داخل النخاع زرع الخلايا لاستهداف القرن بطني عنق الرحم في التصلب الجانبي وصدمة إصابة النخاع الشوكي

Summary

العصبية زرع السلائف هي استراتيجية واعدة لحماية و / أو استبدال / عنق الرحم المختلة وظيفيا فقدت الخلايا العصبية الحركية في الحجابي إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) ، واضطراب في الخلايا العصبية الحركية ، التصلب الضموري الخطوط الفرعية (ALS). ونحن نقدم على بروتوكول لتسليم خلية لعنق الرحم القرن بطني الحبل الشوكي في القوارض نماذج من المرض واصابات النخاع الشوكي.

Abstract

حل وسط في التنفس بسبب فقدان الخلايا العصبية الحركية الحجابي هو نتيجة المنهكة لنسبة كبيرة من البشر صدمة إصابة الحبل الشوكي (SCI) ⁽¹⁾ والحالات هو السبب الأساسي للوفاة في المرضى الذين يعانون من اضطراب الخلايا العصبية الحركية ، التصلب الضموري الخطوط الفرعية (ALS) ^2.

ALS هو اضطراب عصبي المدمرة التي تتميز تنكس السريع نسبيا من الخلايا العصبية العليا والسفلى المحركات. المرضى الخضوع في النهاية إلى المرض في المتوسط ​​2-5 سنوات بعد تشخيص بسبب شلل الجهاز التنفسي بسبب فقدان الخلايا العصبية innnervation الحجابي المحرك للحجاب ^3. الغالبية العظمى من الحالات المتفرقة ، في حين أن 10 ٪ منهم من النموذج العائلي. ويرتبط ما يقرب من عشرين في المئة من الحالات العائلية إلى حدوث طفرات نقطة مختلفة في الجينات النحاس / الزنك الفائق ديسموتاز 1 (SOD1) على الصبغي 21 ^4. وقد ولدت الفئران المعدلة وراثيا والفئران ^{6 4،5} تحمل جينات طافرة SOD1 الإنسان ^{(G93A ، G37R ، G86R ، G85R)} ، وبالرغم من وجود نماذج حيوانية أخرى من فقدان الخلايا العصبية الحركية ، في الوقت الحاضر أكثر النماذج المستخدمة للغاية من هذا المرض .

اصابات الحبل الشوكي (SCI) هي مجموعة غير متجانسة من الظروف الناتجة عن الإصابات البدنية إلى الحبل الشوكي ، مع نتائج وظيفية مختلفة وفقا لنوعها وموقعها وشدة إصابة ^7. ومع ذلك ، ما يقرب من نصف حالات اصابات النخاع الشوكي الإنسان تؤثر على مناطق عنق الرحم ، مما أدى إلى ضعف الجهاز التنفسي المنهكة بسبب فقدان الخلايا العصبية الحركية الحجابي وإصابة الجهاز التنفسي البصلي تنازلي المحاوير ^1. وقد تم تطوير عدد من النماذج الحيوانية لاصابات النخاع الشوكي ، والأكثر شيوعا وسريريا ذات الصلة ، كونها كدمة ^8.

زرع فئات مختلفة من الخلايا العصبية السلائف (الشخصيات) هي استراتيجية واعدة العلاجية لعلاج إصابات الجهاز العصبي المركزي وتنكس عصبي الصدمة ، بما في ذلك المرض واصابات النخاع الشوكي ، وذلك بسبب القدرة العصبية لتحل محل فقدان أو اختلال الجهاز العصبي المركزي توفير أنواع الخلايا ، وتوفير عوامل الجينات الفائدة ^9.

يمكن أن النماذج الحيوانية على حد سواء والمرض اصابات النخاع الشوكي النموذج العديد من الجوانب ذات الصلة سريريا من هذه الأمراض ، بما في ذلك فقدان الخلايا العصبية الحركية الحجابي ويترتب على ذلك من تنازلات التنفسي ^10،11. من أجل تقييم فعالية للمجلس الوطنى القائم على استراتيجيات على وظيفة الجهاز التنفسي في هذه النماذج الحيوانية من المرض واصابات النخاع الشوكي ، لا بد من تدخلات الخلوية موجهة خصيصا لأهداف علاجية المناطق التي تحتوي على ذات الصلة ، مثل الخلايا العصبية الحركية الحجابية. ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لزرع متعددة داخل النخاع قطعي من الشخصيات في عنق الرحم المسألة بطني الحبل الشوكي الرمادي نماذج الاعصاب مثل الفئران والجرذان ^G93A SOD1 ، فضلا عن الجرذان الحبل الشوكي المصاب والفئران ^11.

Protocol

طرق

1. خلية التحضير

كمثال ، سنقوم بشرح الإجراء لإعداد الخلايا الدبقية السلف ⁽¹²⁾ لزرع بسبب تجربتنا مع هذا النوع من الخلايا. ومع ذلك ، فإن تفاصيل البروتوكول ، بما في ذلك استخدام والمتوسطة والتربسين على سبيل المثال ، تعتمد على نوع من الخلايا خاصة تستخدم لزرع الأعضاء.

1. قبل كل الحلول الدافئة إلى 37.0 درجة مئوية في حمام مائي.
2. شطف 2X مع HBSS القارورة. إضافة 5.0 mL/T-75 قارورة من 0.05 ٪ التربسين / EDTA. احتضان قارورة لمدة 3 دقائق في الحاضنة 37.0 درجة مئوية. متمزج 3X برفق في قارورة مع 5 أو ماصة 10ML.

اختياري : إضافة 5.0 ملغ mL/T-75 قارورة من 1.0 / مل مثبط التربسين في فول الصويا DMEM/F12.

3. شطف كل قارورة 2X في 5.0 مل من المتوسط. تجمع الخلايا ويشطف. تبقي الخلايا على الجليد لجميع الخطوات اللاحقة.
4. تدور 200-300 ز لمدة 5 دقائق في أنابيب مخروطية : يفضل في أجهزة الطرد المركزي يتم تبريده الى 4 درجات مئوية. صب (وحفظ) طاف. اعادة تعليق الخلايا في 1.0 مل من المتوسط ​​، ونقل إلى 1.5 مل أنبوب إيبندورف.
5. عدد الخلايا التي تحتوي على عدادة الكريات به التريبان الأزرق لتحديد جدوى.
6. تدور مرة أخرى في أنبوب 1.5 مل (800 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة : يفضل في أجهزة الطرد المركزي تبريده إلى 4 درجات مئوية). صب (وحفظ) طاف.
7. اعادة تعليق الخلايا في الحجم النهائي المطلوب من متوسطة الكثافة المناسبة لتحقيق الخلية.
8. توزيع المعلقات الخلية إلى عدة أنابيب 1.5 مل إيبندورف. تبقي الخلايا على الجليد الرطب حتى الزرع.

لا تستخدم أنابيب 0.75 مل ، والحقنة هاميلتون / الإبرة لا يمكن احتواء عميقا في هذا الأنبوب. ومن المرجح أن يتم حقن متعددة خلال جلسات عملية جراحية ، واحدة تريد تجنب تعكير أنبوب نفس الخلايا مرات عديدة. في محاولة لإعداد حجم لا يقل عن 50 ٪ أكثر من تعليق الخلية مما هو مطلوب. تبقي الخلايا على الجليد طوال الدورة لعملية جراحية. زرع الخلايا في غضون 4-5 ساعات من إعداد المعلقات الخلية من أجل ضمان بقاء أكبر من الخلايا بعد زرعها.

2. التحضير قبل الجراحة

1. إجراء التقييمات ذات الصلة السلوك الأساسية قبل الجراحة.
2. المناعي قمع : تحت الجلد السيكلوسبورين A (CSA : 10،0 ملغم / كغم من وزن الجسم) أو داخل الصفاق (IP) FK-506/Rapamycin (1.0 ملغم / كغم من وزن الجسم) يجب أن تبدأ على الأقل 3 أيام قبل الزرع ، وينبغي أن يكون تعطى يوميا حتى التضحية. لا ينصح الإدارة في مياه الشرب (بدلا من الحقن اليومية). وكالة الفضاء الكندية ومناعة لدينا من خيار عند زرع الخلايا المشتقة من القوارض ، في حين FK-506/Rapamycin هو خيارنا عند زرع الإنسان المستمدة من الخلايا.
3. الأوتوكلاف الأدوات الجراحية قبل الجراحة. إعداد مكان أنيق ونظيف للقيام الجراحة ، فضلا عن مكان مرتب لوضع الأدوات. ألف حبة تعقيم الزجاج مفيد أيضا. إبقاء جميع أدوات تنظيف (خاصة قراضة) أثناء الجراحة ، حيث أن هذا الإجراء سيجعل من الاسهل بكثير. أي المواد المستخدمة أثناء إجراء العمليات الجراحية يجب أن يكون عقيما.
4. يجب أن تمحى من الصكوك التي لا يمكن تعقيمها مثل المجهر الجراحي أسفل مع مطهر مناسب ومقابض تغطي بمواد معقمة (مثل الشاش) بحيث الجراح ، ارتدى قفازات مرة واحدة مع عقيمة ، لا يلوث له / لها القفازات.
5. يجب أن تغسل جراح / ها يديه بمطهر (فرك الكلورهكسيدين) قبل بدء الجراحة. وسوف يقوم الجراح ارتداء القفازات المعقمة ، قناع صغير ، وثوب نظيف.

3. الجراحة : إعداد وجراحة الحيوان

الحيوان الإعدادية :

1. وزن الحيوان ، وإدارة الجرعة المناسبة من التخدير : تخدير أو استنشاق Isofluorane الكوكتيل (تسليم عبر IP) من [ماليات آسيبرومازين (0.7 ملغ / كلغ) ، كيتامين (95 ملغ / كلغ) ، وزيلازين (10 ملغ / كلغ)].
2. إصبع قرصة و / أو استخدام منعكس الجفن (ملامسة الجفن العلوي مع القطن ذات الرؤوس قضيب لمراقبة وامض) لتحديد ما إذا كان الحيوان هو تخدير بشكل صحيح. ينبغي حماية القرنيات من خلال تطبيق مرهم المسيل للدموع اصطناعية قبل الجراحة.
3. حلق الشعر مرة أخرى مع الحلاقة الكهربائية (أي مرفق الحاجة). حلق من منقاري قليلا إلى آذان إلى منتصف ظهر الحيوان. حلق بشكل جيد ، وإزالة الشعر المقصوص من الجلد لمنع الوقوع في شق الشعر. وينبغي إجراء العمليات الجراحية الإعدادية بعيدا عن المنطقة حيث سيتم إجراء الجراحة لتجنب التلوث من موقع العمليات الجراحية مع الشعر طائشة.
4. نقع الشاش مع محلول مطهر Povidine اليود ، وتنطبق على الجلد فوق منطقة الحلق. يجب أن يكون موقع الجراحية نقيت مرتين على الأقل مع الحل Povidine - اليود ، والحرص على فرك من مركز للموقع في اتجاه المحيط. ويمكن بعد ذلك شطفها الموقع مع الكحول 70 ٪ أو فرك مبيد للجراثيم المخفف. يجب تغطية المنطقة مع الستائر العقيمة.
5. طوال عملية جراحية ، وسادة على استخدام التدفئة طق يوصى بشدة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان العادي. بالإضافة ، ينبغي رصد درجة حرارة الجسم. الحيوان مكان على شاش تدحرجت. لفأر بالغ ، ينبغي أن يكون الشاش توالت ~ 1.0 بوصة وسمك 6.0 بوصة ~ في الطول. هذا الشريط على متن منصة الجراحة بحيث لا يتحرك. الحيوان مكان على لوحة على مستوى الصدر / الكتف. يمد ذراعيه على وسادة ، والشريط أسلحتهم على متن الجراحة. الفكرة هي لدعم الحبل الشوكي عنق الرحم حتى تصل أنه من الأسهل للعمل طوال فترة الجراحة منذ تم العثور على الحبل عنق الرحم على عمق كبير تحت سطح الجلد.

الجراحة :

6. على التكبير أدنى المجهر (8 نستخدم التكبير خ) ، واستخدام شفرة المشرط لجعل شق خط الوسط. تمتد أفقيا مع الجلد ومن ناحية أخرى لجعل الجلد مشدود (الأمر الذي يجعل من السهل شق الجلد) ، وجعل شق من قاعدة الجمجمة إلى كتف. (انظر الشكل 1)
7. استخدام شفرة المشرط لإجراء شق طريق العضلات أكثر من 3 طبقات العمود الفقري. الضغط قليلا من العضلات (من الأفقي إلى وسطي) على كلا الجانبين مع جهة أخرى. تأكد من الضغط على ما يكفي من بحزم مع مشرط لقطع جميع طبقات العضلات مع أقل عدد ممكن من التخفيضات حتى شقوق العضلات لن تكون خشنة ، الأمر الذي يجعل خياطة في نهاية أسهل من الجراحة. ومع ذلك ، لا تضغط بقوة جدا لمنع خلق ضرر في الأنسجة الأعمق (العمود الفقري).
8. مع اثنين من تطبيقها ذات الرؤوس والقطن ، واستخدام الحركة لفصل التواء العضلات المغطي من العضلات paraspinal. يمكن للمرء أن يكون قوي هنا. لا قص أو المسيل للدموع ، وهذا سوف يسبب النزيف. والتواء الحركة مع ندف تطبيقها بشكل جيد في النسيج بعيدا دون التسبب في ضرر أو النزيف. إذا كان النزيف يحدث في أي مرحلة من مراحل عملية جراحية ، فمن الأفضل أن نكون صبورين. لا تحاول الاندفاع إلى الأمام مع الكثير من نزيف الدم لأن سوف يحجب رؤية الجراحي الميداني. ويمكن تطبيق الكي أو الضغط الخفيف على موقع النزف ، ولكن نجد أن الصبر هو أفضل. مع الممارسة ، ينبغي أن يكون هناك نزيف ضئيلة أو معدومة طوال هذه الجراحة.
9. سحب العضلات مع 4 الكامشات محلية الصنع (انظر الشكل 2). ويمكن إجراء هذه الكامشات من الدبابيس الورقية على شكل قوي في مبعاد (انظر الشكل 2 الشكل). هذه الأوتوكلاف قبل الجراحة. وينبغي توخي الحذر لفظة نهايات الكامشات لتجنب تلف الأنسجة. ربط السلسلة إلى ضام. وينبغي أن يكون التعرض مربع / مستطيل الشكل. ويمكن تحقيق هذا الشكل من خلال سحب إلى 4 الزوايا باستخدام الكامشات 4. سلسلة الشريط على متن بغية تأمين الكامشات (انظر الشكل 2). ويمكن أيضا المتاحة تجاريا الكامشات استخدامها ، لكننا نفضل عدم استخدام هذه. من الأهمية بمكان إنشاء حقل الجراحة جيدة من أجل أن نرى بوضوح في جميع أنحاء الجراحة. لا "عمياء" مواصلة السير.
10. paraspinal العضلات واضحة من السطح الظهري للعمود الفقري. للتعامل مع العضلات paraspinal على السطح الظهري للعمود الفقري ، وهناك 2 الاستراتيجيات المحتملة. لأول استراتيجية ، استخدم ملقط مسنن الجرذان ومقص الربيع متوسطة الحجم لإزالة العضلات paraspinal من السطح الظهري للفقرات. في محاولة لجعل التخفيضات قريبة جدا من العظام لفضح أفضل سطح العظم. إجراء تخفيضات موازية لسطح الفقرات ، ولكن لا خفض في السلك. عن النهج الثاني ، وجعل شق خط الوسط في شبه الشوكي العضلات ، وسحب أفقيا مع أصغر الكامشات. في النهج الثاني ، يمكن عندئذ أن تكون خياطة العضلات معا مرة أخرى بعد الجراحة.
11. تنظيف سطح العظم الفقري أيضا. استخدام مقراض (أهم أداة جراحية) لسحب العضلات بعيدا عن المستويات C4 ، C5 و C6 (انظر الشكل 3). هذا ، بالطبع ، يعتمد على مستويات العمود الفقري التي هي المستهدفة. أثناء استخدام مقراض بيد واحدة ، وتأمين العمود الفقري بأكمله عن طريق استيعاب العضلات خلال عملية C2 مع الجرذان ملقط مسنن في جهة أخرى. C2 هو عملية كبيرة منقاري في مجال الجراحة. C3 قليلا تحت العضلات كذلك. C4 ، C5 و C6 من السهل الوصول لأن لديهم القليل العضلات المغطي لها.
12. تبدأ من الثقب C5. مرة أخرى ، من خلال عقد تأمين مع C2 الجرذان ملقط مسنن. الاستيلاء على الصفيحة بأكمله (انظر الشكل : انتزاع بالقرب من خط الوسط) مع قراضة. قراضة الموقف بحيث يتعامد تماما أداة لمحور العمود الفقري. سحق ببطء الصفيحة. لا يدفع الى اسفل النخاع الشوكي ، وهذا سوف يسبب الضرر لأنسجة العمود الفقري. وسحق برفق قطعة من كسر العظام صعودا. ينبغي مقراض سحق قطعة بحيث يمكن للمرء أن تنسحب بسهولة بعيدا إزالته. إذا لا تزال تعلق قطعة من العظم لبقية الصفيحة ، لا الساحبة وهذا سوف يسبب النزيف والإصابة من الممكن الحبل الشوكي. وينبغي أن تكون نظيفة وقراضة حادة. يجب غسل الأدوات مثل مقراض / محو مع المالحة عقيمة ، والتي يمكن توفيرها في وعاء معقم (انظر الشكل 4).
    لافتتاح الأولي للالثقب ، وتحديد المواقع وperpen مقراضdicular إلى العمود الفقري هو الأفضل. ويمكن بعد هذه الخطوة الواجب اتباعها من خلال اتخاذ الصغيرة "يقضم" لتوسيع الثقب بإدراج مقراض بلطف تحت العظم مع ما يقرب من 30-60 درجة زاوية بالنسبة لسطح السلك.
13. توسيع الثقب لجميع C4 - C6 الصفائح. تجعل المرء فتح مستمرة في العظام في العمود الفقري على مدى ثلاثة مستويات. ويمكن تعديل حجم الثقب استنادا إلى الموقع المطلوب (ق) من الحقن داخل النخاع.
14. لا تمتد أفقيا الثقب بعيدا لأن هذا سوف يسبب النزيف. من أجل استهداف القرن البطني ، موقع الحقن الإنسي نسبيا ، ولذلك فمن الضروري توسيع الثقب أفقيا حتى الآن. (انظر الشكل 5)
15. زيادة التكبير إلى العاشر 15 ~
16. تنظيف قبالة النسيج الضام (والدم المجفف أمكن) على رأس الجافية مع ملقط # 5 الحاد / مستقيم. الفرق بين النسيج الضام ، والجافية الاحتياجات التي يمكن استخلاصها من ذوي الخبرة.
17. شق الجافية ، طبقة السحائي صعبة للغاية ، مع مقص صغير في الربيع أو microknife. جعل شق مواز لمحور وسطي العمود الفقري للتو إلى منطقة دخول rootlets الظهرية. هذا سوف يسمح احد لهدف القرن البطني. (انظر الشكل 6)
18. استخدام الحاد / مستقيم # 5 ملقط لانتزاع ورفع قليلا الجافية الخروج من الحبل الشوكي. لا قرصة / إصابة النخاع الشوكي. هذا يأخذ بعض الممارسة. جعل شقوق مع مقص الربيع microknife أو صغيرة جدا. لا تجرح الحبل الشوكي.
19. تمديد شق قليلا في منقاري - الذيلية المحور. والتوتر من الجافية منفصلة قليلا الجافية لإنشاء التعرض لطيفة من الحبل الشوكي.
20. جعل شقوق في جميع المواقع المناسبة لكل حقن المقصود. الجافية ومظهر ضبابية شفافة ، بينما السطح الحبل الشوكي أكثر إشراقا بيضاء اللون المظهر. وسوف يحتاج المرء أن يتعلم التمييز بين هذه إربا. فمن المستحسن عدم محاولة لحقن من خلال الجافية مع إبرة الحقن. والجافية صعبة ، بحيث سيكون من الصعب اختراق من خلال ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن من خلال ثقب الجافية تؤثر على مسار الإدراج الإبرة ، وسوف يؤثر بالتالي على تسليم المستهدفة تشريحيا من الخلايا.
21. حقن الخلايا ثنائية في 3 مستويات (6 مواقع الكل) لاستهداف منطقة كبيرة لتوسيع عنق الرحم. عدد وموقع (ق) من الحقن ، وبالطبع ، يعتمد على تجربة محددة.
22. بعد ثقب الجافية ، سوف أسكب السائل النخاعي. السطحية الجافة من الحبل السري والتعرض كامل مع الشاش أو القطن التطبيقية ذات الرؤوس.
23. للحقن الخلايا ، استخدم 10.0μL هاميلتون gastight RN المحاقن.
24. نعلق عيار 33 / 45 درجة ، مشطوف إبرة معدنية هاميلتون RN. وينبغي أن تكون الإبرة حادة. استخدام إبر حقن نفسه فقط 20 ~ (الإبرة وسيتم حقن أكثر وضوحا مع أقل). يمكن للمرء أيضا استخدام أنابيب زجاجية لسحب شعري الإبر. استخدام الايبوكسي لإرفاق سحبت طرف زجاج الى 26 عيار إبرة معدنية حادة هاملتون. تقليم الخارجي القطر تلميح إلى ميكرولتر 75،0-100،0 ~ (اعتمادا على قطر من الخلايا : واحد لا يريد أن يؤذي الخلايا أثناء عملية الحقن) باستخدام الميكروسكوب الجراحي وشريحة ميكرون. نحن نفضل الإبر المعدنية قياس 33.
25. وسوف تسقط من الخلايا تعليق بسهولة داخل أنبوب إيبندورف على الجليد. مباشرة قبل التحميل المحقنة الحقن ، اضغط بلطف حتى أنبوب خلايا تعود الى التعليق. لا نفض الغبار بشكل مكثف جدا حيث سيؤدي ذلك إلى إصابة الخلايا و / أو فقاعات القضية. بدلا من ذلك ، استخدم ماصة 20.0μL أنا بلطف لمزج الخلايا الماصة تعليق خلية واحدة فقط أو مرتين صعودا وهبوطا.
26. يكفي تعليق تحميل حجم الخلية فقط لموقع الحقن واحد. وسوف تسقط من الخلايا داخل المحقنة تعليق حقن إذا كان أحد خطط للقيام حقن متعددة. تأخذ الخلايا ببطء إلى حقنة لتجنب فقاعات و / أو تلف الخلايا. على وجه التحديد للخلايا الدبقية السلف التي نعمل معها في المختبر لدينا ، فإننا ضخ 2.0 ميكرولتر من تعليق خلية في التخفيف من 50،000-75،000 الخلايا في أكثر من 1.0 ميكرولتر 2-5 دقائق. لقد وجدنا أن 2uL/site لا يؤدي إلى تلف الأنسجة في الحبل الشوكي عنق الرحم. بدلا من ذلك ، فإن تجربتنا تشير إلى أن زيادة كبيرة في عدد الخلايا الموجودة في هذا المجلد (لا سيما إذا كانت أكبر في الحجم من أسلاف لنا الدبقية : 10.0 -20.0 ميكرومتر في القطر) قد يسبب ضررا لحمة الحبل الشوكي. قمنا بإجراء تجربة واسعة الجرعات خلية لتحديد الأرقام الأمثل لحقن الخلايا في كل موقع (على الأقل في الحبل الشوكي عنق الرحم سليمة). يجب تحديد معايير لنوع من الخلايا المحددة وحالة المرض.
27. يصطف حقنة / إبرة بالتوازي مع محور العمود الفقري لاستهداف المنطقة التشريحية صحيح المطلوب. الزاوية الإبرة يكفي فقط (حوالي 80 درجة بالنسبة إلى طاولة الجراحة) ليست عثرة رئيس نطاق العمليات الجراحية ، ولكن أقرب إلى 90 درجة ممكنة. أقل تلميح نحو السطح الظهري الحبل الشوكي باستخدام المجهر (انظر الشكل 7).
28. إبرة الهدف الإنسية لمجرد دخول زويشمال شرق rootlets الظهرية (انظر الشكل 8). لمس برفق سطح النخاع الشوكي مع غيض من الإبرة. خفض طفيف في الحبل الشوكي مع الإبرة. سحب الإبرة حتى النخاع الشوكي هو العودة إلى الوضع الطبيعي. سجل هذا الموقف باعتباره ض = 0.0 باستخدام المسطرة على micromanipulator.
    ملاحظة : نحن عادة لا استقرار العمود الفقري العنقي خلال حقن الحبل الشوكي. لدينا نظام استخدام مخدر ، وحركة صعود وأسفل الحبل الشوكي عنق الرحم بسبب التنفس ثقيلة لم تكن أبدا مسألة. ومع ذلك ، إذا الثقيلة في التنفس هي المشكلة ، يمكن استقرت في العمود الفقري باستخدام إطار تطويعه من قبل لقط بلطف والعظام المحيطة شبه العضلات الشوكي في مستويات C2 و C7 باستخدام الملقط المحورة ، والحرص على عدم سحق عظام العمود الفقري أو تجرح الحبل الشوكي الكامنة الأنسجة. إذا تنفس الحيوان يصبح ضحل أثناء الإجراء ، ينبغي توفير مزيد من الأدوية المخدرة. وينبغي أن توقف عملية جراحية حتى كانت الطائرة الجراحية التخدير إعادة تحقيقها قبل استئناف.
29. انخفاض طفيف إبرة في الحبل الشوكي. تأكد من أن ننظر في المجهر في حين نفعل ذلك. انخفاض الإبرة إلى عمق 1.5 ملم لاستهداف القرن البطني في الفئران البالغين. إبرة إلى عمق أقل من 0.75 ملم الى الهدف القرن البطني في فئران بالغة. (انظر الشكل 9). هذه الأرقام عمق هو ممثل الكبار (لا يقل عن 3 أشهر من العمر) من الإناث والذكور ، سبراغ داولي الفئران (250-450 جرام) وC57BL / 6 الفئران (20-35 غراما). بطبيعة الحال ، وعمق وموقف الأطراف تعتمد على منطقة محددة من الفائدة. لا يزعج نظام حقن / جراحة المجلس أو الجدول جراحة في حين يتم إدخال إبرة في النخاع الشوكي لتجنب تلف الأنسجة الشوكي.
30. الانتظار لمدة دقيقة (أطول حتى أفضل) بعد خفض الإبرة إلى العمق المطلوب قبل الحقن.
31. ضخ أكثر من 2.0 ميكرولتر 2-5 دقائق بمعدل ثابت باستخدام وحدة تحكم المضخة.
32. الانتظار لمدة دقيقة (أطول أفضل) بعد الحقن قبل إزالة الإبرة ببطء من الحبل الشوكي.
33. نظيف المحاقن مع dH2O بعد كل حقنة من أجل منع انسداد. رسم ببطء وطرد 3-5 مرات. لا يوجه الهواء إلى المحقنة.
34. العودة إلى أدنى التكبير (نفس المستخدمة في بداية لعملية جراحية : ~ × 8). مغلق خياطة الجافية باستخدام 9-0 خياطة ، ولكن هذا هو بالتأكيد ليست ضرورية. بل هو أيضا تحديا. نحن خياطة الجافية مغلقة في الماضي ، لكننا نجد أي اختلاف في سلوك الحيوان ، وبقاء أو زرع النخاع الشوكي الأنسجة عندما لا يتم إغلاق الجافية مع خياطة. ويمكن تغطية الجافية مع قطعة من المادة العازلة اقية الجل المعقم. ينبغي وضع هلام الرغوة مباشرة على الجزء العلوي من موقع شق الجافية. ومع ذلك ، فمن المهم أن تأخذ الرعاية في عدم سحب فجأة هذه القطعة من جلفوم الخروج من السطح من خلال الحبل الشوكي بعد تشريح التروية ، كما يمكن في بعض الأحيان جلفوم التقيد بإحكام على السطح في الحبل الشوكي.
35. اختياري : مغلق paraspinal خياطة العضلات مع خياطة 4-0.
36. ثلاث طبقات مغلقة خياطة العضلات المغطي في وقت واحد مع خياطة 4-0. خياطة العضلات في ثلاثة مواقع في محور منقاري - الذيلية (انظر الشكل 10).
37. مغلق الجلد التيلة مع 9.0 مم مقاطع الجرح (انظر الشكل 11). تشديد الدبابيس مع أصحاب إبرة لمنع الحيوانات من سحب قبالة المواد الغذائية قبل التئام الجروح كاملة. مساحة ما يقرب من المواد الغذائية 0.5cm إربا. لا تبالغ في تشديد مقاطع الجرح ، وهذا يمكن ان يؤدي الى الشفاء وضعاف نخر.
38. تطبيق Povidine - اليود محلول مطهر لمنطقة الجرح بشاش غارقة.
39. السماح لاسترداد الحيوان على وسادة دافئة تعميم الماء. تعطي شبه جلدي حقن محلول معقم لLactated رينغر (5.0 مل لالجرذ ، 0.5 مل للماوس) لعملية جراحية على الفور التالي. ويمكن أيضا متابعة حقن ستقدم إذا كان الحيوان يبدو المجففة و / أو فاتر. ويمكن استخدام العلاج بالمضادات الحيوية وقائية باستخدام 6.0mg/kg من سيفازولين ، ومع ذلك ، فإن تجربتنا تشير إلى أن هذا الإجراء لا يؤدي زرع في مرحلة ما بعد العمليات الجراحية العدوى إذا تم اتباع الأسلوب العقيم ويتم تعقيم كل الأدوات / اللوازم الجراحية. إذا ما اتبعت هذه الاحتياطات ، لا يشجع الادارة المضادات الحيوية.
40. تواصل وكالة الفضاء الكندية اليومية أو حتى FK-506/Rapamycin التضحية.
41. وينبغي لعملية جراحية بأكملها تستغرق أقل من 45 دقيقة ~ (مع مواقع الحقن 6). وإلا فإن الحيوان يبدأ في الاستيقاظ والتنفس بشكل أكبر ، الأمر الذي سيؤثر سلبا على الحقن في النخاع الشوكي.

المشاكل نصائح للمشاكل المرتبطة خطوات مختلفة من البروتوكول

عدم بقاء الخلية / الفقراء : وهذا هو الأرجح ليست قضية التقنية المرتبطة الحقن ، ولكن ربما يرجع ذلك إلى خصائص نوع من الخلايا وحقنها / أو إلى نظام immunesuppression. هذه القضايا تحتاج إلى أن تقيم تجريبيا على نوع الخلية والحيوان أساس نموذج معين. توافر عدد من النماذج الجرذان والفئران التي تعاني من نقص المناعةوتتوفر أيضا للتحايل على مشاكل مع immunesuppression ، ولكن هذه الحيوانات موجودة أيضا صعوبات مثل التكلفة ، والحاجة إلى الحفاظ على مستعمرة ، والحذر الإضافية اللازمة أثناء الجراحة ، والإسكان.

ولاحظ العجز الوظيفي بعد الجراحة : في تجربتنا ، ونحن لم يلاحظ حدوث أي عجز الوظيفية التالية هذا الإجراء عند المقدرة من خلال تدابير مثل forelimb hindlimb وقوة قبضة والعصب الحجابي / حجاب المركبات إمكانات عمل العضلات ، بل مع مواقع الحقن 6 ( من 2μL لكل منهما) في الحبل الشوكي عنق الرحم. تدمير الأنسجة كما لم تراع. الأسباب المحتملة لحدوث هذه المشاكل تشمل : عدم استخدام إبرة قياس المقترحة ، حقن كميات أكبر و / أو أرقام الخلية ، والضرر غير مقصود بسبب الثقب غير لائق ، عدم وجود حساسية في حين خفض الجافية (مثل الحبل مع معسر # 5 في ملقط) أو أثناء عملية إدخال الإبرة هاميلتون في الحبل الشوكي (استبدال إبرة مملة).

لم يتم العثور على خلايا المادة الرمادية في بطني : هذا يمكن أن يعزى إلى عدد من القضايا. إذا كان الحقن يفتقد هدف إعلامي أو أفقيا ، تأكد من صحيح حتى خط مواز مع نظام حقن محور من الحبل الشوكي ، وادخال الإبرة الإنسي عادل للدخول rootlets الظهرية. إذا كان الحقن يفتقد هدف أو ventrally ظهريا ، تأكد من الصفر الخاص ض محور القراءة عند رأس الإبرة هو مجرد لمس بالكاد السطح الظهري للحبل الشوكي ، واستخدام إبر هاملتون اقترح مع شطبة المناسب (أطول شطبة يمكن أن تؤثر على الاستهداف) ، أؤكد أن الحبل الشوكي لا ضغط عند إدخال الإبرة ، والعناية في قياس بالضبط عمق باستخدام micromanipulator ، واستخدام الحيوانات في نطاق الوزن المقترحة. تعديل وفقا لذلك الأسلوب الخاص بك إذا كنت ترغب فى حقن الخلايا باستمرار في موقع (الذي يتطلب تقييم النسيجية وتقنية التعديل اللاحق). إذا تم حقن متناثرة بشكل عشوائي في جميع مواقع الحقن الخاصة بك ، سوف تحتاج إلى ممارسة لتحسين الاتساق. إذا كانت الخلايا تميل الى أن تكون يقع معظمها في الجانب الظهري في النخاع الشوكي على طول مسار الإبرة ، والانتظار لفترة أطول قبل وبعد حقن الخلايا ، وتمديد حقن الفعلي على مدى فترة أطول من الزمن.

4. ممثل النتائج :

الماوس المستمدة تم زرع الخلايا الدبقية السلف (50،000 خلية / موقع) في القرن البطني للنخاع C4 مستوى الكبار في الفئران ^G93A SOD1. ويمكن تمييز الخلايا المزروعة الماوس المشتقة من النسيج الفئران المضيف عبر الكشف عن الأجسام المضادة مع الماوس محددة ، M2. هذه الصورة تظهر بقاء M2 ⁺ زرع الخلايا المشتقة في 1 الشهر بعد الزرع (انظر الشكل 12). مترجمة إلى الخلايا الرمادية المسألة بطني ، ولكن غاب عن موقع الحقن إعلامي القرن الوحشي بطني (موقع لمعظم الخلايا العصبية الحركية الحجابي : الرمز بواسطة خط منقط). ولم يلاحظ تشكيل كيسة عندما تم حقن الخلايا 50000 لكل موقع ، وليس ضعف السلوكية الناتجة عن إجراء الحقن. ومع ذلك ، وحقن من الأرقام أعلى بكثير من الخلايا (العدد الفعلي يختلف باختلاف نوع من الخلايا ، وينبغي تقييمها بشكل منهجي) ينتج الضرر في موقع الحقن وعلى طول مسار الإبرة (انظر الشكل رقم 13 : المناعية مع علامة نجمية ، GFAP) .

الشكل 1. شق الأولي من الجلد. التكبير في أدنى المجهر (8 نستخدم التكبير خ) ، واستخدام شفرة المشرط لإجراء شق خط الوسط. تمتد أفقيا مع الجلد ومن ناحية أخرى لجعل الجلد مشدود (الأمر الذي يجعل من الاسهل لقطع الجلد) ، وجعل شق (الرمز بواسطة خط منقط سميكة) من قاعدة الجمجمة (على مستوى من الجزء الخلفي من الأذن) إلى الكتف (الرمز بواسطة خط منقط رقيقة).

الشكل 2. التعرض للمجال العمليات الجراحية. وينبغي أن يكون التعرض الجراحية مربع / مستطيل الشكل. ويمكن تحقيق هذا الشكل بواسطة سحب العضلات المحيطة نحو 4 الزوايا باستخدام الكامشات 4. سلسلة الشريط الذي هو تعلق على متن الكامشات الجراحية من أجل تأمين الكامشات وإبقاء المجال مفتوحا بشكل صحيح.

الشكل 2 - أقحم. وتستخدم الكامشات التعرض للمجال الجراحة. الكامشات على التراجع العضلات من أجل خلق حقل الجراحية مع كل من رؤية واضحة من الحبل الشوكي والمساحة الكافية لإجراء عمليات جراحية. ويمكن إجراء الكامشات الدبابيس الورقية من خلال وضع قوي في الشكل المطلوب وحجمه. الأوتوكلاف الكامشات قبل لعملية جراحية. ربط السلسلة إلى ضام.

شخصية3. فقرات. إزالة عقب paraspinal العضلات ، السطح الظهري نظيفة تماما من الفقرات مع قراضة. ويمكن رؤية الصفيحة الفردية ، فضلا عن دخول rootlets الظهرية من الجانب الوحشي من العمود الفقري.

الشكل 4. الثقب. ابدأ الثقب في الحبل الشوكي C5 المستوى. العمود الفقري من خلال عقد تأمين العضلات المغطي C2 المستوى مع ملقط مسنن الفئران. الاستيلاء على الصفيحة بأكمله (انظر الشكل : انتزاع بالقرب من خط الوسط) مع قراضة. قراضة الموقف بحيث يتعامد تماما أداة لمحور العمود الفقري. سحق ببطء الصفيحة. لا يدفع الى اسفل النخاع الشوكي ، وهذا سوف يسبب الضرر لأنسجة العمود الفقري. وسحق برفق قطعة من كسر العظام صعودا. ينبغي مقراض سحق قطعة بحيث يمكن للمرء أن تنسحب بسهولة بعيدا إزالته. إذا لا تزال تعلق قطعة من العظم لباقي الصفائح ، لا الساحبة وهذا سوف يسبب النزيف والإصابة من الممكن الحبل الشوكي. وينبغي أن تكون نظيفة وقراضة حادة.

الشكل 5. التعرض للنخاع النسيج الثقب التالية. توسيع الثقب لفضح كل من C4 - C6 الحبل الشوكي. جعل 1 فتح مستمر في العظام أكثر من 3 مستويات العمود الفقري. لا تمتد أفقيا الثقب بعيدا لأن هذا سوف يسبب النزيف. من أجل استهداف القرن البطني ، موقع الحقن الإنسي نسبيا ، ولذلك فمن الضروري توسيع الثقب إلى حد الوحشية كاملة من العظام الفقرية.

الشكل 6. ويمكن رؤية التكبير العالية من السطح الظهري للحبل الشوكي. البارز الأوعية الدموية الظهرية يهرول خط الوسط من الحبل الشوكي. وقد لوحظ هذا النمط الأوعية الدموية في معظم الحالات ، ولكن بعض الحيوانات عرض مسار غير خط الوسط من الأوعية الدموية. يمكن رؤية rootlets الظهرية في النواحي الجانبية لسطح الحبل الشوكي الظهري. بالنسبة إلى الجافية التي تغمر الحبل الشوكي ، وهذه الأعصاب لها مظهر ضبابي.

الشكل 7. الإعداد الحقن. الخط حتى حقنة / إبرة بالتوازي مع محور العمود الفقري لاستهداف المنطقة التشريحية صحيح المطلوب. الزاوية الإبرة يكفي فقط (حوالي 80 درجة بالنسبة إلى طاولة الجراحة) ليست عثرة رئيس نطاق العمليات الجراحية ، ولكن أقرب إلى 90 درجة ممكن (اللوحة اليسرى). الحافة السفلى حقن نحو السطح الظهري في النخاع الشوكي باستخدام المجهر (اللوحة اليمنى). لمس برفق سطح النخاع الشوكي مع غيض من الإبرة. خفض طفيف الحبل مع الإبرة. سحب الإبرة حتى النخاع الشوكي هو العودة إلى حالة شقة عادية. سجل هذا الموقف على النحو ض = 0.0 باستخدام المسطرة على micromanipulator.

الشكل 8. عالية التكبير من الحبل الشوكي حقن إبرة الهدف الإنسي فقط إلى منطقة دخول rootlets الظهرية (الرمز بواسطة خط منقط).

الرقم 9. رسم تخطيطي للنخاع : كيفية استهداف المنطقة التشريحية للمصلحة عند محاولة استهداف القرن البطني ، شق الجافية موازية لمحور وسطي فقط العمود الفقري لمنطقة دخول rootlets الظهرية. هذا سوف يسمح احد لهدف القرن البطني. انخفاض الإبرة إلى عمق 1.5 ملم لاستهداف القرن البطني في الفئران البالغين (سن وجنس الحيوان لا تجعل الكثير من الفرق في العمق). إبرة إلى عمق أقل من 0.75 ملم الى الهدف القرن البطني في فئران بالغة. بطبيعة الحال ، وعمق وموقف الأطراف تعتمد على منطقة محددة من الفائدة.

الرقم 10. إغلاق موقع الجراحية. خياطة ثلاث طبقات مغلقة المغطي العضلات في وقت واحد مع خياطة 4-0. خياطة العضلات في 3 مواقع في منقاري - الذيلية المحور.

الرقم 11. تدبيس من الجلد. الجلد التيلة مغلقة مع مقاطع الجرح 9.0 مم. تشديد الدبابيس مع أصحاب إبرة لمنع الحيوانات من سحب قبالة المواد الغذائية قبل التئام الجروح كاملة. مساحة ما يقرب من 0.5 مم الدبابيس إربا.

الرقم 12. وقد تم زرع زرع الأسلاف الدبقية في القرن البطني عنق الرحم. 50000 الماوس المستمدة من الخلايا الدبقية السلف في القرن البطني للنخاع C4 المستوى في الفئران ^G93A SOD1. نجا M2 + ماوس المستمدة من الخلايا التي تم زرعها في 1 الشهر بعد الزرع. مترجمة إلى الخلايا الرمادية المسألة بطني ، ولكن غاب عن موقع الحقن إعلامي القرن الوحشي بطني (الرمزبواسطة خط منقط).

الرقم 13. زرع أنسجة إصابة التالية من أعداد كبيرة من الخلايا العصبية السلائف. حقن أرقام أعلى بكثير من الخلايا (العدد الفعلي يختلف باختلاف نوع من الخلايا ، وينبغي تقييمها بشكل منهجي) ينتج الضرر في موقع الحقن وعلى طول مسار الإبرة.

Discussion

لدراسات شملت SOD1 الفئران والجرذان ^G93A والعمر والجنس المباراة الحيوانات ضمن مجموعة ، وتوزيع الحيوانات داخل القمامة نفسه إلى مجموعات مختلفة. فمن الأفضل استخدام جميع الحيوانات من جنس واحد لكل من المرض ونماذج اصابات النخاع الشوكي بسبب العمليات المرض قد تختلف بين ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
HBSS	Gibco	14170
0.05 ٪ التربسين	Gibco	25300
فول الصويا التربسين المانع (اختياري)	سيغما	T - 6522
آسيبرومازين ماليات (0.7 ملغ / كلغ)	Fermenta صحة الحيوان
الكيتامين (95 ملغ / كلغ)	حصن الصحة الحيوانية دودج
زيلازين (10 ملغ / كلغ)	باير
# 11 الريشة شفرة جراحية	الإلكترون المجهر العلوم	72044-11
القطن يميل تطبيقها (6 بوصة)	الصياد	23-400-101
الجرذان ملقط مسنن	أدوات العلوم غرامة	الجرذان : 11023-15 ؛ الماوس : 11042-08
مقص الربيع متوسطة الحجم	أدوات العلوم غرامة	15012-12
مقص صغير الربيع	أدوات العلوم غرامة	15000-10
مقراض	أدوات العلوم غرامة	الجرذان : 16121-14 ؛ الماوس : 16221-14
Microknife	أدوات العلوم غرامة	10056-12
أصحاب الإبرة	أدوات العلوم غرامة	12502-14
خياطة : 4-0	Vicryl	S - 183
الدبابيس : 9 ملم	Autoclip	427631
دباسة : 9 مم (# 203-1000 ريفلكس)	العالم آلات دقيقة	5000344
ضخ المياه الدافئة (T / مضخة)	Gaymar	P / N 07999-000
السيكلوسبورين A : 250.0 مل mg/5.0 أمبولات	نوفارتيس / Sandimmune	NDC 0078-0109-01
FK - 506	LC مختبرات	F - 4900
Rapamycin	LC مختبرات	R - 5000
محقن	العالم آلات دقيقة	UMP2
4 الصغرى المراقب مضخة Microsyringe	العالم آلات دقيقة	UMC4
Micromanipulator	العالم آلات دقيقة	طائرة ورقية - R
10.0 حقنة هاميلتون ميكرولتر	هاميلتون	80030
الإبر هاملتون : 33 عيار ، 45 شطبة ° ، 1 بوصة	هاميلتون	7803-05
20.0 الزجاج الماصات microcapillary ميكرولتر (اختياري)	كيمبل	71900-20