تشكيل الأنبوبة Matrigel القائم على الفحص لتقييم نشاط الخلايا السرطانية مكون للأوعية

Summary

ويستخدم فحص أنبوب تشكيل لتقييم نشاط الأوعية الدموية للخلايا السرطانية.

Abstract

على مدى العقود العديدة الماضية ، وهي مقايسة تشكيل باستخدام أنبوب عامل نمو مخفض تم Matrigel يعملون عادة للتدليل على النشاط عائية من خلايا بطانة الأوعية الدموية في المختبر ^1-5. ومع ذلك ، فقد أظهرت أدلة متزايدة مؤخرا ان لا يقتصر هذا الاختبار لاختبار سلوك الأوعية الدموية للخلايا بطانة الأوعية الدموية. بدلا من ذلك ، كما تم استخدامها لاختبار قدرة عدد من الخلايا السرطانية لتطوير النمط الظاهري الأوعية الدموية ^6-8. وهذه القدرة بما يتفق مع سلوكهم مكون للأوعية التي تم تحديدها في الحيوانات xenotransplanted ، وهي عملية تعرف باسم مكون للأوعية المحاكاة (VM) ^9. هناك العديد من الأدلة تثبت أن الخلية السرطانية بوساطة VM تلعب دورا حيويا في تطوير الورم ، ومستقلة عن الأوعية الدموية الخلية البطانية ^{6 ، 10-13.} على سبيل المثال ، تم العثور على الخلايا السرطانية للمشاركة في الدم perfused ، وتشكيل قناة الأوعية الدموية في عينات من الانسجة من المرضى سرطان الجلد وورم أرومي دبقي ^{8 ، 10 ، 11.} هنا ، وصفنا هذا الاختبار شبكة أنبوبية ، باعتبارها أداة مفيدة في تقييم نشاط مكون للأوعية من خلايا الورم. وجدنا أن بعض خطوط الخلايا السرطانية مثل سرطان الجلد B16F1 خلايا ورم أرومي دبقي U87 خلايا ، وسرطان الثدي MDA - MB - 435 الخلايا قادرة على تشكيل الأنابيب الأوعية الدموية ، ولكن البعض لا مثل سرطان القولون HCT116 الخلايا. وعلاوة على ذلك ، فإن هذا النمط الظاهري الأوعية الدموية تعتمد على الأرقام الخلية مطلي على Matrigel. لذا ، قد يكون هذا الفحص بمثابة أداة قوية لفحص الأوعية الدموية المحتملة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا بما فيها خلايا الأوعية الدموية ، والخلايا السرطانية فضلا عن خلايا أخرى.

Protocol

1. تشكيل الأنبوبة Matrigel القائم على الفحص لتقييم نشاط الخلايا السرطانية مكون للأوعية

1. ونمت الخلايا السرطانية في الدماغ مثل U87 الخلايا خلايا سرطان الجلد B16F1 ، وسرطان الثدي MDA - MB - 435 ، وخلايا سرطان القولون في HCT116 DMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ والبنسلين / الستربتوميسين (جميع من Invitrogen : إعداد الخلايا السرطانية والخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة ). وكانت الخلية البطانية مثقف خط خلايا بطانة الاوعية الدموية الدقيقة (HMVECs) في EBM2 المتوسطة (Lonza) تستكمل مع هيدروكورتيزون ميكروغرام / 1 مل و 1 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة ، و 10 ٪ FBS والبنسلين / الستربتوميسين. وكانت تغسل مع الخلايا ثلاث مرات منفصلة مع برنامج تلفزيوني و0.05 ٪ التربسين / EDTA (Invitrogen). بعد الطرد المركزي مع 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، وكانت الخلية الكريات غسلها مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني. ثم تم فرز الخلايا مكعبات مع عدادة الكريات.
2. Matrigel إعداد : حدث قسامة من النمو وانخفاض عامل تحسنت Matrigel دينار بحريني (العلوم البيولوجية) حتى في درجة حرارة الغرفة. قبل إذابة تماما ، ونقلت على الجليد وكان يحتفظ السائل على الثلج لمدة لا تقل عن 10 دقيقة. ثم كان مطلي 50 ميكرولتر من Matrigel إلى 96 - جيدا لوحات على المستوى الأفقي الذي يسمح لتوزيع Matrigel بالتساوي ، وحضنت لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. تشكيل أنبوب : خلايا كانت (1-2 × 10 ⁴⁾ إعادة العالقة مع المصل خالية DMEM عن الخلايا السرطانية أو EBM - 2 لخلايا بطانة الأوعية الدموية ، وتحميلها على الجزء العلوي من Matrigel. إذا تم استخدام هذا الاختبار لقياس تأثير بعض العوامل على التنمية أنبوبية ، وأضيفت هذه العوامل (محفزات أو مثبطات) إلى المتوسطة المصل الحرة. يرد كل مجموعة الشرطي 4-6 الآبار.
4. الصور وتحليل البيانات : في الحضانة وبعد 37 درجة مئوية خلال الليل ، تم تحليل كل بئر مباشرة تحت المجهر. إذا كانت هناك حاجة لتثبيت الأنابيب ، وأضيف بلطف 100 ميكرولتر من 10 ٪ محلول ملحي المستندة الفورمالين وعشر دقائق في وقت لاحق ، انها مستعدة لتحليلها. تحت المجهر مع النقيض من المرحلة 10X ، تم تصوير الأنابيب في كل حقل ، وكان يحسب بمتوسط ​​نبيبات 3-5 حقول عشوائية في كل بئر.

2. ممثل النتائج :

واستخدمت HMVECs كعنصر تحكم إيجابية ، حيث وضعت هذه الأنابيب واضحة من أجسام الخلايا التي تربط ممدود لتشكيل شبكة مضلع. B16F1 ، U87 ، ونجمة داود الحمراء ميغابايت 435 الخلايا المتقدمة نبيبات الأوعية الدموية مشابهة لتلك التي شكلتها HMVECs ، ولكن لم HCT116 الخلايا (الشكل 1). تم اختبار أنبوب تشكيل خلية تعتمد على الجرعة في U87 الخلايا. شكلت خلايا 10000 كما هو موضح في الشكل 2 ، نبيبات وقفها. مرة واحدة وتضاعف الخلايا ، وشبكة الأوعية الدموية صلبة مماثلة لتلك التي ظهرت في HMVECs. في المقابل ، فشل الخلايا أقل من 5000 لتشكيل النمط الظاهري في الأوعية الدموية.

الشكل 1. الأنبوبة الناجم عن تشكيل HMVECs ، U87 ، MDA - MB - 435 ، وخلايا B16F1 ، ولكن لا تم تحميلها HCT116 خلايا جميع الخلايا (2 × 10 ⁴⁾ على Matrigel وحضنت بين عشية وضحاها. وكانت المصورة باستخدام الأنابيب النقيض المرحلة. واستخدمت HMVECs كعنصر تحكم إيجابية. وعرضت ممثلة 3-5 المجالات. شريط : 100 ميكرومتر.

واستخدمت الشكل 2. U87 الخلية التي يسببها نبيبات في عدد الخلايا التي تعتمد على الطريقة. أعداد مختلفة من الخلايا U87 كما هو مبين في زوايا لتشكيل الأنبوب. كانت تستخدم لمراقبة HMVECs إيجابية. شريط : 100 ملم.

Discussion

من أجل هذا الاختبار أن تنجح ، يجب اختبار نوعية Matrigel الأولى. ويمكن الحصول على عينة صغيرة من العلوم البيولوجية دينار بحريني إلى ما قبل تشغيل الفحص باستخدام HMVECs. قد منتجات مختلفة دفعة عرض الصفات التي تختلف بعض الكثير لا توفر شرط الأمثل لتشكيل الأنبوب. ثانيا ، ينبغي تجنب ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
عامل نمو مخفض Matrigel	العلوم البيولوجية دينار بحريني	47743-720
EBM2 طقم	Lonza	CC - 3156
نيكون المجهر ECLIPSE TS100	نيكون