JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويرد تعديل 3 - D في النظام المختبر الذي خصائص النمو للعديد من خطوط الخلايا السرطانية في الغشاء القاعدي إعادة ربط مع السلوك التكاثري نائمة أو خلايا الورم في موقع ثانوي النقيلي في الجسم الحي.

Abstract

تكرار الاصابة بسرطان الثدي غالبا ما يلي فترة طويلة الكامنة التي لا توجد مؤشرات على السرطان ، والانبثاث قد لا تصبح واضحة سريريا حتى سنوات عديدة بعد إزالة الورم الأولي والعلاج المساعد. والتفسير المحتمل لهذه الظاهرة هو أن الخلايا السرطانية والمواقع المصنفة المتنقل ، ومقاومة للعلاجات التقليدية ، وتظل ساكنة لفترات طويلة من الزمن 1-4.

وقد وصفت وجود خلايا سرطانية نائمة في مواقع الثانوية سابقا زنازين انفرادية هادئة التي تتكاثر ولا تخضع لموت الخلايا المبرمج 5-7. علاوة على ذلك ، وقد تبين هذه الخلايا لنشر الانفرادي من الورم الأساسي في مرحلة مبكرة من تطور المرض و80-10 يقيمون نمو اعتقل في نخاع العظم للمرضى ، والدم والغدد الليمفاوية 1،4،11. لذا ، فهم الآليات التي تنظم السكون أو التبديل إلى حالة التكاثري هو أمر حاسم لاكتشاف أهداف الرواية والتدخلات اللازمة لمنع تكرار المرض. ومع ذلك ، كشف آليات تنظيم التحول من السكون إلى نمو الورم النقيلي قد تعرقلت بسبب عدم وجود نظم نموذج المتاحة.

في الجسم الحي ، ونظم السابقين نموذج الجسم الحي لدراسة تطور الخلايا السرطانية المنتشر وقد وصفت سابقا 1،12-14. لكن هذه الأنظمة لم تقدم النموذج في الوقت الحقيقي ، وارتفاع في رؤى الإنتاجية بطريقة ميكانيكية الى ما يتسبب في ظهور الخلايا السرطانية النائمة الانفرادي لتتكاثر والمرض المنتشر. وقد وضعنا مؤخرا 3D في نظام المختبر إلى النموذج في خصائص نمو خلايا الجسم الحي الذي يحمل السلوك المنتشر نائمة إما (D2.OR ، MCF7 ، K7M2 - AS.46) أو التكاثري (D2A1 ، MDA - MB - 231 ، K7M2) في الجسم الحي. أظهرنا ان الخلايا السرطانية التي تظهر في الجسم الحي السكون في موقع النقيلي تبقى هادئة عند المثقف في 3 البعد (3D) القبو استخراج غشاء (BME) ، في حين أن خلايا الجسم الحي المنتشر بشكل كبير في تتكاثر بسهولة في الثقافة 3D بعد المتغير ، لكنها قصيرة نسبيا فترات من الهدوء. الأهم من خلال الاستفادة من نموذج 3D في نظام المختبر أثبتنا للمرة الأولى أن تكوين ECM يلعب دورا مهما في تنظيم ما إذا كانت الخلايا السرطانية النائمة ستتحول الى دولة التكاثري وأكدت هذه الدراسات المجراة في عام 15-17. وبالتالي ، فإن النظام النموذجي المبينة في هذا التقرير يوفر الأسلوب في المختبر لنموذج الورم السكون ودراسة التحول إلى النمو التكاثري يسببها المكروية.

Protocol

1. خلية نائمة ثقافة الصيانة وخطوط الخلايا السرطانية النقيلي

  1. تنمو الخلايا السرطانية النائمة (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) ، والمتنقل (D2A1 / MDA - MB - 231 / K7M2) في 10 سم تحتوي على لوحات ثقافة متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) الجلوكوز 10 ٪ وارتفاع مصل بقري جنيني ( FBS) والمضادات الحيوية. بمجرد الوصول إلى نقطة التقاء الخلايا 70-80 ٪ ، والمضي قدما في المقايسات التالية.

2. مقايسة الخلايا انتشار الخلايا السرطانية النائمة (هادئة) ، والمتنقل (تكاثر) تربيتها في نظام 3D - BME

زراعة خلايا نائمة / المتنقل في نظام 3D

  1. ذوبان الجليد عامل انخفاض النمو Cultrex سرداب استخراج الأغشية (BME) في الثلاجة 4 درجة مئوية ليلة قبل تنفيذ الفحص. ملاحظة يجب أن يكون التعامل مع BME على الجليد في جميع الأوقات.
  2. في اليوم التالي ، وضع لوحة بشكل جيد على 96 علبة من الجليد داخل غطاء الصفحي. معطف جيدا مع كل 100μl - 50 من BME الجليد الباردة مع موزع باستخدام حقنة. تأكد من أن يتم تشكيل أي فقاعات في الآبار. 96 مكان لوحة مغطاة جيدا BME في حاضنة ترطيب مع 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. في غضون ذلك نضح وسائل الإعلام من الخلايا النائمة والورم النقيلي أو (المعد في الفرع 1). شطف لوحات الثقافة مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة ، ودرجة الحموضة 7.4 (PBS). نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة التربسين 2ml قبل حرارة بلغت 37 درجة مئوية ، لوحات الثقافة. احتضان لوحات في ترطيب 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية ، لمدة 5 دقائق.
  4. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 15 مل من الجلوكوز 5ml DMEM عالية تستكمل مع FCS 10 ٪ والمضادات الحيوية وعدد الخلايا.
  5. تدور باستمرار عدد الخلايا الإجمالي للمثقف في نسيج الثقافة الطرد المركزي بسرعة 1500g ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. في المقايسات نحن نستعد لدينا خلايا 2X10 3 / جيد لكل خط الخلية أو نقطة من الوقت لدراستها. ولكن هذا قد تختلف تبعا لخطوط الخلايا المستخدمة.
  6. نضح بعناية طاف. نلاحظ ، في معظم الحالات بيليه غير مرئية. لذلك ، وراء ترك بعض وسائل الإعلام. اضغط على الجزء السفلي من الأنبوب المخروطية 15ml بأصابعك لضمان الحصول على تعليق من الخلايا واحد. إعادة تعليق بيليه مع الجلوكوز DMEM منخفضة بالمضادات الحيوية تستكمل مع 2 ٪ FCS BME + 2 ٪ (مقايسة وسائل الاعلام). وينبغي أن يضاف 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام لفحص كل الخلايا 3 2x10. متمزج الخلايا مرات عديدة مع ماصة 5ml لضمان الحفاظ على تعليق خلية واحدة.
  7. صحن 100μl الخليط جيدا على الخلية في أعلى لوحة 96 المغلفة جيدا BME. لتقييم الخلفية (في القسم 2.8) في لوحة 100μl بالإضافة لكل بئر فقط من وسائل الإعلام مقايسة على أعلى من 96 لوحة BME مغلفة جيدا. احتضان المثقف 96 لوحات بشكل جيد في ترطيب حاضنة 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. وينبغي إعادة تغذية الخلايا كل 4 أيام مع وسائل الإعلام مقايسة.

مقايسة الانتشار :

  1. مقايسة انتشار الخلايا : إضافة إلى الآبار في الوقت المطلوب 20 نقطة ميكرولتر من العيار الحجمي 96 خلية خلية مائي حل واحد عدة مقايسة انتشار الأسلحة النووية. احتضان في حاضنة ترطيب 5 ٪ CO 2 عند درجة 37 ل2H. باستخدام قارئ اللوحة إليسا تسجيل الامتصاصية في 490nm. لتقييم الخلفية والطرح ، إضافة 20μl من العيار الحجمي 96 خلية خلية مائي حل واحد لعدة مقايسة انتشار الآبار المغلفة مسبقا مع BME ومضافين فقط مقايسة مع وسائل الاعلام. باستخدام قارئ اللوحة إليسا تسجيل الامتصاصية في 490 نانومتر.

3. مناعي تلطيخ لجزيئات الخلايا في الخلايا إشارات (هادئة) نائمة الورم و / أو المتنقل (تكاثر) الخلايا السرطانية

زراعة خلايا نائمة / المتنقل في نظام 3D لتلطيخ immunfluorescence

* البروتوكول التالي هو تعديل لبروتوكول الثقافة 3D نشرتها J Debnath 18 آخرون.

  1. إعداد BME كما هو موضح في القسم 2.1. في اليوم التالي : مكان شريحة زجاجية 8 الغرفة النظام على صينية من الجليد داخل غطاء الصفحي. معطف جيدا مع كل من 50ul BME الجليد الباردة باستخدام pipetman 200μl. تأكد من انتشار BME بالتساوي ويتم تشكيل أي فقاعات في الآبار. وضع زجاج الغرفة 8 الشرائح المغلفة مع ثاني BME في ترطيب 5 2 ٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. الخلايا النائمة والحصاد أو النقيلي من الباب 1 والاستعداد للثقافة كما هو موضح في القسم 2،3-2،4. جمع العدد الكلي للخلايا أن يكون المثقف في أنبوب مخروطي 15 مل. نحن نستعد 5 X10 3 خلايا / جيد لكل خط الخلية ونقطة من الوقت لدراستها. تدور باستمرار الخلايا في نسيج الثقافة الطرد المركزي بسرعة 1500g ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. نضح في الطافي بعناية. علما بأن بيليه غير مرئية ، ولذلك ترك وراء بعض وسائل الاعلام. اضغط على الجزء السفلي من الأنبوب المخروطية 15ml بأصابعك لضمان الحصول على تعليق خلية واحدة.إعادة تعليق بيليه مقايسة مع وسائل الاعلام. وينبغي أن يضاف 400μl وسائل الإعلام لفحص كل الخلايا 3 5x10. متمزج الخلايا الماصة عدة مرات مع 5ml. هذه الخطوة مهمة جدا لضمان الحفاظ على تعليق خلية واحدة.
  3. 400μl صفيحة الخليط جيدا لكل خلية على رأس كل دائرة من الدوائر 8 المغلفة مع BME. احتضان المثقف زجاج غرف 8 نظام الشرائح في ترطيب حاضنة 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. وينبغي إعادة تغذية الخلايا كل 4 أيام مع وسائل الإعلام مقايسة.

تلوين المناعي :

  1. عند نقاط الوقت المطلوب ، نضح في الطبقة العليا من وسائل الإعلام وإضافة 200μl من تثبيتي لامتصاص العرق تحتوي على 4 ٪ (PFA) ، 5 ٪ والسكروز 0.1 ٪ تريتون X - 100 واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. نضح لتثبيتي ، وإضافة 200μl PFA من 4 ٪ التي تحتوي على 5 ٪ سكروز ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
  2. إضافة مخزنة 400 ميكرولتر من الفوسفات الملحي (PBS) إلى كل جيدا ؛ نضح لتثبيتي. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 400 برنامج تلفزيوني μ تحتوي على 0.05 ٪ توين 20 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. كتلة الخلايا في درجة حرارة الغرفة ثابتة مع 200μl إما مصل حمار 10 ٪ أو 3 ٪ مع جيش صرب البوسنة ل1hour (عرقلة الحل ينبغي أن تحدد لاستخدامها تجريبيا لكل الضد الابتدائي).
  4. نضح عرقلة الحل وإضافة 200μl من الأجسام المضادة الأولية (وينبغي أن تحدد تخفيف تجريبيا لكل الأجسام المضادة الأولية لاستخدامها). تمييع الضد الابتدائية في المصل حمار 10 ٪ إذا تم استخدام 10 ٪ حمار مصل لعرقلة أو إضعاف الضد الرئيسي في جيش صرب البوسنة 3 ٪ إذا تم استخدام 3 ٪ BSA حل حظر. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. نضح الأجسام المضادة ، وغسل الآبار مع PBS 400μl لمدة 15 دقيقة وكرر مرتين. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 200μl من الحمير ، منها مكافحة مترافق مفتش الحكومة إلى الأحمر رودامين (ينبغي أن تحدد تخفيف تجريبيا) ، وتغطي الشريحة الغرفة 8 بورق الألمنيوم واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل الآبار مع PBS 400μl (3x15 دقيقة كل غسل). نضح برنامج تلفزيوني. تصاعدت مع تصاعد VECTASHIELD المتوسطة مع دابي. الشرائح جافة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. يمكن الاحتفاظ الشرائح : 1 درجة مئوية في الاسبوع 4 تخزين الشرائح في الظلام. صورة الشرائح من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.

4. ممثل النتائج :

ويرد مثال لتحليل انتشار الخلايا النائمة وD2.0R الورم النقيلي D2A1 في الثقافة 1A 3D في الشكل. خلايا نائمة وD2.0R (هادئة) من خلال التجربة بأكملها 14 يوما في حين أن الفترة ثقافة عالية D2A1 النقيلي خلايا نائمة تبقى فقط لمدة أربعة إلى ستة أيام وبعد ذلك يبدأون في الانتشار. خلال المرحلة الأولي نائمة ، لا تزال العديد من الخلايا في الثقافة الانفرادي 3 - D (1B الشكل ؛ يوم 4) في حين أن غيرها من الخلايا المتكاثرة غير شكل متعددة الخلايا الأجسام الشبه الكروية. ويرتبط مع التغيرات الهائلة في التشكل الخلية ، وانتقال D2A1 خلايا نائمة من التكاثري للدولة في 3 - D الثقافة (يوم 12 1B الشكل). وبالتالي ، يمكن استخدام هذا الاختبار لاختبار ما عامل / ثانية قد تؤدي إلى خلايا نائمة D2.0R للخروج من حالتها نائمة وما عامل / ثانية قد تمنع الخلايا D2A1 الانتقال من دولتهم في سبات عميق. الشكل 2 مثالا وكيلا D2A1 منع الخلايا النائمة إلى الانتقال من دولة إلى التكاثري. حافظت العلاجات D2A1 الخلايا مع مثبط محددة من الضوء الميوسين كيناز السلسلة (ML - 7) كما هو موضح في الشكل 2 ، D2A1 الخلايا في حالة سبات.

ويمكن دراسة الخلية إشارات في الخلايا النائمة الورم وتنتشر تربيتها في نظام 3D بواسطة تلوين المناعي لجزيئات الخلايا إشارة. كما هو موضح في الشكل (3) زيادة كبيرة في ضوء سلسلة الفسفرة الميوسين D2A1 في الخلايا (تلوين أحمر) ، يليه إعادة تنظيم شعيرات F - أكتين تشكيل ألياف الأكتين الإجهاد (تلطيخ الأخضر) يحدث أثناء انتقالهم من السكون (1-4 أيام) ل انتشار (يوم 7). ومع ذلك ، وعرقلة الميوسين كيناز سلسلة النشاط في ضوء D2A1 الخلايا shRNA أو دواء معين (ML - 7) يحتفظ D2A1 الخلايا في حالة سبات والنتائج في تثبيط الفسفرة الميوسين الخفيفة وسلسلة من طراز F - أكتين منظمة الألياف الإجهاد (الشكل 4).

figure-protocol-9950
الشكل 1. نموذجية في المختبر لدراسة الانفرادي السكون الخلية السرطانية والتحول إلى النمو النقيلي. أ) انتشار D2.0R نائمة وD2A1 المنتشر في 3 - D BME Cultrex ، ن = 8 (يعني ± SE). ممثل نتائج ثلاث تجارب (* P ≤ 0.05). B) صور المجهر ضوء D2.0R والخلايا المستزرعة في D2A1 3 - ​​D X20 Cultrex التكبير BME.تعديل الرقم من 17 باركان وآخرون.

figure-protocol-10469
الشكل 2. منع تبديل D2A1 من الخلايا من السكون (سكون) في الانتشار في منظومة الثقافة 3D بواسطة تثبيط الميوسين كيناز ضوء سلسلة (MLCK). بالطبع وقت تكاثر الخلايا المستزرعة في D2A1 3 - ​​D BME Cultrex ، ن = 8 (يعني ± SE). وكانت الخلايا غير المعالجة (السيطرة) ، أو تعامل مع مثبط محددة من MLCK (ML - 7 ، 5 ميكرومتر) لبداية يوم 48 ساعة 5 الثقافة. تعديل الرقم من 17 باركان وآخرون.

figure-protocol-11014
الشكل 3. الميوسين الفسفرة ضوء تليها سلسلة من طراز F - أكتين اعادة التنظيم خلال التحول من D2A1 الخلايا من السكون إلى النمو التكاثري. وكان المثقف D2A1 الخلايا في 3 - D BME Cultrex في 8 الغرفة شريحة زجاجية. تم إصلاح الخلايا وملطخة دابي (الأزرق) لتوطين النووية ، phalloidin (الخضراء) لطراز F - أكتين ومع جسم مضاد ضد فسفرته شكل سلسلة ضوء الميوسين (MLC - P) (الحمراء) ، كما هو مبين في نقاط زمنية مختلفة. دمج أكتين - F ، وحركة تحرير الكونغو ف التلوين (الأصفر). وقد زاد من حركة تحرير الكونغو التعبير ف خلال فترة الانتقال من D2A1 الخلايا من السكون (days1 - 4) في النمو التكاثري (يوم 7) تليها الإجهاد أكتين تشكيل الألياف (الأسهم). مبائر المجهري والتكبير x63. شريط بيضاء يساوي 20 ميكرون. تعديل الرقم من 17 باركان وآخرون.

figure-protocol-11899
الشكل 4. . تثبيط الميوسين كيناز ضوء سلسلة (MLCK) بوساطة الألياف الإجهاد F - أكتين في تشكيل خلايا D2A1 كانت D2A1 خلايا غير المعالجة (السيطرة) ، أو للتعامل مع مثبط MLCK (ML - 7 ، 5 ميكرون) ، لتبدأ ساعة 48 يوم الثقافة 5 ، أو تعامل مع تدافعت أو shRNA MLCK والملون للنموذج فسفرته سلسلة ضوء الميوسين (MLC - P) (الحمراء) ، F - الأكتين (الأخضر) ، ونوى (الأزرق). دمج أكتين - F ، وحركة تحرير الكونغو ف التلوين (الأصفر). مبائر المجهري والتكبير x63. شريط بيضاء يساوي 20 ميكرون.

Discussion

الآليات الأساسية التي تحافظ على نشر الخلايا السرطانية في حالة سبات أو التي تمر بمرحلة انتقالية نتيجة لنمو النقيلي لا تزال مجهولة إلى حد كبير. وقد تحققت هذه الظاهرة في غاية الصعوبة للدراسة في المرضى من البشر 4،12 ونماذج قليلة قبل السريرية وضعت لمعالجة هذه المسأل?...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث في جزء من برنامج بحوث جماعية للمعهد الوطني للسرطان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
ارتفاع الجلوكوز DMEM Invitrogen 11965-118
DMEM انخفاض الجلوكوز Invitrogen 11885-092
الجنين مصل البقر (FBS) Invitrogen 10091-148
عامل نمو مخفض سرداب Cultrex 3 - D استخراج الغشائية شركة Trevigen تركيز البروتين بين 14-15mg/ml
D2.0R وخطوط الخلية D2A1 5،19
والخلايا K7M2 K7M2AS1.46 20
MCF - 7 و MDA - MB - 231 خلايا سرطان الثدي ATCC
على زجاج الغرفة 8 الشريحة نظام (لاب تيك ، الحرارية العلمية) 177402
العيار الحجمي 96 خلية خلية مائي حل واحد الانتشار مقايسة طقم Promega G3580
VECTASHIELD تصاعد المتوسطة مع دابي مختبرات شركة ناقلات H - 1200
الحمار العادي المصل جاكسون ImmunoResearch 017-000-121
إليسا قارئ اللوحة الحيوي تك سجل 490nm
مبائر المجهر زايس LSM - 510 - التكبير x63

References

  1. Aguirre-Ghiso, J. A. Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy. Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).
  2. Pantel, K., Woelfle, U. Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors. J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).
  3. Naumov, G. N. Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases. Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).
  4. Klein, C. A. Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations. Curr Opin Genet Dev. , (2010).
  5. Naumov, G. N. Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy. Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).
  6. Townson, J. L., Chambers, A. F. Dormancy of solitary metastatic cells. Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).
  7. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  8. Pantel, K. Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells. J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).
  9. Demicheli, R. Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer. Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).
  10. Braun, S. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).
  11. Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. Cancer micrometastases. Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).
  12. Goss, P. E., Chambers, A. F. Does tumour dormancy offer a therapeutic target. Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).
  13. Mendoza, A. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).
  14. Naumov, G. N. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).
  15. Barkan, D. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
  16. Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth. Eur J Cancer. , (2010).
  17. Barkan, D. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).
  18. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  19. Morris, V. L. Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth. Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).
  20. Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

54 BME 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved