A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
والأصباغ biarsenical الفلاش وReAsH خصيصا لربط الزخارف tetracysteine في البروتينات ، ويمكن تسمية انتقائي البروتينات في الخلايا الحية. مؤخرا تم استخدام هذه الاستراتيجية لتطوير أجهزة الاستشعار التوسيم لبروتين مختلفة التشكل أو الدول oligomeric. وصفنا نهج وضع العلامات وطرق لتحليل كمي ملزمة.
البروتينات الفلورية والأصباغ وأدوات أساسية لدراسة توطين البروتين والاتجار بها وظيفة في الخلايا. في حين تم البروتينات الفلورية مثل البروتين مضان أخضر (GFP) المستخدمة على نطاق واسع باعتبارهم شركاء الانصهار للبروتينات لتتبع خصائص بروتين المصالح 1 ، والتطورات الأخيرة مع أصغر به تمكين وظائف جديدة من البروتينات التي يتعين بحثها في الخلايا مثل تغيير متعلق بتكوين والبروتين وتكوين الجمعيات 2 ، 3. نظام واحد ينطوي على سمة صغيرة عزر tetracysteine (CCXXCC) إدراج وراثيا في البروتين المستهدف ، والذي يربط biarsenical الأصباغ ، ReAsH (أحمر فلوري) وفلاش (الفلورية الخضراء) ، مع خصوصية عالية حتى في الخلايا الحية 2. نظام صبغ TC / biarsenical عروض قيود أقل بكثير الفراغية للبروتين المضيف من البروتينات الفلورية التي مكنت عدة مقاربات جديدة لقياس التغيير متعلق بتكوين والبروتين البروتين التفاعلات 4-7. نحن وضعت مؤخرا تطبيق الرواية من العلامات TC وأجهزة الاستشعار من oligomerization في الخلايا معربا عن huntingtin متحولة ، والتي عندما تحولت المجاميع في الخلايا العصبية في مرض هنتنغتون 7. وكان الموسومة Huntingtin مع اثنين من الأصباغ الفلورية ، واحدة بروتين فلوري لتتبع مكان البروتين ، والثاني علامة TC الوحيد الذي يربط الأصباغ biarsenical في مونومرات. وبالتالي ، تمكين تغييرات في colocalization بين البروتين والتفاعل صبغ biarsenical قليل وحدات غير مرئي بالمجهر المحتوى ليتم تعيينها مكانيا داخل الخلايا. هنا ، نحن تصف كيفية تسمية TC - الموسومة بروتينات تنصهر لبروتين فلوري (الكرز ، أو GFP CFP) مع فلاش أو ReAsH في خلايا الثدييات الحية وكيفية قياس مضان اللون اثنين (الكرز / فلاش ، CFP / فلاش أو GFP / تركيبات ReAsH).
1. إعداد الخلايا لوصفها مع ReAsH / فلاش
علما أنه من المهم استخدام الضوابط الإيجابية والسلبية لتقييم مدى ملزمة محددة لعلامات TC وتقييم لbleedthrough من مضان بين القنوات عند جمع micrographs مبائر. وبالتالي ، لونين (مثل فلاش / الكرز أو ReAsH / CFP أو تركيبات ReAsH / GFP) ، وضمان استعداد عينات للألوان واحد (مثل البروتين نيون وحدها أو إذا كان ذلك ممكنا بروتين TC - الموسومة منضمة إلى فلاش / ReAsH ولكن مع عدم وجود الفلورسنت البروتين)
فمن المهم أن نضيف بتوقيت شرق الولايات المتحدة لأول مرة أمام مضيفا فلاش / ReAsH وجعل العازلة فقط قبل إضافته إلى الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة بالضبط في 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة. في أوقات أطول تجربتنا الحضانة إلى زيادة كبيرة في مضان الخلفية. وينبغي أيضا أن يكون الأمثل بنيات جديدة لوصفها الوقت وفلاش / تركيز ReAsH (0،5-2 ميكرومتر).
بعد ذلك يغسل ، قد تكون ثابتة في الخلايا مع بارافورمالدهيد (15 دقيقة بمحلول 3.2 ٪) ، على الرغم من أننا وجدنا أن هذه الزيادات غير محددة صبغ مضان biarsenical. وبالتالي فإننا عادة صورة الخلايا الحية في درجة حرارة الغرفة. (لاحظ أن التثبيت من قبل الخلايا يمنع وضع العلامات biarsenical صبغة ملزمة.)
2. تصوير الخلايا على المجهر مبائر
3. تحليل البيانات
4. ممثل النتائج :
نجاح الخلايا الوسم مع الأصباغ biarsenical يعتمد على معايير رئيسية قليلة. أولا ، توقيت وضع العلامات مع الأصباغ أمر بالغ الأهمية. لقد وجدنا أن تمديد فترات وضع العلامات (أكثر من 30 دقيقة) عن نتائج في مستوى عال من تلوين الخلفية غير محددة. الشكل 1 يبين نتيجة نموذجية لنموذج من النوع البري من جزء huntingtin (25Q) لتنصهر أزرق مشتق CFP تحتوي على علامة TC 7 كما هو موضح سابقا. وكان هذا النموذج الملون لمدة 30 دقيقة مع ReAsH وهناك الحد الأدنى من الخلفية في العينة التي تفتقر إلى سمة TC. لقد وجدنا أن الخلايا مع تحديد الخلفية إلى زيادة بارافورمالدهيد حين تحديد الميثانول مع ناسخ لمضان العلامة بروتين فلوري. وبالتالي أمكن لنا صورة الخلايا الحية. من المهم أن نلاحظ أيضا أن التثبيت قبللوضع العلامات مع الأصباغ biarsenical يمنع تجليدها ، ويفترض أن يعود إلى إدخال تعديلات على عزر TC.
آخر عاملا حاسما لنتائج متسقة وكثافة الخلايا. لقد وجدنا أنه من الأهمية بمكان لخلايا صورة التي يتم توزيعها بشكل فضفاض ، وأيضا أن التثاقل واسعة يمكن أن تؤدي إلى تلطيخ متفاوتة من الأصباغ biarsenical في خلايا مختلفة.
الشكل 1. Tetracysteine به وتلطيخ ReAsH في الخلايا الحية مع transfected huntingtin (exon1 - 25Q) - أزرق اندماج. وتقع العلامة TC عند تقاطع للانصهار huntingtin - أزرق (كما هو موضح في 7). العلاقة كثافة بكسل مؤامرة يمكن تقييم الاختلافات في ReAsH ملزم في جميع أنحاء الخلية ، ويمكن استخدامها لرسم خريطة التغييرات في ReAsH ملزمة بتكوين جزئي نتيجة لتغير أو تفاعلات يجند.
نهج التعريب البروتين التسمية مع بروتين فلوري وخصائص متعلق بتكوين مع صبغة second تقدم إمكانات كبيرة لرسم الخرائط حيث التشكل مختلفة من بروتينات تتراكم في الخلايا والأحداث التي تغير ديناميات التشكل البروتين. وقد استخدم لأول مرة ReAsH / فلاش وجهاز استشعار في الخلية للطي البر...
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منح لDMH وTDM (NHMRC منح المشاريع). DMH زميل Grimwade ، بتمويل من صندوق Miegunyah.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم الكاشف | شركة | رقم كتالوج | تعليقات |
---|---|---|---|
8 - جيدا μ - الشرائح | Ibidi | 80826 | نجد هذه الشرائح الغرفة لتكون مفيدة بشكل خاص لزراعة الخلايا للتصوير. |
TC - FLASH الثاني في الخلية Tetracysteine كشف العلامات كيت * * * مضان أخضر للخلية الحية التصوير | Invitrogen | T34561 (فلاش) أو T34562 (ReAsH) | |
هانكس "محلول الملح المتوازن | Invitrogen | 14175-103 | |
2،3 - Dimercapto - 1 - بروبانول | سيغما الدريخ | D1129 - 5ML | |
1،2 - Ethanedithiol | سيغما الدريخ | 02390 - 25ML |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved