الشلل البكتيرية للتصوير بواسطة الفحص المجهري القوة الذرية

Summary

يمكن أن يجمد تعيش البكتيريا سالبة الجرام والجرام إيجابية على الجيلاتين المغلفة الميكا وتصويرها في السائل باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية (AFM).

Abstract

فؤاد هو قرار عالية (مقياس نانومتر) أداة التصوير التي تحقيقات ميكانيكيا السطح. فمن لديه القدرة على الخلايا والجزيئات الحيوية الصور ، في البيئة السائلة ، دون الحاجة إلى علاج كيميائي العينة. من أجل تحقيق هذا الهدف ، يجب أن تلتزم بما فيه الكفاية لعينة سطح متزايدة لمنع إزالة القوات التي بذلتها ناتئ المسح غيض فؤاد. في كثير من الحالات ، والتصوير الناجح يعتمد على تجميد العينة إلى السطح في تصاعد مستمر. على النحو الأمثل ، يجب أن يكون تجميد مينيملي لهذه العينة التي لا شبهة عمليات التمثيل الغذائي والصفات الوظيفية. بواسطة طلاء الأسطح الميكا المشقوق حديثا مع الخنازير (خنزير) الجيلاتين ، يمكن أن يجمد البكتيريا سالبة الشحنة على السطح والتقط في السائل بواسطة فؤاد. تجميد الخلايا البكتيرية على الجيلاتين المغلفة الميكا هو على الأرجح بسبب التفاعل الكهربائي بين البكتيريا سالبة الشحنة والجيلاتين موجبة الشحنة. ويمكن لعوامل عديدة تتداخل مع الشلل الجرثومية ، بما في ذلك المكونات الكيميائية للسائل الذي تعلق البكتيريا ، وفترة حضانة البكتيريا من الجيلاتين على خصائص السطح المطلي الميكا ، من سلالة بكتيرية والمتوسطة التي يتم تصويرها على البكتيريا. عموما ، تم العثور على استخدام الجيلاتين المغلفة الميكا لتكون قابلة للتطبيق عموما للخلايا الميكروبية التصوير.

Protocol

1. الميكا التحضير :

1. قطع الميكا (علوم المجهر الإلكتروني) مع مقص لحجم اللازمة لاحتواء المجهر AFM (حوالي 22 × 30 ملم).
2. يلتصق على الميكا على كلا الجانبين ، وذلك باستخدام الشريط عموما لإزالة الطبقة الخارجية ، وحتى طبقات فقط لا تزال متواصلة على نحو سلس.

2. إعداد حل الجيلاتين :

1. إضافة 100 مل من الماء المقطر لزجاجة المختبر.
2. حرارة الزجاجة في الميكروويف حتى يبدأ الماء في الغليان. (إذا لم يتوفر الميكروويف ، ويمكن تسخين الماء في الكأس على طبق ساخن.)
3. خارج تزن 0.5 غرام من الجيلاتين (سيغما G - 6144 ، G - 2625 أو 2500 G) وإضافة إلى الماء المقطر الساخن.
4. بلطف دوامة يذوب تماما الزجاجة حتى الجيلاتين.
5. تبريد حل الجيلاتين الى 60-70 درجة مئوية.
6. صب حوالي 15 ملم في كوب صغير (20 مل) إلى التي يمكن انخفض الميكا خفض المشقوق.

3. الميكا طلاء :

1. يغرق الساحات الميكا في الحل وسحب الجيلاتين تحسنت بسرعة أن مثل هذه الميكا وهي مغلفة (الشكل 1A).
2. بعد طلاء ، ودعم الميكا على الفور ، على حافة الهاوية ، على منشفة ورقية لتجف في الهواء المحيط (الشكل 1B). يمكن استخدام الجيلاتين الميكا المغلفة على الأقل 2 أسابيع. يمكن الاحتفاظ الزائد حل الجيلاتين مبردة وتستخدم لمدة شهر تقريبا قبل الحل ببساطة إعادة تسخين الأسهم إلى ما بين 60-70 درجة مئوية. يجب توخي الحذر لضمان أن الجيلاتين ليس المغلي خلال إعادة تسخين.

4. تركيب البكتيريا على الميكا المغلفة الجيلاتين :

1. بيليه 1 مل من ثقافة البكتيرية (0،5-1،0 OD في 600 نانومتر) في 4500 من 800 إلى إطار التعاون الإقليمي. اعتمادا على البكتيريا ، واستخدام الحد الأدنى من التعاون الإقليمي التي من شأنها أن بيليه الخلايا في الدقائق ال 5 ~.
2. غسل بيليه في نفس الحجم من الماء منزوع الأيونات تمت تصفيتها أو العازلة.
3. جمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي.
4. Resuspend على الفور بيليه في 500 ميليلتر من الماء منزوع الأيونات nanopure أو العازلة. (يجب أن يكون التعليق البكتيرية عكر واضح من أجل أن يكون هناك تركيز كاف من الخلايا للتصوير AFM).
5. تطبيق نظام التعليق الخلية (10-20 ميكرولتر) إلى الميكا الجيلاتين المغلفة وانتشارها على السطح باستخدام تلميح ماصة (الشكل 1C). وينبغي الحرص على عدم لمس فعليا سطح الجيلاتين مع طرف ماصة أثناء تطبيق أو نشر الحل الجرثومية.
6. السماح للسطح للراحة لمدة 10 دقيقة وشطف مع تيار من الماء أو العازلة (الشكل 1 CD). في جميع أنحاء الداخلي ، واتخاذ الحذر لضمان أن لا يسمح للعينة لتجف.

5. ممثل النتائج :

الشكل 2 يبين مثل الصور من الخلايا البكتيرية التي تم تركيبها على الجيلاتين المغلفة الميكا والتقط بواسطة فؤاد. في مختبراتنا ، يتم تصويرها عادة العينات باستخدام مجهر القوة الذرية PicoPlus (اجيلنت تكنولوجيز ، ومعبد ، من الألف إلى الياء) تجهيزه برأس المسح 100 ميكرون. ويتم تشغيل الأداة في 128-512 بكسل لكل خط مسح في سرعة تفحص خطوط 0،5-1،0 / ثانية. والكابولي التي تستخدم عادة في تحقيقات Veeco نيتريد السيليكون (MLCT - AUHW ، Veeco ، وسانتا باربرا ، كاليفورنيا) مع ثوابت الربيع الاسمية تتراوح ،01-0،1 NN / نانومتر.

الشكل 1. الجيلاتين في درجة حرارة 60-70 درجة مئوية. توضع في كوب C 20 مل. باستخدام زوج من ملاقط المشقوق طازجة ويغرقها في الساحات الميكا الجيلاتين (أ) سحب وضعت رأسي على منشفة ورقية يميل ضد الطرد المركزي الرف الصغير (ب). يتم وضع قطرة من العينة على الميكا البكتيرية وانتشارها مع طرف الماصة X في كل الاتجاهات وY (ج). بعد السماح لاحتضان العينة على سطح الميكا لا يقل عن 10 دقيقة ، شطف العينة في تيار من الماء المقطر. إذا كان الشلل عملت سوف تكون قادرا على رؤية بقعة معتمة على الميكا كما هو موضح في اللوحة اليمنى من (د). إذا كان الشلل لم تنجح سوف تحصل على قطعة من الميكا واضحة كما في اللوحة اليسرى. بقعة معتمة على جداول الميكا للتركيز البكتيريا في الحبرية التي تضع على الميكا الجيلاتين المعالجة.

الشكل 2. الصور AFM من E. القولونية. في لوحة (أ) ، هي التي شنت على الجيلاتين الخلايا المغلفة الميكا والمصورة في برنامج تلفزيوني 0،005 م. وعلى سبيل المقارنة ، يظهر صورة من الخلايا البكتيرية التي شنت على الجيلاتين المغلفة الميكا وتصويرها في الهواء في لوحة (ب). على الرغم من حواجز مرئية بشكل واضح في الصورة التي جمعت في السائل ، والمزيد من القرار ، كما يتبين من وجود الشعرة (لوحة أقحم (ب)) ، ويمكن الحصول عليها في الهواء.

Discussion

ويمكن لعوامل مختلفة تؤثر على الخلايا الميكروبية والتصوير المتزايدة التي كتبها فؤاد. والجيلاتين الذي يستخدم لطلاء الميكا هو المهم. معزول التجارية الجيلاتين من عدد من الفقاريات بما فيها الأسماك ، الأبقار ، والخنازير. كل من الأصل وطريقة المعالجة تحديد مدى صلاحيتها لل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم	شركة	فهرس العدد
الجيلاتين	سيغما ، وسانت لويس ، MO	G6144 ، G2625 أو G2500
PicoPlus مجهر القوة الذرية	اجيلنت تكنولوجيز ، تمب ، من الألف إلى الياء
الكابولي AFM	Veeco ، وسانتا باربرا ، كاليفورنيا	MLCT - AUHW