تحليل الكمي الإنبثاث السرطان باستخدام الأجنة النموذجي الطيور

Summary

باستخدام كمية PCR ، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام نموذج راسخة CAM فرخ لتحليل كمي لورم خبيث من الخلايا السرطانية البشرية إلى الأجهزة البعيدة.

Abstract

خلال نشر الخلايا السرطانية الانبثاث من الورم الرئيسي ، إلى غزو الأنسجة المحيطة بها ، والانتشار إلى أعضاء بعيدة. الانبثاث هي عملية معقدة يمكن أن تنطوي على العديد من أنواع الأنسجة ، وفترات زمنية متنوعة ، وغالبا ما تحدث في أعماق الأجهزة ، مما يجعل من الصعب تحقيق وكميا. بالإضافة إلى ذلك ، تأثر فعالية عملية المتنقل بخطوات متعددة في تتالي النقيلي مما يجعل من الصعب تقييم مساهمة من جانب واحد للسلوك الخلية السرطانية. نتيجة لذلك ، كثيرا ما يتم تنفيذ المقايسات الانبثاث في حيوانات التجارب لتوفير سياق واقعي بالضرورة للدراسة الانبثاث. لسوء الحظ ، فإن تعقيد هذه النماذج التي لها علم وظائف الأعضاء المعقدة. الجنين الفرخ هو نموذج فريد في الجسم الحي أن يتغلب على الكثير من القيود على دراسة ورم خبيث ، ويرجع ذلك إلى سهولة الحصول على غشاء مشيمائي (CAM) ، وأوعية دموية جيدة خارج الأنسجة الجنينية تقع تحت قشر البيض الذي يتم تقبلا لxenografting الخلايا السرطانية (الشكل 1). وعلاوة على ذلك ، لأن الجنين الفرخ هو العوز المناعي بشكل طبيعي ، وتدعم CAM engraftment بسهولة من الأنسجة الطبيعية على حد سواء والورم. الأهم من ذلك ، CAM الطيور يدعم بنجاح خصائص الخلايا السرطانية أكثر بما في ذلك النمو ، والغزو ، الأوعية الدموية ، وإعادة تشكيل المكروية. هذا يجعل نموذج مفيد بشكل استثنائي من أجل التحقيق في الممرات التي تؤدي إلى ورم خبيث من السرطان والتنبؤ استجابة للعلاجات السرطان النقيلي جديدة محتملة. الكشف عن الخلايا التي تنشرها أنواع محددة PCR ألو يجعل من الممكن إجراء تقييم كمي لورم خبيث في الأجهزة التي استعمرها قليلة مثل 25 الخلايا. باستخدام الإنسان سرطانة بشرانية خط الخلية (HEp3) نستخدم هذا النموذج لتحليل الانبثاث عفوية الخلايا السرطانية إلى أعضاء بعيدة ، بما فيها الكبد والرئة الفرخ. علاوة على ذلك ، باستخدام بروتوكول ألو - PCR نظهر حساسية واستنساخ للمقايسة كأداة لتحليل وquantitate intravasation واعتقال والتسرب ، والاستعمار بوصفها عناصر فردية من ورم خبيث.

Protocol

1. اعداد البيض للxenografting (الانبثاث عفوية)

1. وضعت حديثا يتم تحضين بيض الدجاج المخصب في حاضنة الدورية لمدة 10 أيام عند 100 درجة فهرنهايت والرطوبة 60 ٪. يتم تناوب البيض أربع مرات كل ساعة.
2. في يوم 10 تنموية يتم وضع البيض على جانبهم في رف البيض. ويستخدم مصباح أوزة الرقبة أو غيرها من مصدر الضوء مناسبة لشمعة البيض بتسليط الضوء في قشر البيض في نهاية حادة من البيض حيث يقع airsac.
3. يقع الوريد مشيمائي وملحوظ. يقع هذا المنوال في الجزء العلوي من قشر البيض حيث هو نقطة التقاء العديد من الأوعية الدموية الكبيرة. عند هذه النقطة فرع الاوعية الدموية يسقط باستمرار ، بعيدا عن CAM ويعلقها على الجنين. يتم رسم مربع مربع 1cm مع قلم رصاص على قشر البيض حوالي 1cm بعيدا عن نقطة فرع في الوريد. ثم يتم تنظيف المنطقة وحولها بما في ذلك المربع باستخدام مسحة القطن غارقة في اليود.
4. باستخدام أداة القطع الدورية (DREMEL) مزودة كربيد السيليكون حجر طحن (الجزء # 84922 DREMEL) هو حفر حفرة حتى نهاية حادة من البيض في كيس الهواء. باستخدام هذه الأداة نفسه بحفر حفرة داخل مربع رسمها سابقا على الجزء العلوي من البيض ، ووقف قصير من الغشاء قشر البيض. يتم استخدام إبرة حقنة عيار 25 مع مثقب غرامة على نهاية لجعل ثقب صغير في غشاء قشر البيض والحرص على عدم تمزيق CAM الكامنة. يتم فصل بعد ذلك من كام الغشاء قشر البيض في منطقة مربع باستخدام الشفط لطيف التي تم إنشاؤها باستخدام معونة ماصة أوتوماتيكية مزودة قطعة من أنبوب ¼ tygon "وضعت على ثقب في airsac. عند تطبيق الشفط ، يجب على جيب هوائي تحت ثقب في مربع مما يدل على أنه تم إسقاط CAM بنجاح بعيدا عن قشر البيض. بعد إسقاط CAM ، يتم اغلاق ثقب في كيس الهواء ويقع في حفرة مربعة بالقرب من الوريد مشيمائي مع قطعة من الشريط مختبر الشريط. يتم وضع البيض في وقت لاحق إلى حاضنة ثابتة على 100 درجة فهرنهايت والرطوبة 60 ٪ تحسبا لتطعيم الخلايا السرطانية. انظر الشكل 1 لتصوير متتابعة.

2. اعداد البيض للحقن في الوريد (الانبثاث تجريبية)

1. وضعت حديثا يتم تحضين بيض الدجاج المخصب في حاضنة الدورية لمدة 12 يوما بنسبة 100 درجة فهرنهايت والرطوبة 60 ٪. يتم تناوب البيض أربع مرات كل ساعة.
2. في يوم 12 التنموية توضع البيوض الى جانبهم في رف البيض. ويستخدم مصباح أوزة الرقبة أو غيرها من مصدر الضوء مناسبة لشمعة البيض بتسليط الضوء في قشر البيض في نهاية حادة من البيض حيث يقع airsac.
3. يقع الوريد مشيمائي وملحوظ. يتم رسم مستطيل بواسطة 1cm 0.5 سم مع قلم رصاص على قشر البيض مباشرة فوق الوريد. ثم يتم تنظيف المنطقة وحولها بما في ذلك المربع باستخدام مسحة القطن غارقة في اليود.
4. يتم إنشاء نافذة صغيرة في قشرة البيضة في الموقع رسمها باستخدام مثقاب Dremmel (# 118). تتم إزالة نافذة لفضح غشاء قشر البيض الأساسية التي يتم تقديمها في وقت لاحق شفافة مع قطرة من الزيوت المعدنية. انظر الشكل 5A لتصوير بياني.
5. عند هذه النقطة هو اغلاق ثقب في كيس الهواء ويقع في حفرة مربعة بالقرب من الوريد مشيمائي مع قطعة من الشريط مختبر الشريط. يتم وضع البيض في وقت لاحق إلى حاضنة ثابتة على 100 درجة فهرنهايت والرطوبة 60 ٪ تحسبا لحقن الخلايا السرطانية.

3. تستعد لتطعيم الخلايا السرطانية أو الحقن.

1. لxenografting ، يتم فصل الخلايا السرطانية من الأطباق من ثقافتهم باستخدام التربسين / EDTA وغسلها مع 10 مجلدات من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، من أجل إزالة أي وسائط المتبقية ، التربسين ، أو EDTA.
2. للحقن الرابع ، وفصل الخلايا المستنبتة باستخدام الخلايا nonenzymatic تفارق الحل ، وغسلها مع المصل خالية DMEM. و)
3. يتم عد الخلايا مع عدادة الكريات ومعلق في برنامج تلفزيوني في 1-40 خلية / مل لتطعيمها ، أو معلق بالتناوب في المصل خالية DMEM بمبلغ 1 مليون خلية / مل للحقن الرابع.

4. تطعيم الخلايا السرطانية على كام تتعرض حديثا (الإنبثاث العفوي)

1. يتم إزالة البيض من الحاضنة وخفض نافذة صغيرة في مكان مربع رسمها سابقا حيث الجيب جوية جديدة شكلت. هو الأكثر سهولة القيام بذلك مع أداة دوارة مزودة عجلة القطع (أداة DREMEL مع # 409 قطع عجلة دائرية). ويستخدم زوج من الإبر ملقط الأنف لإزالة جزء صغير من قشر البيض وفضح CAM الكامنة.
2. باستخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس (فيشر الماركة # 23-400-001) هو متآكل وCAM 5 مرات. وينبغي أن يكون واضحا الدم قليلا على القطن. على الفور بعد اصابته في CAM ، يتم وضع 25μl لتعليق الخلية على المنطقة المتضررة. العدد الأمثل من الخلايا غير مصممة هولكن يمكن mpirically 0.5X10 تتراوح من ⁵ إلى ⁶ 1X10. واغلقت النافذة في الشريط بشكل وثيق مع البيض والدجاج ويترك لمدة 10-15 دقيقة دائمة من أجل السماح للخلايا لتسوية. بعد 15 دقيقة يتم إرجاع البيض الى حاضنة ثابتة.
3. يسمح للأورام أن تنمو ل5-8 أيام اعتمادا على تطبيق معين وطبيعة الخط ورم الخلايا المستخدمة. انظر الشكل 1 لتصوير متتابعة.

5. حقن في الوريد من الخلايا السرطانية (الإنبثاث التجريبية)

1. وباستخدام حقنة الانسولين 100μl المقياس 30 من التعليق الخلية يتم حقن في الوريد السقائي لكل جنين ، عادت إلى حاضنة البيض ثابتة وبقي هناك لأيام إضافية 1-7.
2. الوقت في نقاط مختلفة ، ويتم حصاد الرئة أو أقل من كل CAM الجنين ومعالجتها للكشف عن الخلايا السرطانية ، كما هو موضح أدناه.

6. حصاد الأورام والأنسجة الفرخ

1. ويتم إعداد منطقة تشريح. ويكشف فحص الخلايا المتنقل عن طريق قياس الحمض النووي البشري باستخدام نهج PCR حساسة للغاية. ولذلك فمن المهم جدا لمنع التلوث مع الحمض النووي الخارجية. يتم إجراء التشريح في منطقة مخصصة للتشريح وطوال يتم تنظيف الأدوات بين كل الحيوانات. من أجل منع التلوث عبر العينات الخاص في جميع مراحل عملية تشريح تستخدم 3 مجموعات منفصلة من الأدوات : مجموعة واحدة لقطع البيض ، ومجموعة واحدة لإزالة الورم الرئيسي ومجموعة واحدة لإزالة الأعضاء الداخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم الحاويات الأربع ليغسل متتابعة من أدوات الشطف بين كل الحيوانات. في تسلسل هذه يغسل هي : 1) الماء المقطر المزدوج ، 2) الماء المقطر المزدوج ، 3) الكلور ، و 4) الايثانول 70 ٪.
2. يتم إزالة البيض من الحاضنة الثابتة ووضعها على الجليد لمدة 15 دقيقة لتخدير الموت ببطء والحيوانات. يتم فتح هذه النوافذ أن الأورام تصبح مرئية. قد فتح نوافذ أكبر عن طريق إزالة بعض من قشر البيض تكون ضرورية. هي مقطوعة الأورام الأولية من CAM ، وزنه ، ومعالجتها للالأنسجة.
3. تتم إزالة الفرخ من قشر البيض عن طريق قطع قذيفة شعاعيا إلى نصفين على قدم المساواة. ويصب الجنين من قذيفة قص ونقلها إلى الجانب تزن نظيفة الثدي يصل القارب. يتم تشريح الحيوان مع استخدام الطازجة والنظيفة مجموعة من الأدوات. يتم فتح هذا الحيوان من خلال قطع القص. مرة واحدة في جنين مفتوح ، وقطعة من الكبد من يتم جمعها إما الفص الأيمن أو الأيسر. بعد ذلك تتم إزالة الأعضاء الداخلية عن طريق سحب بلطف على المريء تعلق على الأحشاء وقطع visera التي تربط الأجهزة. من أجل جمع قطع الرئتين يتم فتح القفص الصدري هو فصل لوحة الثدي ، ويتم إزالة القلب. عند هذه النقطة من الممكن خفض حول الجوانب الأربعة من سرطان الرئة (الأقرب إلى أعلى الرأس على طول الجانب الأيسر من القفص الصدري ، أسفل الحجاب الحاجز وبالقرب من الجانب الأيمن على طول القصبة الهوائية). توخيا للاتساق ، يتم جمعها في الرئة نفسها في كل حيوان. يتم تخزين عينات الأنسجة التي تحصد في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا أو يمكن معالجتها على الفور لعزل الحمض النووي.

7. الجينومية العزلة الحمض النووي والتحليل الكمي PCR

1. يتم استخراج الحمض النووي من الأنسجة باستخدام الجينومية الخضراء Sybr استخراج - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت (سيغما الدريخ دليل XNATRG #). يمكن نقل الحمض النووي المستخرج من أنبوب إيبندورف نظيفة وتخزينها في -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور. من المهم أن نعمل على تخفيف الحمض النووي في الماء 1:50 nuclease حرة قبل استخدامه في رد فعل PCR اللاحقة. بدلا من ذلك ، يمكن استخلاص الحمض النووي باستخدام أي عدد من البروتوكولات القياسية استخراج الحمض النووي (Zijlstra وآخرون ، 2002).
2. تم الكشف عن الحمض النووي البشري في الأنسجة باستخدام كمية الحمص PCR محددة للتسلسل ألو الإنسان. PCR باستخدام كمية محددة ألو الاشعال تتم باستخدام التضخيم SYBR الاخضر من عدة Exract - N - الأمبير. PCR عدة يأتي مع مزيج يحتوي على رد فعل 2X SYBR الخضراء ، والعازلة ، dNTPS الأملاح ، بوليميريز طق طق وجسم في Jumpstart. يتكون المزيج رد فعل حتى في الحجم النهائي لل15μl ، مع كل 0.4μM التمهيدي. بالنسبة لمعظم الحالات باستخدام الحمض النووي المستخرج المخفف 01:50 سيوفر بيانات كمية ، ومع ذلك ، قد يكون مقدار الأمثل من الحمض النووي القالب بحاجة إلى أن يكون الأمثل تجريبيا. وتستخدم أجهزة الاشعال GAPDH الدجاج باعتباره الرقابة الداخلية ويدير PCR فقا للشروط التالية للتسلسل ألو : تفعيل بوليميريز في 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها 30 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. رد فعل لظروف GAPDH الدجاج مماثلة لتلك التي وصفها لألو ومع ذلك فإنه قد يكون من الضروري تمديد PCR إلى 40 دورات.
3. يتم إجراء التحليل الكمي لالانبثاث باستخدام الأسلوب ΔΔCt مقارنة المجموعات التجريبية لمجموعة المراقبة (Schmittgen وLivak ، 2008 ؛. Zijlstra وآخرون ، 2002). بدلا من ذلك يمكن إنشاء المنحنى المعياري باستخدام سلسلة التخفيف من الخلايا السرطانية البشرية المستخرجة استخدام عدة استخراج - N - الأمبير (Zijlstra وآخرون ، 2002). يتم تقييم الطالب دلالة إحصائية باستخدام T - اختبار أو تحليل أنوفا السيطرة والمجموعات التجريبية.

8. ممثل النتائج :

الشكل 1. الانبثاث في جنين الدجاج النموذج. أ) رسم بياني يوضح المؤلفة من اربعة مظهر النموذج في المقطع العرضي في خطوات رئيسية : 1. بعد 10 يوما من الحضانة. وقد وصل CAM شبه الحد الأقصى لحجم. الشرايين والأوردة مرئية بوضوح مع الوريد السقائي المتمركزة على الجزء العلوي من البيض. 2. البيضة مباشرة بعد حفر اثنين من الثقوب في قشرة البيضة : واحدة في airsac واحدة مجاورة لنقطة ارتباط لالوريد السقاء. 3. وقد استخدمت بعد ظهور فراغ خفيفة الى اجلاء airsac وإسقاط CAM. يتم تطبيق الخلايا السرطانية (الأزرق) إلى إسقاط CAM. 4. بعد السماح للورم الخلايا المطعمة في النمو ، ويتم حصاد الورم جنبا إلى جنب مع أنسجة الجنين من الدجاج لتحليل B) تصوير المسلسل للنموذج : 1. حضانة البيض. (2). بمناسبة موقع الوريد السقاء ، 3. حفر ثقوب في قشرة البيضة ، 4. اسقاط CAM ، 5. قطع فرصة للورم الخلايا ترقيع ، 6. تطبيق الخلايا السرطانية ، 7. تبريد البيض على الجليد قبل جمع الأنسجة ، 8. حصاد الورم بعد 7 أيام من النمو.

الشكل 2. الأنسجة الأورام CAM. تم إصلاح أنسجة مأخوذة من غشاء مشيمائي تحمل ورم في مقطوع ، الفورمالين ومعالجتها مع وصمة عار ثلاثي الألوان. أ) HEp3 الورم بعد سبعة أيام من النمو في CAM. B و C تظهر مناطق تضخيم كلا من أ سدى الورم وتبين. D) CAM الأوضاع الطبيعية.

الشكل 3. طولية التحليل الكمي الانبثاث. وقد تم تحليل المتغيرات في الرأس والرقبة HEp3 سرطان النقيلي مع قدرة عالية أو منخفضة (HEp3 M (عالية) وHEp3 M (قليلة) على التوالي) لقدرتها على نشر استخدام ألو PCR. وقد تم تحليل عشرة حيوانات في كل نقطة زمنية لمدة 7 أيام. وكانت هذه العينات كميا ضد منحنى القياسية وأعرب في وقت لاحق كما cells/50mg # الأنسجة.

الشكل 4. في تثبيط الخلايا الانبثاث عفوية في الحيوانات المعالجة مع 1A5 الانبثاث تثبيط الأضداد. وتم تشكيل الأورام باستخدام الخلايا 5X10 ⁵ HEp3 تطبيقها على CAM من يوم 10 الأجنة. بعد ثلاثة أيام من تطبيق الخلايا السرطانية وعولج نصف الحيوانات مع الأضداد المضادة للCD151 1A5. وكان حصاد الرئتين من الحيوانات الحاملة للورم بعد يومين وتعرض لاتحاد المحامين العرب PCR الكمي في الوقت الحقيقي. واستخدمت كمية العكس في الوقت الحقيقي PCR من chGAPDH لتأكيد وجود كميات مكافئة من الحمض النووي الجيني المضيف (استخدمت طريقة ΔΔCt للمقارنة بين الفريقين من الناحية الكمية (B).

الشكل 5. تقييم الاعتقال ، والنمو ، وintravasation في تتالي النقيلي. في الأساس ، يتم تعريف ورم خبيث لجهاز الثانوية من خلال مساهمات من ثلاثة جوانب : اعتقال ، ومعدل النمو ومعدل intravasation. ويمكن قياس هذه باستخدام مزيج من الانبثاث التجريبية (A) وعفوية الانبثاث (B). الانبثاث باستخدام التجريبية (A) ويعرف باسم اعتقال عدد من الكشف عن خلية 2hr حقن آخر. يتحدد بقاء ونمو الخلايا والقبض على التغيير في حقن الخلايا عدد آخر 24hr. ويعرف معدل النمو والانتشار خلال الأيام 3-7. ويتحدد به Intravasation الانبثاث عفوية (B) حيث يتم تعريف عدد الخلايا intravasated والحاضر العبء المنتشر في يوم 7 أن تتجاوز القيمة التي تنبأ بها من عبء النمو الحالي المنتشر في يوم 6.

الشكل 6. تصور توسيع المنتشر في CAM. تم حقن الخلايا HEp3 GFP معربا عن طريق الوريد في 12 يوما التنموية. في يوم 1 و 3 و 5 والتضحية بيضة وكان قسم من تصوير CAM مع ستيريو المجهر الفلورسنت. إنشاء خلفية خضراء داكنة من قشر البيض ، والأوعية الدموية مرئيا كخطوط سوداء ، وخلايا الورم مرئية على شكل بقع خضراء زاهية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد استخدم CAM الفرخ على مدى عقود في نظام نموذجي لدراسة الجوانب المختلفة لتطور السرطان والبيولوجيا النقيلي. وقد تم تنفيذ مبدأ تقييم القدرات المنتشر في هذا النموذج من قبل مجموعة متنوعة من الفئات بما في ذلك تحليل السكون (Ghiso أغيري وآخرون ، 1999 ؛. Ossowski والرايخ ، 1983) ، إ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات (اختياري)
1X Dulbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM)	Invitrogen	11995073
Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D - PBS) (1X) والسائلة	Invitrogen	14190250	الرقم الهيدروجيني 7،4
التربسين ، 0.05 ٪ (1X) مع 4NA EDTA والسائلة	Invitrogen	25300054
رياضي هاتشر	التوت هيل	1550HA	هذه هي بعض من حاضنات المتاحة بسهولة أكثر. ومع ذلك ، سوف تظهر معدات الفيديو المختلفة.
رياضي الحاضنة	التوت هيل	1502EA
DREMEL أداة دوارة	DREMEL
عجلات قطع DREMEL لا. 36	DREMEL	409
محمول الماصة المعونة	الصياد	1368115E
يميل القطن القضبان الرفيعة	الصياد	23-400-001)
بيض	مختلف		ويمكن استخدام بائع عديدة ومختلفة. يجب أن يكون البيض حوالي 35-55 غرام. والدجاجات التي تبيض لهم يجب أن تكون بين 36 و 55 أسبوعا من العمر.
عدادة الكريات	Hausser العلمية وVWR	15170-090
الألياف البصرية المجهر منار	Amscope	HL250 - AY	150W
إبرة قياس 25
Sybr الاخضر المقتطف - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت	سيغما الدريخ	XNATRG