استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني

Summary

هذا الفيديو يوضح البروتوكول لاستخراج الحمض النووي من الفورمالين الثابتة المادية جزءا لا يتجزأ من البرافين. هذا الإجراء عدة أيام في المقاطع التي هي نسيج deparaffinized مع الزيلين ، ممهى مع الإيثانول ومعاملته ك بروتين لتنقية وعزل الحمض النووي لاحقة تحليل الجينات الوراثية المحددة أو واسعة.

Abstract

تتميز تطور المرض والتقدم المتكررة من قبل الانحرافات الجينية ، وبما في ذلك إعادة ترتيب الكروموسومات اللاجينية ، والمكاسب والخسائر في عدد النسخ والحامض النووي. وقد تحسنت التقدم في الإنتاجية العالية ، والتقنيات التنميط الجينوم واسعة ، مثل ميكروأرس ، بشكل كبير من قدرتنا على تحديد والكشف عن هذه التعديلات محددة. ولكن التكنولوجيا لا تزال في التحسن ، لا يزال عاملا مقيدا نوعية العينة ومدى توافرها. غالبا ما يتم جمع المعلومات السريرية وعلاوة على ذلك ، ومتابعة ونتائج المرض بعد سنوات من جمع العينات الأولية. العينات ، يتم عادة تخزين الفورمالين الثابتة وجزءا لا يتجزأ من البرافين (FFPE) ، في محفوظات المستشفى لسنوات وعقود. الحمض النووي يمكن بكفاءة وفعالية تعافى من العينات ، جزءا لا يتجزأ من البارافين إذا تم تطبيق الأسلوب المناسب لاستخراج. عالية الجودة يمكن أن الحمض النووي المستخرج من عينات المحفوظة بشكل صحيح وتخزينها دعم المقايسات الكمية لمقارنات بين الأنسجة الطبيعية والمريضة وجيل من التوقيعات وراثية وجينية ^1. لاستخراج الحمض النووي من العينات ، جزءا لا يتجزأ من البرافين ، النوى الأنسجة أو الأنسجة microdissected يتعرضون لمعاملة الزيلين ، والذي يذوب البارافين من الأنسجة ، وممهى ثم باستخدام سلسلة من يغسل الايثانول. يتم هضمها في وقت لاحق من البروتينات والانزيمات الضارة مثل nucleases بواسطة بروتين كاف إضافة العازلة تحلل ، والذي يحتوي على عوامل تغيير طبيعة مثل كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، ويسهل الهضم ^2. يتم تنقيتها من الأحماض النووية lysate باستخدام الأنسجة العازلة المشبعة الطرد المركزي بسرعة عالية والفينول الذي يولد حل ثنائي الطور. DNA و RNA البقاء في المرحلة مائي العلوي ، في حين تحتجز البروتينات والدهون والسكريات على التوالي في جملة والعضوية المراحل الإضافية. الإبقاء على المرحلة المائية وقلع الفينول المتكررة يولد عينة نظيفة. بعد قلع الفينول ، يضاف ريبونوكلياز A للقضاء على تلويث الحمض النووي الريبي. قلع الفينول الإضافية التالية مع ريبونوكلياز الحضانة وتستخدم لإزالة أي انزيم المتبقية. وتستخدم إضافة خلات الصوديوم والحمض النووي الأيزوبروبانول رواسب ، وارتفاع سرعة الطرد المركزي لتكوير الحمض النووي وتسهيل إزالة الأيزوبروبانول. يمكن ترحيلها الأملاح الزائدة من الأمطار تتداخل مع المقايسات الأنزيمية لاحقة ، ولكن يمكن إزالتها من الحمض النووي عن طريق الغسيل مع الايثانول 70 ٪ ، تليها الطرد المركزي لتكوير إعادة الحمض النووي ^3. الحمض النووي هو إعادة معلقة في الماء المقطر أو عازلة للاختيار ، كميا وتخزينها على -20 درجة مئوية. ويمكن بعد ذلك تنقية الحمض النووي يمكن استخدامها في تطبيقات المصب التي تشمل ، ولكنها ليست على سبيل الحصر ، PCR ، مجموعة التهجين الجينومي المقارن ⁴ (CGH الصفيف) ، مناعي ميثليته الحمض النووي (MeDIP) والتتابع ، والسماح لإجراء تحليل لعينات الأنسجة تكاملية / الورم.

Protocol

1. تلاحظ الإجرائية

• الزايلين والفينول هي مواد كيميائية سامة ، وينبغي معالجتها في fumehood. الرجوع إلى ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) قبل الاستخدام.
• الزيلين يذوب بعض أنواع البلاستيك ، وينبغي أن تستخدم أنابيب البولي بروبلين لأنها تتسامح مع هذه المركبات.
نصائح الخاصة التي تحتوي على الفحم سدادة الداخلية. هذا يمنع الزيلين من حل أي مكونات المطاط في ماصة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام نصائح التصفية.

2. إزالة البارافين

1. وفي fumehood ، إضافة 800 ميكرولتر من الزيلين (VWR ، CABDH6216 - 4) إلى أنبوب يسمى العينة تحتوي على الخاص والمكان على الكرسي الهزاز مع اهتزاز لطيف لمدة 5 إلى 15 دقيقة ليحل البارافين.
2. بيليه العينة عن طريق الدوران بسرعة قصوى (14000 دورة في الدقيقة أو 16 XG 000) في microcentrifuge لمدة 3 دقائق. سحب بعناية طاف الزيلين والتصرف في أنبوب البولي بروبلين للتجاهل في النفايات الزيلين. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
3. كرر الخطوات 1 يغسل الزيلين ويذوب تماما 2until البارافين. وهذا يتطلب عادة 2-3 يغسل ، اعتمادا على حجم العينة الأنسجة. وسوف يظهر نموذج حل كامل لينة ، وسوف تفقد سلامتها الهيكلية في بعض الأحيان. ويمكن على سلامة العينة المقررة بلطف مع طرف ماصة.

3. الإيثانول الإماهة

1. أضف 800 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100 ٪ (V / V) الجزيئية الايثانول أحياء الصف ، الدوامة ، وتدور لمدة 3 دقائق ثم في 14000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge. إزالة طاف الإيثانول ، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
2. أضف 800 ميكرولتر من الايثانول 70 ٪ (100 ٪ (V / V) الايثانول المخفف في الماء المقطر (DH ₂ O)) ، الدوامة ، وتدور لمدة 3 دقائق على 14000 دورة في الدقيقة. إزالة بعناية طاف الايثانول.
3. أضف 800 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 50 ٪ (100 ٪ (V / V) الايثانول المخفف في الماء المقطر (DH ₂ O)) ، الدوامة ، وتدور لمدة 5 دقائق على 14000 دورة في الدقيقة. إزالة بعناية والايثانول أكبر قدر ممكن من قبل pipetting. نكون حذرين للغاية من تعكير بيليه في هذه النقطة في الانسجة ممهى تماما ولن بيليه وكذلك الأنسجة بالجفاف.
4. بعد إزالة طاف الإيثانول ، والهواء الجاف وبيليه لمدة 5 دقائق ، والحرص على عدم جفاف أكثر.

4. نسيج الهضم

1. إضافة 200-500 ميكرولتر من الاحتياطي تحلل (الصيغة أدناه). إعادة تعليق بيليه استخدام غيض ماصة أو دوامة ملف. جهد إضافي في هذه المرحلة لاعادة تعليق بالكامل سوف ينتج عنها نسيج الهضم أكثر اكتمالا من العينة وأفضل عائد من الحمض النووي.
2. احتضان العينات عند 56 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة التدفئة.
3. للحصول على عينات الأنسجة ، وارتفاع 20 ميكرولتر من بروتين K (20 ملغ / مل حل الأسهم ، Invitrogen ، AM2548) في الصباح والمساء.
4. كرر الخطوات أعلاه الهضم لمدة 2 إلى 5 أيام حتى يذوب تماما الأنسجة.

تحلل العازلة

10 ملي تريس - 8.0 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك

100 درجة الحموضة 8.0 ملي EDTA

50 مم كلوريد الصوديوم

SDS 0.5 ٪

200 ميكروغرام / مل K بروتين (إضافة قبل الاستخدام)

5. الحمض النووي تنظيف

1. إضافة حجم مساو من الفينول العازلة المشبعة (فيشر ، BP1750I - 400) وتخلط بواسطة انقلاب. تدور مدة لا تقل عن 5 دقائق على 14000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge.
2. نقل طبقة مائية لأنبوب جديد. لاحظ الطور البيني : هناك الكثير من مادة بيضاء؟
3. كرر الخطوات 1 و 2 على جزء مائي حتى الطور البيني واضح (عادة 3 مرات أو أكثر). * تنفيذ عمليات الاستخراج الظهر عندما الطور البيني هو غامض لزيادة الغلة النهائية.
4. وبمجرد أن الطور البيني واضح ، إضافة حجم مساو من الفينول : كلوروفورم : كحول أيزو أميلي (25:24:1) (فيشر ، BP1752I - 400) إلى جزء المائية المستخرجة من عينتك. المزيج لمدة 5 دقائق ثم تدور لمدة 5 دقائق على 14000 دورة في الدقيقة. Thisreduces المتبقية الفينول وكذلك تزيد من الطور البيني ، وتسهيل استخراج طبقة مائية
5. إزالة طبقة مائية لأنبوب جديد وtreatwith A ريبونوكلياز عند 100 ميكروغرام / مل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
6. كرر الخطوات من 1 إلى 4 لإزالة أي ريبونوكلياز المتبقية ألف وجمع جزء مائي. يجب عليك سوى 1 أو 2 خطوات الفينول العازلة المشبعة كما ينبغي أن يكون هناك بروتين أقل من ذلك بكثير لإزالة مما كانت عليه في lysate الأولي.

* مرة أخرى لتنفيذ عمليات الاستخراج إضافة ميكرولتر من 50-100 درهم ₂ 0 في أنبوب العينة تحتوي على الطور البيني والجزء العضوي. عكس الأنبوب إلى المزيج ، وتدور في العينة 14000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge لمدة 5 دقائق. جمع المرحلة المائية وإضافته إلى لاستخراج المائية المكتسبة سابقا. تستمر حتى الظهر قلع الطور البيني واضح.

6. الحمض النووي هطول الأمطار

1. تقدير حجم طبقة المائية التي تم جمعها.
2. إضافة 10/01 حجم 3 M خلات الصوديوم الهيدروجيني 5،2 و 1 حجم 100 ٪ الأيزوبروبانول (V / V) الصف البيولوجيا الجزيئية (أو 2.5 أحجام من الإيثانول بنسبة 100 ٪).
3. ميكس جيدا وتوضع على الجليد أو في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو بين عشية وضحاها.
4. تدور في أقصى سرعة (14،000 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية في microcentrifuge لمدة 10 دقيقة
5. تخلصي من طاف.
6. اغسل بيليه مع الايثانول 70 ٪ الجليد البارد لإزالة الأملاح غير المرغوب فيها.
7. إعادة تعليق بيليه في المنطقة العازلة في الاختيار (عادة DH ₂ O).

7. الحمض النووي الكمي

1. قياس تركيز الحمض النووي. وA260 : A280 نسبة ينبغي ~ 1.8. لكميات صغيرة من الحمض النووي ، ويفضل استخدام قياس الطيف NanoDrop.
الكمي وبعد ، هلام إستشراد لاختبار نوعية من الحمض النووي الخاص العينة وتحديد ما إذا كان الحمض النووي الريبي تلويث قد تدهورت تماما.
2. جودة عالية الحمض النووي المستخرج الآن مناسبة للتطبيقات المصب ، أو يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. إذا كان الحمض النووي الريبي لا تزال موجودة في العينة ، كرر DNA تنظيف والخطوات هطول الأمطار ، وإعادة تحديد وتأهيل نوعية العينات الخاصة بك.

Discussion

أنسجة الخزعة أو استئصاله جراحيا لتحليل histopathologic والتشخيص وغالبا ما تكون ثابتة وجزءا لا يتجزأ من الفورمالين البارافين (FFPE) للتخزين على المدى الطويل. مع تزايد الاهتمام في فهم الأساس الجيني للمرض ، والقدرة على استخراج الحمض النووي من هذه العينات يمثل مصدرا قيما للمواد التشخيص التي يمكن استخدامها لتحليل ودراسات الجينوم متعدية. لم تكن تعتبر تاريخيا عينات FFPE مصدر قابلة للتحليل الجزيئي قد تكون الأحماض النووية بشدة تعديل الحمض النووي والبروتينات والبروتين البروتين عبر ربط ^6. ومع ذلك ، اكتشاف أن الهضم البروتيني النشرات الأحماض النووية المجزأة التي هي مناسبة لتحليلات المصب بما في ذلك الاسترداد ، CGH الصفيف ، وتسلسل والتنميط مثيلة ، وتمكن من استخدام هذه العينات للتحليل الجيني قيمة ^6.

استخراج الحمض النووي من البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة هو إجراء القوية التي تعتمد على ذوبان في الفرق لتنقية الحمض النووي. الحمض النووي المستخرج نوعية وكمية ونجاح تضخيم الحمض النووي لاحقة تعتمد على عدد من المعلمات قبل وأثناء وبعد الاستخراج. وتشمل هذه ، ولكنها لا تقتصر على : نوع وكمية من النسيج ، ونوع من استخدام مثبت للحفاظ على النسيج ، ومدة التثبيت ، وعمر كتلة البارافين وظروف التخزين ، فضلا عن طول الجزء المراد الحمض النووي تضخيم ^1،7. إزالة البارافين من النسيج هي الخطوة الأكثر أهمية بالنسبة لاستخراج مثل هذا النجاح غير منحل البارافين يؤدي إلى جودة عينة الفقراء وتثبيط تضخيم PCR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم	شركة	رقم كتالوج	تعليقات
الزيلين	VWR	CABDH6216 - 4	--
1.7 مل أنابيب Microcentrifuge SafeSeal	سورنسون العلوم الاحيائية	11510	--
Spectrafuge Microcentrifuge 16M	Labnet	C0160 - B	--
تحلل العازلة	--	--	10 ملي تريس - pH8 حمض الهيدروكلوريك ، 100 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5 ٪ SDS ، 200 ميكروغرام / مل بروتيناز K
بروتين الحل K الأسهم	Invitrogen	AM2548	20 ملغ / مل
بروتين الحل K الأسهم
العازلة المشبعة الحموضة الفينول 6.6/7.9	الصياد	BP1750I - 400	--
الفينول : كلوروفورم : Isoamylalcohol (25:24:1 ، ودرجة الحموضة 6.7/8.0)	الصياد	BP1752I - 400	--
ريبونوكلياز A	روش	10109169001	100mg
3M خلات الصوديوم 5.2 درجة الحموضة	--	--	40.81g NaOAc في 80ml التكيف مع درجة الحموضة 5.2 حامض الخليك الجليدي إضافة إلى DH 2 O 100ML الأوتوكلاف
ND 3300 الطيف	NanoDrop	--	--