تقييم التنمية وظيفة الغدة الثديية في نماذج الماوس

Summary

هذه الطريقة توضح كيفية تشريح الثدي وتقييم وتطوير الغدة ظيفة من الفئران. ويتم تقييم الغدد الثديية رفعه لدرجة تطور استخدام جبل كامل بينما يتم تقييم قذف الحليب باستخدام الأوكسيتوسين المستندة إلى انكماش الخلية myoepithelial مقايسة.

Abstract

وتتألف الغدة الثديية البشرية من فصوص 15-20 التي تفرز الحليب في افتتاح نظام القناة المتفرعة في الحلمة. هذه الفصوص هي نفسها تتكون من عدد من وحدات محطة مفصص اصق مصنوع من الحويصلات الإفرازية والقنوات تتلاقى ^1. في الفئران ، ولوحظ بنية مماثلة في الحمل التي يتم تتخللها قنوات والحويصلات الهوائية داخل سدى النسيج الضام. ظهارة الماوس الغدة الثديية هي شجرة من القنوات مثل نظام يتألف من طبقتين من الخلايا ، طبقة داخلية من الخلايا اللمعية محاطة طبقة خارجية من الخلايا التي تدل myoepithelial حدود غشاء سفلي ^2. عند الولادة ، إلا شجرة اولى الأقنية هو الحاضر ، تتألف من الفروع الأساسية لاصق و 15-20. استطالة فرع وبدء التضخيم في بداية سن البلوغ ، وحوالي 4 أسابيع من العمر ، تحت تأثير الهرمونات ^3،4،5. في 10 أسابيع ، وغزت معظم سدى بواسطة نظام معقد من القنوات التي سيخضع دورات متفرعة والانحدار في كل دورة ودقي الحمل حتى ^2. في بداية الحمل ، والمرحلة الثانية تبدأ من التنمية ، مع انتشار والتفريق بين الظهارة على شكل العنب على شكل هياكل تسمى الحويصلات الإفرازية الحليب ^6،7. بعد الولادة والرضاعة طوال ، يتم إنتاج الحليب بنسبة الخلايا الإفرازية اللمعية وتخزينها داخل تجويف الحويصلات الهوائية. الأوكسيتوسين الإفراج عنهم ، من خلال حفز المنعكس العصبي الناجم عن الرضاعة من الجراء ، يحرض تقلصات متزامنة من الخلايا myoepithelial حول الحويصلات الهوائية ، وعلى امتداد القنوات ، مما يسمح ليتم نقلها عن طريق القنوات الحليب إلى الحلمة حيث تصبح متاحة للالجراء ^8. وبإحكام الغدة الثديية التنمية ، والتمايز وظيفة مدبرة وتتطلب ليس فقط التفاعلات بين ظهارة وسدى ، ولكن أيضا بين الخلايا وmyoepithelial اللمعية داخل ظهارة ^9،10،11. وبالتالي ، قد الطفرات في الجينات المتورطة في العديد من هذه التفاعلات إما استطالة يضعف الأقنية خلال تشكيل سن البلوغ أو الحويصلات الهوائية أثناء الحمل في سن مبكرة ، والتمايز في أواخر الحمل ويؤدي إلى تفعيل إفرازي الرضاعة ^12،13. في هذه المقالة ، ونحن تصف كيفية تشريح الغدد الثديية الماوس وتقييم نموهم يتصاعد به كله. كما تبين لنا كيفية تقييم تقلصات myoepithelial وقذف الحليب باستخدام السابقين فيفو الأوكسيتوسين المستندة إلى مقايسة وظيفية. ويمكن بالتالي تأثير طفرة الجين على التنمية وظيفة الغدة الثديية يتحدد في الموقع قبل تنفيذ هذه التقنيات اثنين في السيطرة على الفئران الطافرة والبرية من نوع.

Protocol

1. الغدة الثديية تشريح

1. الموت ببطء باستخدام الماوس CO ₂ الاستنشاق. تجنب التفكك عنق الرحم إذا كان ذلك ممكنا لأنه قد يؤدي إلى تلف الأوعية الدموية الرئيسية في الرقبة وتؤدي إلى تراكم الدم حول الغدد الثديية ، وجعل تشريح أكثر صعوبة. ومع ذلك ، إذا معايير أخرى وسيتم تقييمها في الماوس نفسه ، مثل مستويات الدم من الأوكسيتوسين ، قد أساليب القتل الرحيم بديل يكون من الضروري ، على الرغم من يجب أن يتم تقييم ذلك عن طريق IACUC الخاص.
2. على رغوة البوليسترين ملفوفة في احباط ، ووضع الماوس على ظهرها ونشر أطرافه الأربعة. دبوس بقوة جميع الأطراف الأربعة باستخدام الإبر قياس 16-20 (الشكل 1A).
3. رذاذ الماوس بسخاء مع الايثانول 70 ٪.
4. باستخدام الملقط ، سحب ما يصل للجلد البطن في خط الوسط وجعل شق صغير مع مقص حاد.
5. بدءا من شق ، وقطع الجلد تصل إلى عنق الحيوان مع تجنب ثقب تجاويف البطن أو الصدر (1B الشكل).
6. قطع الجلد على الأرجل الأمامية إلى شق خط الوسط ، مما أدى إلى "شكل Y" (1B الشكل). قطع الجلد على أطرافه الخلفية بنفس الطريقة (الشكل 1B).
7. باستخدام ملقط مرقئ ، بلطف قشر الجلد في البطن والصدر ، إلى جانب الماوس. إذا لزم الأمر ، وقطع النسيج بلطف الموصول.
8. إصلاح البشرة للرغوة البوليسترين باستخدام إبر عيار 16 إلى 20 فضح الغدد الثديية التي تعلق على السفلي من الجلد. المضي قدما واستكمال جانب واحد في وقت واحد (الشكل 1C).
9. باستخدام ملقط ، ترفع بلطف الغدة الثديية لخفض الفائدة وبين الغدة والجلد مع مقص حاد الصغيرة ، بدءا من الخارج في اتجاه العمود الفقري للحيوان. تأكد من قطع بعناية ، حتى لا قطعة من الجلد أو العضلات تظل على الغدة. يمكن إزالة جميع الغدد الثديية (الشكل 1) باستخدام هذا البروتوكول ، ولكن الغدد الثديية في البطن (# 4) هي الأفضل لتركيب بأكملها. ^{والثاني} 2 و 3 الغدد ^{الثالثة} بعض العضلات interdigitated وبينما يمكن استخدامها لتحميل كامل والأنسجة ، لأنها قد لا تكون ملائمة لجميع التحليلات.

2. جبل بأكمله

1. على الأقل قبل يوم واحد لتشريح ، وإعداد القرمز حل الشب عن طريق إذابة 1g من القرمز و2.5G من كبريتات الالومنيوم البوتاسيوم في 500 مل من الماء المقطر ، ويغلي لمدة 20 دقيقة في دورق مخروطي 1 لتر. ضبط الحجم النهائي إلى 500 مل من الماء. التصفية من خلال ورقة Whatman وإضافة كمية صغيرة من الثيمول (الحبوب قليلة) كمادة حافظة. الثلاجة. بعد التلوين ، ويمكن سكب اللون القرمزي حل الشب مرة أخرى إلى الزجاجة الأسهم وإعادة استخدامها مرات عديدة على مدى عدة أسابيع. جعل الحل الطازجة عندما يصبح لون خافت.
2. بعد استئصال الغدة الثديية من الماوس (الخطوة 1) ، وانتشرت بشكل مباشر على شريحة زجاجية. محاولة لتمهيدها قدر الإمكان ، والحفاظ على الشكل الأصلي في الموقع. والغدة عصا على الشريحة لطيف عندما امتدت بشكل صحيح.
3. الإصلاح الغدة بغمر ذلك ، على الشريحة ، في تثبيتي في Carnoy (100 ٪ EtOH والكلوروفورم وحمض الخليك الجليدية ؛ 6:03:01) لمدة 4 ساعات في غطاء الدخان في درجة حرارة الغرفة في وعاء. علما أن الآخرين قد استخدمت 2 ساعة وهو ما يبدو أن تكون كافية. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن تكون ثابتة الغدد عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
4. يغسل في الإيثانول 70 ٪ لمدة 15 دقيقة. ثم ، ترطيب تدريجيا في الماء عن طريق إزالة نصف الحل الإيثانول من الجرة واستبدالها DDH ₂ O. احتضان لمدة 5 دقائق. كرر 3 مرات. بدلا من ذلك ، استخدم 70 ٪ -- 35 ٪ -- 15 ٪ -- الايثانول والمياه الحمامات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
5. شطف في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
6. وصمة عار في الشب القرمز بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. وتجدر الإشارة إلى أن تلطيخ قد يستغرق وقتا أطول حسب سمك للغدة.
7. إزالة اللون القرمزي الشب وصمة عار لإعادة يذوى تدريجيا من خلال نسيج ملون الحمامات الايثانول التسلسلي (50 ٪ ، 70 ٪ ، 95 ٪ و 100 ٪) لمدة 5 دقائق لكل منها واضحة في الزيلين ، أو في البديل غير سامة مثل Histo واضحة ، بين عشية وضحاها. ربما كل من الجفاف وتبادل المعلومات يتطلب وقتا أطول أيضا حضانات سمكا مع العينات.
8. الغدة الثديية تزج في ساليسيلات الميثيل. يمكن أن تبقى الغدد الثديية في ساليسيلات الميثيل في غطاء الدخان حتى الصور هي على استعداد لاتخاذها.
9. يمكن التقاط صور في غطاء الدخان مع الكاميرا الرقمية العادية وضعه على حامل ثلاثي (استخدام "ماكرو" وظيفة إن وجدت) ، وذلك بوضع الشرائح على منضدة خفيفة. استخدام مجهر تشريح للتضخم أعلى. بدلا من ذلك ، يمكن أن شنت وسائل الإعلام في الغدد الثديية مثل Permount (بعد الخطوة 2.7) السماح لاتخاذ الصور الكيميائية خارج غطاء الدخان على أي منصة التصوير توفير يتصاعد هي رقيقة بما فيه الكفاية.
10. من أجل تحديد الغدة الثديية التنمية باستخدام جبل بأكمله ، والقياسات مثل عدد من تشعبات (أو فروع جانبية) على طول أجزاء من القنوات ، وطول القنوات الرئيسية ، أو نسبة إلى منطقة الظهارية الأنسجة الدهنية يمكن تقييمها. أخيرا ، وبعد التصوير documenيمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من tation ، كامل الغدة الثديية في جبل لsectioning البارافين وتلطيخ النسيجية التقليدية.

3. الأوكسيتوسين بفعل قذف اللبن

1. فصل الجراء من السد بعد أن تم إطعامها. 1 ساعة الانتظار قبل تنفيذ الفحص.
2. تضحية الام وفضح الغدد الثديية كما هو موضح من قبل (الخطوات 1،1-1،8) ، دون إزالتها من الحيوان.
3. بدء الفحص عن طريق إسقاط بالتساوي إما الحل أو برنامج تلفزيوني الأوكسيتوسين مباشرة على الغدة الثديية من الفائدة ، وذلك باستخدام ماصة نقل. ويمكن استخدام جرعات كبيرة من الطيف ، وعادة ما تستخدم ~ 8 بيكوغرام / مل (الجرعة الفسيولوجية). ومع ذلك ، يمكن استخدام عالية غير جرعات الفيزيولوجي (حتى 1 ملغ / مل) لضمان عدم وجود استجابة الماوس في النماذج المعدلة وراثيا. لهذا الإجراء ، فمن المستحسن استخدام الصدري (# 2-3) الغدد ، باستخدام جانب واحد كعنصر تحكم (تتعرض لPBS) والجانب الآخر لاختبار قذف الحليب (الأوكسيتوسين التعرض).
4. احتضان لمدة 1 دقيقة وإزالة حل عن طريق الشفط بعناية مع ماصة نقل. يمكن رصد دخول الحليب في القنوات من خلال تسجيل شريط فيديو ، أو التقاط الصور قبل وبعد التعرض لبرنامج تلفزيوني أو الأوكسيتوسين.

4. ممثل النتائج :

في جبل كلها جيدة ، وينتشر بشكل جيد في الغدة الثديية ، ويمكن ملاحظتها بسهولة القنوات ظهارة (الشكل 2A). إذا كانت الغدة ليس على ما يرام الانتشار ، يمكن أن يرفع جزئيا أو كليا من الشريحة عند وضعه في حل مثبت. وسوف تصبح غدة ثم الثابت وغير صالحة للاستعمال (2B الشكل). وبالمثل ، إذا لم يتم تشريح الغدة جيدا ، وإما جزء من ظهارة يمكن مفقودة (الشكل 2C) أو الأجزاء المتبقية من الجلد أو العضلات البطنية تتداخل مع تحليل للغدة (الشكل 2D).

لمقايسة الأوكسيتوسين ، من المهم للفصل بين الجراء ترضع من السد لنفس المقدار من الوقت في كل مناسبة. في هذه الطريقة ، سيكون عليك التأكد من عدم وجود الحليب أو كميات صغيرة من الحليب موجود في القنوات قبل التعرض الأوكسيتوسين ، ولكن أيضا أن الحليب غير كافية موجودة في الحويصلات الهوائية التي يمكن إخراجه في القنوات التي تقلصات myoepithelial (الشكل 3A) . إذا أزيلت الجراء قريبا جدا ، ويمكن أن تتراكم في الحليب والحويصلات الهوائية في القنوات مما يجعل تأثير الأوكسيتوسين الصعب رصد (الشكل 3B). بدلا من ذلك ، إذا تم تنفيذ هذه التجربة في وقت مبكر جدا بعد ازالة الجرو ، والحليب لا نملك الوقت لتتراكم في الحويصلات الرئوية والأوكسيتوسين بفعل انكماش خلايا myoepithelial لن تؤدي ما يكفي من الحليب في إطلاق القنوات التي يجب مراعاتها (الشكل 3C).

الشكل 1. تشريح الفأر الغدة الثديية. دبوس الماوس على ظهرها من أطرافه الأربعة (A). قطع الجلد الأول من البطن في الرقبة. ثم جعل شقوق عمودية من وسط البطن إلى كل الأطراف ، كما يتضح من الخط المنقط (B). بلطف قشر الجلد على جانبي الحيوان ويعلقون عليه ، وفضح الغدد الثديية (C).

الشكل 2. ماوس كله الغدة الثديية جبل. ويلاحظ بسهولة القنوات ظهارة (الأسهم) والعقدة الليمفاوية (رأس السهم) في جبل الغدة الثديية لطيف كامل من انتشار الغدة # 4 (A). قد تصبح منفصلة غدة ثديية من انتشار سوء الشريحة وانهار ، مما يجعلها غير صالحة للاستعمال (باء) يمكن أن الغدة الثديية رفعه غير صحيح اما أن يكون الأجزاء الناقصة (C) أو قطعة من الجلد أو العضلات الباقية (D). علما أن ^الثاني 2 و 3 الغدد ^{الثالثة} وinterdigitated العضلات ، ولكن لا يزال من الممكن استخدامها لتحميل كامل أو الأنسجة.

الشكل 3. ويمكن ملاحظة الأوكسيتوسين بفعل طرد قنوات الحليب في الظهارة (الأسهم) بعد التعرض الأوكسيتوسين (A). ومع ذلك ، إذا تم شغلها بالفعل مع قنوات الحليب (الأسهم) في بداية الفحص نتيجة لفترة طويلة بشكل غير لائق للمشاركة الكمون بعد الرضاعة من الجراء ، وتراكم المزيد من الحليب في القنوات (الأسهم) بعد التعرض الأوكسيتوسين الصعب مراقبة (B). بدلا من ذلك ، فإن فترة كمون قصيرة بعد الرضاعة الجرو عدم السماح لتراكم ما يكفي من الحليب في الحويصلات الهوائية التي يتعين مراعاتها في القنوات بشكل صحيح (الأسهم) بعد التعرض الأوكسيتوسين (C). أخذت الصور قبل وبعد التعرض الأوكسيتوسين باستخدام كاميرا رقمية (سايبر ، سوني).

الشكل 4. التمثيل التخطيطي للفحوصات كاملة ومعالجة تصاعد الأوكسيتوسين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وبإحكام الغدة الثديية التنمية وظيفة مدبرة. فئرانا معدلة وراثيا قد الميناء طفرات الجينات التي يمكن أن تعوق التنمية الغدة الثديية وظيفة تسليط الضوء على الحاجة إلى تقييم العمارة الغدة ^13،12. لا يمكن أن يؤديها تصاعد كله على النحو المبين في هذه المادة في جميع مراحل ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
الكاشف	شركة	فهرس العدد
اللون القرمزي	سيغما الدريخ	C1022
الألومنيوم كبريتات البوتاسيوم	سيغما الدريخ	A6435
الثيمول	سيغما الدريخ	T0501
ساليسيلات الميثيل	سيغما الدريخ	M6752
الأوكسيتوسين	سيغما الدريخ	O3251