات مختلفة من الخلايا وcoverslips مع اثنين لا يقل عن 20 خلايا لديك ليتم تحليلها من أجل كل حالة في تجربة واحدة. نلاحظ أن التجارب المختلفة والتي يتعين الاضطلاع بها في نفس الوقت بعد البذر على زلات الغطاء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
DMEM + GlutaMAX	Invitrogen	31966
OptiMEM + GlutaMAX	Invitrogen	51985
FBS	Biochrom	S0115
البنسلين / الستربتوميسين	PAA	P11 - 010
HiPerFect	Qiagen	301707
Fugene HD	روش تشخيص	04709713
معرف النووية الأزرق / الأخضر كاشف بقاء الخلية	انزو العلوم الحياتية	ENZ - 53004
FURA ، 02:00	Invitrogen	F - 1221
بوروميسين	سيغما	ف 7255
Thapsigargin	Invitrogen	T - 7459
Ophiobolin A	انزو العلوم الحياتية	ALX ، 270-109
تريفلوبيرازين	سيغما	تي 6062
كونتيسة ® الآلي خلية مكافحة	Invitrogen
الاعصار الثلاثي نظام التصوير	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية
TE2000 - S المجهر مع DS - 5Mc الكاميرا	نيكون
iMIC المجهر الخامس مع الملون	حتى الضوئيات