عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

Summary

ووصف طريقة سريعة للحصول على الكريات البيض التسلل من الدماغ الفئران. هذه الطريقة تستخدم الانحدار المستمر والمتقطع Percoll التدرج Ficoll لتحديد وتنقية طبقة الكريات البيض المخصب. ثم قد تكون معزولة الكريات البيضاء التي تتميز قياسات تدفق cytometric.

Abstract

نحن تصف طريقة لإعداد الكريات البيضاء في الدماغ التسلل (BILs) من الفئران. نحن لشرح كيفية تصيب الدماغ و النخاع الفئران مع فيروس تايلر الفئران (TMEV) عبر تقنية الحقن داخل الجمجمة السريع ، وكيفية تنقية سكان الكريات البيض المخصب من الخلايا التسلل من الدماغ كله. باختصار ، هي تخدير الفئران مع isoflurane في غرفة مغلقة وخالية من ناحية حقن حقنة مع هاميلتون في القشرة الأمامية. ثم يتم قتل الفئران في أوقات مختلفة بعد العدوى عن طريق جرعة زائدة isoflurane والعقول كلها تستخرج والمتجانس في RPMI مع طاحونة Tenbroeck الأنسجة. وطرد الخليط الدماغ من خلال التدرج المستمر Percoll 30 ٪ لازالة الانقاض الخلية الميلين وغيرها. وتوترت ثم تعليق خلية في 40 ميكرون ، وغسلها وطرد على التدرج متقطع بلس Ficoll - Paque لتحديد وتنقية الكريات البيض. ثم يتم غسل الكريات البيض ومعلق في مخازن مناسبة لimmunophenotyping بواسطة التدفق الخلوي. التدفق الخلوي يكشف عن مجموعة من الخلايا المناعية الفطرية في المراحل المبكرة من العدوى في الفئران C57BL / 6. إصابة آخر في 24 ساعة ، مجموعات فرعية متعددة من الخلايا المناعية الموجودة في BILs ، مع السكان المخصب من GR1 ⁺ ، ⁺ CD11b وخلايا ⁺ F4/80. ولذلك ، فإن هذه الطريقة مفيدة في وصف رد الفعل المناعي للعدوى حادة في الدماغ.

Protocol

1. حقن الفيروس داخل القحف :

تم تعديل هذه التقنية المستخدمة على نطاق واسع التالية والتي مختبرنا والزملاء. لفترة وجيزة ، والحقن داخل القحف من سلالة من التهاب الدماغ و النخاع دانيال فيروس تايلر الفئران (TMEV) أو صورية العدوى (1 ، 10) والتي أجريت على الفئران الشباب (يفضل 5-6 اسابيع من العمر) لانتزاع الكريات البيضاء في الدماغ التسلل (BILs). يرجى ملاحظة أن النتائج ستختلف بين سلالة دانيال ، من سلالة فول ، وسلالة GDVII. لغرض حصاد BILs والفئران تتلقى 2x10 ⁵ من PFU TMEV والمصابين لمدة 24 ساعة.

1. إرفاق الإبرة الحقن (27 قياس ، في ربع ، كندال) ، لتلقائي 1 مل حقنة هاملتون وتعيين لتسليم 10 ميكرولتر من الفيروس.
2. وضع TMEV في 10 ميكرولتر DMEM في المحاقن مع الاهتمام الدقيق لفقاعات الهواء. عندما يكون ذلك مناسبا ، والفئران المصابة صورية على 10 ميكرولتر من DMEM خالية من الفيروسات.
3. فقط قبل الحقن ، صب حوالي 1 مل من isoflurane في جرة الجرس الذي يحتوي على أسلاك الشبكة مع الركيزة القطن تحتها.
4. الفئران direclty مكان على شبكة الأسلاك في جرة الجرس حتى تصبح تخدير طفيفة ، غير حساسة لقرصة أخمص قدميها ، وثبتوا من مخدر نشوق ، وحوالي 10-15 ثانية. وينبغي أن الفئران لا تأتي في اتصال مباشر مع isoflurane ، كمادة يمكن مزعجة والصودا الكاوية.
5. في حين تحت تأثير التخدير ، وإعداد للحقن الفئران عن طريق تحديد إحداثيات المناسبة بسرعة في منطقة القشرة الأمامية على الجمجمة باستخدام الحلاقة والتحبير. الموقع العام للحقن هو 1 ملم الأمامي لbregma 1 ملم والوحشي للخياطة السهمي على الجانب الأيمن (الشكل 1). في حين حقن المجسم قد تكون ملائمة لبعض الحالات التجريبية ، وجدنا أن حرة مباشرة من دون حقن الحلاقة أو التحبير هو مناسب للغالبية التجارب. فراق الفراء مع نقطة على طول الإبرة المحورين المناسب للحقن.
6. لإجراء الحقن ، وتوجيه عمودي الإبرة إلى الصحافة من خلال الجمجمة والعظام وبعمق حوالي 3 ملم.
7. أعرب عن الفيروس إلى الدماغ عن طريق الضغط على زر أسفل حقنة هاميلتون والانتظار 2 ثانية للفيروس بالدخول الى المخ قبل ان تنسحب.
8. إزالة الإبرة بعناية ووضع الماوس في قفص ونظيفة وجافة. الفئران افاقته بسرعة واستئناف وظيفة عادية في غضون دقائق. قد يعطي الاهتمام المناسب على الفئران أن تظهر عليهم أعراض غير طبيعية ، مثل النزيف من موقع الحقن ، والقتل الرحيم للحيوان يكون مناسبا. يجب أن تتبع الحيوانات السليمة التعامل مع ⁶ والتمسك المعاهد الوطنية للصحة ورعاية الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للجنة الاستخدام.

2. الدماغ التسلل الكريات البيض إعداد الخلية :

1. تعد الجولة القاع أنابيب الطرد المركزي التي يمكن أن أوك ريدج عقد قدرة 30 مل مع RPMI مل 10 1640 ، 9 Percoll مل و 1 مل PBS 10X ومواسير يجب الجلوس على مقاعد البدلاء RT على الدماغ أثناء عملية الإزالة.
2. جلب Ficoll Paque - Plus لدرجة حرارة الغرفة (RT).
3. الموت ببطء الحيوانية isoflurane تعديل جرعة زائدة ⁽⁵⁾ وإزالة بسرعة باستخدام أنسجة الدماغ الفولاذ المقاوم للصدأ ملعقة وضعها في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 5 مل RPMI على الجليد. في بعض الظروف ، قد يكون PBS - نضح المناسبة لإزالة الخلايا الدموية المحيطية تعميم من إعداد BILs. وينبغي أن يكون كاملا والفئران بشكل صحيح تخدير قبل PBS - الارواء.
4. نقل الدماغ وRPMI حل ل7 مل زجاج بيركس طاحونة العلامة التجارية الأنسجة Tenbroeck والتجانس بلطف مع 10-15 السكتات الدماغية.
5. الماصة إضافي 5 مل RPMI في الخالط والماصة صعودا وهبوطا مرتين. نقل جناسة الدماغ (حوالي 10 مل) إلى أنبوب الجولة القاع معدة مسبقا وعكس بلطف 2-3 مرات إلى مزيج.
6. تدور في الدماغ جناسة _افي 7800g لمدة 30 دقيقة في الدوار RT في الزاوية الثابتة F0360 في جهاز للطرد المركزي بيكمان X - 22R أليجرا السريرية.
7. بعد الطرد المركزي ، وإزالة الأنقاض التي الميلين طرحت في قمة الانحدار. جمع طبقة الكريات البيض التي تعوم فوق بيليه خلايا الدم الحمراء (الشكل 2).
8. سلالة طبقة الكريات البيض من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر إلى 50 مل المخروطية. تحقيق حل ما يصل الى حجم 50 ملم مع RMPI.
9. تدور الأنابيب التي تحتوي على المخفف تعليق خلية في جهاز للطرد المركزي في الدقيقة السريرية 1500 (600G _افي) لمدة 5 دقائق على RT.
10. نضح في وطاف جمع بيليه الخلية. Resuspend الكرية في مخزن FACS 1 مل (1 ٪ ألبومين المصل البقري ، أزيد الصوديوم 0.02 ٪ من الكالسيوم والمغنيسيوم PBS مجانا) ونقل إلى تعليق الخلية 5 مل الدور السفلي FACS الأنابيب.
11. تعليق الأساس الذي تقوم عليه بعناية مع 1 زائد Ficoll - Paque مل.
12. تدور في أنبوب دورة في الدقيقة 2500 (1400 قدم) في أجهزة الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة السريرية على RT مع عدم وجود الفرامل.
13. إزالة الأبيض ، رقيق في طبقة واجهة (الشكل 2) مع 1 مل ماصة ونقل إلى 5 أنبوب جديد FACS مل. غسل جells مع 4 العازلة FACS مل.
14. تدور في أنبوب 1500 دورة في الدقيقة (600G _افي) لمدة 5 دقائق على RT في أجهزة الطرد المركزي السريرية لخلايا بيليه.
15. نضح طاف بيليه وجمع الخلية. Resuspend الكرية الكريات البيض في العازلة المناسبة والحفاظ على الجليد في أنبوب FACS جديدة.
16. عدد الخلايا ، وتقييم الجدوى الخلية الاستبعاد التريبان الأزرق وتحليلها حسب التدفق الخلوي. عموما ، يمكن أن نتوقع أن المحققين الحصول على ما يقرب من 5 × 10 ⁵ خلية / الحيوانات.

3. immunophenotyping تدفق cytometric

1. بعد عزل وعد كريات الدم البيضاء ، وتدور هذه الخلايا لمدة 3 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة (600 _قدم) في أجهزة الطرد المركزي السريرية.
2. Resuspend الكرية في عرقلة العازلة التي تحتوي على ما يلي : FACS العازلة ، طاف من ورم هجين 2.4G2 (FC كتلة ؛ anti-CD16/32) ومصل بقري جنيني في نسبة 10:05:01 واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية .
3. إعداد وإضافة أضداد ضد مستضدات مترافق خارج الخلية إلى الخلايا سدت في تركيز 1:200 واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. وصمة عار واحتضان خلايا في 200 ميكرولتر في صفيحة V - 96 - القاع أيضا. وتشمل الضوابط المناسبة وغير ملوثين عينات خلايا ملون تألقي التعويض ، حسب الاقتضاء.
4. تدور في الخلايا الملون RT لمدة 3 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة (600 _قدم) في أجهزة الطرد المركزي السريرية باستخدام الدوار لمناسبة 96 - جيدا لوحات.
5. نضح في وطاف غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر FACS العازلة التي pipetting بلطف صعودا ونزولا 3 مرات.
6. تكرار الغسيل تقنية أعلاه مرتين.
7. بعد الغسيل ، resuspend الخلايا في بارافورمالدهيد 2 ٪ ، ونقل إلى أنابيب FACS. مطلوب تثبيت لتحليل تدفق cytometric من الخلايا المصابة من الكواشف الأحيائية المستوى 2.
8. تشغيل الخلايا الثابتة على FACS Calibur دينار بعد تعديل طريقة تدفق الخلوي ⁽⁸⁾ وتحليل الملفات باستخدام FlowJo حاليا ، WinMDI أو غيرها من البرامج المتاحة التدفق الخلوي التحليل.
9. هو مطلوب عموما في تحليل الأحداث 50-100،000 لكل عينة لimmunophenotyping كافية.

مترافق مباشرة الأجسام المضادة المستخدمة في هذه التجربة :

تم الكشف عن CD45 مع استنساخ 30 - F11. تم الكشف عن Ly6C / G مع استنساخ GR1 ، RB6 - 8C5. تم الكشف عن CD11b مع استنساخ M1/70. تم الكشف عن F4/80 مع استنساخ BM8.

4. ممثل النتائج :

نعرض النتائج phenotyping الخلية لBILs الماوس في 24 إصابة آخر ساعة (الشكل 3). والكريات البيض الملون ، مترافق مع PerCP الماوس مكافحة CD45 للكشف عن الخلايا المناعية ، PE - مترافق المضادة للماوس Ly6C / G للكشف عن التهابات حيدات ، APC - مترافق المضادة للفأرة وCD11b APC مترافق مكافحة الفأر F4/80 للكشف عن خلايا من سلالته الوحيدات. تم إجراء تحليل بأداة FACS Calibur دينار بحريني.

الشكل 1. وتقع الترجمة التشريحية للموقع الحقن ، والحقن 1 ملم الأمامي لbregma 1 ملم والوحشي للخياطة السهمي على الجانب الأيمن.

الشكل 2. يتم جمعها في البداية من التوضيح الفصل المتدرج من الكريات البيض وBILs. الكريات البيض مباشرة تحت طبقة المايلين والحطام فوق بيليه RBC في الانحدار Percoll. يتم جمع البيض ، طبقة رقيق (BILs) في واجهة من التدرج Ficoll.

الشكل 3. وقد تم عزل نمط ظاهري مناعي من الدماغ infilatrating الكريات البيض في 24 ساعة بعد العدوى الكريات البيض الماوس. من الدماغ عن طريق الطرد المركزي كثافة الخليط من الفرق مستعدة الأنسجة من الحيوانات في 24 ساعة بعد العدوى داخل القحف. تم صبغ الخلايا مع أجسام مضادة ضد fluorescently - مترافق الماوس CD45 ، Ly6C / G ، CD11b وF4/80. تم تنفيذ تبوب الأولي بالتآمر CD45 ، وهي علامة للحصول على الخلايا المناعية ضد مبعثر إلى الأمام (FSC) ، وهو مؤشر على حجم الخلية (C). وقد تم تحليل ثم ^مرحبا CD45 (A ، D) ، CD45 ^الصغرى (B ، E) ، ^وNEG CD45 (F ، G) السكان لمستويات التعبير النسبية للعلامات الوحيدات والبلاعم Ly6C / G ، F4/80 (A ، B ، F) ، وCD11b (D ، E ، G). Ly6C / G ⁺ F4/80 ^{+ +} CD11b عثر حيدات التهابات بشكل حصري تقريبا في عدد السكان ^مرحبا CD45 (A ، D) ، بما يتفق مع تسلل من هذه الخلايا من محيطها. في المقابل ، ^لو تم العثور على Ly6C/G-F4/80 CD11b ⁺ الضامة بشكل حصري تقريبا في ^لو CD45 (B ، E) وCD45 ^NEG (G) من السكان ، بما يتفق مع النمط الظاهري المقيم. في تجارب عديدة ، ونحن لم يلاحظ خلايا CD45 ^مرحبا أو Ly6C / G ⁺ F4/80 ^{+ +} CD11b حيدات التهابات في الدماغ من غير مصاب أو صورية العدوى ،الفئران تيد (لا تظهر البيانات).

Discussion

نستخدم التدفق الخلوي بشكل روتيني لتحديد كلا من نوعية الخلية إعداد الدماغ التسلل ، والتمييز مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية ^{2 و 9.} في نقطة زمنية حادة ، لدينا أسلوب BILs غلة نسب عالية من التهابات داخل حيدات السكان CD45hi فضلا عن النسب العالية من السكان في الضامة CD45lo....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
الكاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
TMEV	هوي مختبر	N / A
دانيال سلالة	Invitrogen	21063-029
isoflurane	Novaplus	NDC 0409-3292-49
جولة القاع أنابيب الطرد المركزي أوك ريدج	Nalgene	3118-0030
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Percoll	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	17-0891-02
10X PBS	روش	11666789001
Ficoll - Paque بلس	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	17-1440-02
التريبان الأزرق 0.4 ٪ (W / V)	Mediatech	25-900 - CI
أنابيب مخروطية 15 مل	فالكون دينار بحريني	352097
7 مل زجاج بيركس الأنسجة Tenbroeck العلامة التجارية طاحونة	الصياد	08-414 - 10B
40 ميكرومتر مصفاة الخلية	فالكون دينار بحريني	352340
50 مل المخروطية	فالكون دينار بحريني	352070
ألبومين المصل البقري	سيغما	A9647
أزيد الصوديوم	سيغما	S8032
CMF - PBS	Mediatech	21-040 - CV
FACS أنابيب	فالكون دينار بحريني	352054
مصل بقري جنيني	سيغما	F4135
2.4G2 ورم هجين	ATCC	HB - 197
Costar V - أسفل لوحة	كورنينج	3894
أليجرا X - 22R أجهزة الطرد المركزي أو ما يعادلها	بيكمان	N / A
96 لوحة وكذلك الدلو الدوار	بيكمان	S2096
الزاوية الثابتة الدوار	بيكمان	F0360
بارافورمالدهيد	سيغما	P6148
دينار بحريني FACS Calibur	العلوم البيولوجية دينار بحريني	N / A
FlowJo 7.5	شجرة نجمة ، وشركة	N / A
CD45	العلوم البيولوجية دينار بحريني	557235	استنساخ : 30 - F11
GR1 (Ly6C / G)	العلوم البيولوجية دينار بحريني	553128	استنساخ : RB6 - 8C5
CD11b	ebiosciences	17-0112-83	استنساخ : M1/70
F4/80	ebiosciences	17-4801-82	استنساخ : BM8