Method Article
هذه الدراسة توضح الأسلوب الذي يسمح للتشخيص السريع والواضح من الأمراض الفيروسية النباتية في يوم واحد نحو نصف باستخدام مزيج من الميكروويف بمساعدة محطة إعداد العينات للفحص المجهري الإلكتروني النافذ والأساليب تلطيخ السلبية.
التحقيقات من التغييرات التي تحدثها الفيروسات التركيبية وغالبا ما تكون ضرورية لتحديد بشكل واضح الأمراض الفيروسية في النباتات. مع إعداد العينات للفحص المجهري الإلكترون التقليدي انتقال (TEM) مثل هذه التحقيقات يمكن أن يستغرق عدة أيام 1،2 و بالتالي فهي غير مناسبة لتشخيص السريع للأمراض النباتية الفيروس. ويمكن استخدام الميكروويف لتثبيت خفض كبير مثال لوقت التحضير للتحقيقات TEM مع نتائج مماثلة التركيبية كما لوحظ بعد إعداد العينات تقليديا 3-5. العديد من مختلف الأجهزة المخصصة الميكروويف التي تتوفر حاليا والتي يمكن استخدامها لتثبيت ناجحة وتضمينها من العينات البيولوجية للتحقيقات TEM 5-8. في هذه الدراسة أن نبرهن على فيروس موزاييك التبغ (TMV) إصابة النباتات تبغ نيكوتيانا أنه من الممكن لتشخيص التغيرات التركيبية في الأوراق في يوم واحد نحو نصف الميكروويف باستخدام إعداد نموذج لمساعدة TEM. لقد اخترنا لتنفيذ هذه الدراسة مع جهاز الميكروويف المتاحة تجاريا لأنه يؤدي إعداد العينات تقريبا بالكامل تلقائيا 5 في عكس الأجهزة الأخرى المتاحة حيث لا يزال العديد من الخطوات التي يتعين القيام بها يدويا هي 6-8 وبالتالي مزيد من الوقت والمستهلكة العمل. كما يمكن إعداد العينات يتم تنفيذ كامل تلطيخ السلبية تلقائيا من الجسيمات الفيروسية في العصارة من الأوراق المتبقية TMV المصابين وفحص التركيب الدقيق ليلي وحجم إجراء التثبيت وخلال التضمين.
إعداد نموذج الميكروويف بمساعدة
2. تقليم وتقطيع
3. تلوين سلبي
4. تحليل الصور
5. ممثل النتائج:
يمكن بعد إعداد نموذج الميكروويف بمساعدة التعديلات التي يسببها TMV نموذجية التركيبية مثل ملاحظتها مناطق واسعة تحتوي على virions الانحياز في شكل متواز مع انتقال المجهر الالكتروني في العصارة الخلوية من Nicotian المصابةوالخلايا تبغ (الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك، في النسغ الخام من TMV المصابين يترك ويمكن ملاحظة الجسيمات TMV كما flexuous هياكل على شكل قضيب، وبعد تلطيخ السلبية (الشكل 1B). كشف تحليل الصور من جزيئات الفيروسات 100 حجم متوسط TMV من 280nm في الطول والعرض في 17nm (الشكل 2). تم العثور على التركيب الدقيق في TMV المصابين وحجم الخلايا من virions لوحظ في هذه الدراسة أن تكون وفقا للخصائص التي يسببها TMV التركيبية في التبغ، ومجموعة من الجسيمات حجم TMV ذكرت سابقا في الأدب 9-15.
الرقم انتقال الإلكترون 1. micrographs من الخلايا المصابة ورقة TMV وvirions. A) الصورة تبين التركيب الدقيق للخلايا المصابة TMV أوراق تبغ نيكوتيانا من نسيج الورقة المتوسط بعد الميكروويف بمساعدة محطة إعداد العينات. لاحظ مساحة واسعة من virions موازية الانحياز التي تراكمت في العصارة الخلوية.C = بلاستيدات الخضراء مع النشا (القديس)، M = الحبيبات الخيطية، N = النواة، V = فجوة، بار = 2μm. B) الصورة تظهر virions التي تم الكشف من قبل تلطيخ السلبية في النسغ من الأوراق المصابة.
الشكل 2. الحجم النسبي من virions. توزيع نسبي طول وعرض TMV-الجسيمات بعد تلطيخ السلبية النسغ من الأوراق المصابة لأنها ظهرت في المجهر الإلكتروني. تم حساب قيم متوسطة (يعني طول / عرض ± الانحراف المعياري) من 100 virions.
وقد ثبت الميكروويف عينة النبات بمساعدة استعدادا لTEM لتوفير بيانات التركيبية سريعة وموثوق بها في غضون ساعات قليلة 3،4،16. كان الحفاظ غرامة الهيكلية للعضيات والأغشية تحقيق مع الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة مشابهة لعينات التقليدية وcryofixed 5،15 مع الاستفادة من انخفاض كبير في تثبيت العينة وتضمينها الوقت من 3 أيام أو أكثر إلى حوالي 2 ساعة. هذا يمثل أسرع إعداد بروتوكول للعينة TEM المتاحة حاليا في الأدب. الطريقة الموضحة في هذه الدراسة جنبا إلى جنب الميكروويف عينة النبات بمساعدة استعدادا لTEM مع أساليب تلطيخ السلبية التي سمحت تحديد واضح وسريع من TMV الناجم عن التغيرات التركيبية وكيل الفيروسية نفسها. يمكن التحقيق TMV التعديلات التي يسببها التركيبية بعد التشذيب، وتقطيع آخر تلطيخ داخل حوالي 4 ساعات بعد بداية التثبيت في نقل كهربائيترون المجهر. باستخدام عينة بالكامل إعداد وضع تلقائيا الافراج عن الباحث لإجراء تلطيخ السلبية في هذه الأثناء من أجل تحديد حجم وعرض وكيل الفيروسية. وهكذا، يمكننا أن نستنتج أن هذا الأسلوب يسمح للتشخيص واضح وسريع من الأمراض الفيروسية النباتية في يوم واحد نحو نصف وهو أمر ذو أهمية كبيرة لاستخدامها في المستقبل في تجارب الزراعة والعلمية في أمراض النبات النبات. كما يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتشخيص السريع للحيوان والأمراض التي تصيب الإنسان لديها إمكانيات كبيرة لتطبيقها في المستقبل في علم الأمراض الطبية والبيطرية.
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
وأيد هذا العمل من قبل صندوق العلوم النمساوية (FWF، P20619 P22988 لوBZ).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم كاشف / معدات | شركة | كتالوج رقم | تعليقات |
غلوتارالدهيد | أجار العلمية المحدودة | R1312 | |
الأزميوم رابع أكسيد | أجار العلمية المحدودة | R1022 | |
أجار 100 الراتنج | أجار العلمية المحدودة | R1043 | |
السكسينيك أنهيدريد Dodecenyl | أجار العلمية المحدودة | R1051 | |
الميثيل أنهيدريد نادك | أجار العلمية المحدودة | R1081 | |
بنزيل ثنائي ميثيل أمين | أجار العلمية المحدودة | R1060 | |
يؤدي سترات | أجار العلمية المحدودة | R1210 | |
اليورانيل خلات | أجار العلمية المحدودة | R1260A | |
حمض الفسفوتنغستيك | أجار العلمية المحدودة | R1213 | |
Formvar | أجار العلمية المحدودة | R1202 | |
لايكا EM AMW | لايكا مايكروسيستمز | ||
لايكا (رايشرت) Ultratrim | لايكا مايكروسيستمز | أحدث نموذج متاح | |
لايكا (رايشرت) Ultracut S | لايكا مايكروسيستمز | أحدث نموذج متاح | |
Diatome الترا 45 | Gröpl | ||
فيليبس CM10 TEM | الاتحاد الدولي للفروسية (فيليبس سابقا) | أحدث نموذج متاح | |
خلية D | OLYMPUS شركة | ||
Optimas 6.5.1 | وسائل الإعلام علم التحكم الآلي وشركة | أحدث إصدار متاح |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved