العزلة وتوصيف هويشت منخفضة CD45 السلبية ماوس خلايا الرئة الجذعية الوسيطة

Summary

في هذا المقال أن نبرهن عزلة الفئران خلايا الرئة المقيمين الجذعية الوسيطة (MSC الرئة) ، توسعها ، وتوصيف وتحليل الخصائص المناعية.

Abstract

أنسجة الخلايا الجذعية الوسيطة المقيمين (MSC) ومنظمات هامة لاصلاح الانسجة أو التجديد ، والتليف ، والتهاب الأوعية الدموية ، وتشكيل الأورام. معا هذه الدراسات تشير إلى أن المقيمين MSC الرئة تلعب دورا خلال توازن النسيج الرئوي ، وإصلاح الضرر خلال الأمراض مثل التليف الرئوي (PF) وارتفاع ضغط الدم الشرياني (PAH). نحن هنا وصف التكنولوجيا لتعريف السكان المقيمين للجنة السلامة البحرية الرئة. تعريف هذه الفئة من السكان في الأنسجة الرئوية فيفو به تحديد وضع علامات يسهل عزل المتكررة من السكان الخلايا الجذعية جيدا يتميز التدفق الخلوي ودراسة نوع خلية معينة والوظيفة.

Protocol

1. عزل الرئة

1. التضحية الفئران البالغين (8-10 أسابيع في العمر ؛ 18-20 ز ؛ C57Bl6J) مع الفئران جرعة زائدة من isoflurane تليها استنزاف باستخدام تقنية معقمة. وسوف ملامح تختلف قليلا بين السلالات.
2. إزالة جراحيا الحجاب الحاجز ، وفتح تجويف الصدر عن طريق قطع القفص الصدري أفقيا على كل جانب من الماوس. تدفق الدم من الرئتين بواسطة perfusing البطين الأيمن في القلب برفق باستخدام 3 - 5mls من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
3. تشريح فصوص الرئة إزالة القصبات القصبة الهوائية والكبيرة ووضعها في طبق بتري مليئة هانكس مخزنة المالحة (HBSS). وتستخدم مجموعة التالية من فصوص الرئة جميع ملقط لوضع النسيج على غطاء الطبق. هو المفروم ثم الأنسجة إلى قطع صغيرة باستخدام المشارط مع السائل القابل للتصرف بما يكفي لإبقائها رطبة ولكن ليس كثيرا ، بحيث تطفو والتحرك.
4. تشريح hindlimb واحد من الفئران وعزل نخاع العظم لاستخدامه كقاعدة تحكم تلطيخ لتعيين فلوث الخلوي البوابات. وصمة عار في نخاع العظم (BM) كما هو موضح سابقا ^1.

2. إعداد تعليق خلية واحدة من أنسجة الرئة

1. هضم كل الرئة باستخدام الأنسجة الوزن الأمثل لنسبة حجم 0.2g : 5mls السابق للحرارة بنسبة 0.2 ٪ ورثينجتون كولاجيناز من النوع 2 (الكيميائية الحيوية ورثينجتون ، ليكوود ، نيو جيرسي ؛ القط # LS004202) الذائب في HBSS العقيمة. هي مغمورة الخليط في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ^2،3.
2. متمزج العينة جيدا حتى هضم أنسجة الرئة تدفقات بسهولة من خلال ماصة 10ML (حوالي 10 التكرار). لاحتضان 15 دقيقة اضافية في 37 درجة مئوية لإكمال هضم الأنسجة ويضمن المزيد من التعليق خلية واحدة موحدة.
3. تمييع تعليق خلية سرطان الرئة مع HBSS ومتمزج مع ماصة 5ml لتفريق شظايا الأنسجة المتبقية.
4. تعليق تصفية باستخدام مصفاة الخلية 70μM لإزالة شظايا الأنسجة عسر الهضم. ويمكن تقسيم العينة إلى multiplه أنابيب مخروطية عند هذه النقطة لمنع الحمولة الزائدة one مصفاة الخلية وتقليل الوقت.
5. بيليه تعليق خلية لمدة 10 دقيقة عند 1500 دورة في الدقيقة و صب لطاف.
6. Resuspend الخلية بيليه بلطف باستخدام درجة حرارة الغرفة العازلة تحلل RBC (eBiosciences ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، 00-4333-57 القط #) ، واحتضان على RT لمدة 5 دقائق. إضافة حجم مساو من HBSS لإبطال نشاط العازلة تحلل وتصفية التعليق الخلية باستخدام مصفاة الخلية 40μM لإزالة الأنقاض والركام الخلية.
7. ماصة 10μl لكل عينة لتكون ملطخة وعدد أرقام الهواتف المحمولة على حد سواء لالرئة وعينات BM باستخدام عدادة الكريات. ملاحظة : سجل إجمالي حجم الخلايا.
8. بيليه تعليق خلية واحدة من خلايا الرئة بواسطة الطرد المركزي عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة.
9. Resuspend كلا الرئة والخلايا في الخلايا BM 1x10 ⁶ / مل في prewarmed (37 درجة مئوية) DMEM + (Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة والجلوكوز المرتفعة (Gibco ، كارلسباد ، كاليفورنيا ؛ القط # 11965-092) التي تحتوي على 2 ٪ بوفي الجنينشمال شرق المصل (FBS) وHEPES 10MM.
10. إعداد محلول المخزون 1mg/ml من هويشت 33342 صبغ (سيغما كيميكال كومباني ، St.Louis ، MO ؛ القط # B2261) في مجال المياه وتصفية تعقيم ^1،4. قد تكون مخزنة الصبغة هويشت كما aliquots في -80 درجة مئوية.
11. إضافة Hoescht 33342 إلى تركيز الصبغة النهائية 5μg/ml (أ 200X التخفيف من مخزون 1mg/ml) الى تعليق خلية واحدة.
12. مزيج من الخلايا عن طريق انقلاب بلطف واحتضان في المياه 37 درجة مئوية لمدة الحمام 90 دقيقة بالضبط.

3. تلطيخ وإعداد الرئة تعليق الخلية لتحليل التدفق الخلوي

1. بعد 90 دقيقة يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات مع خلايا الرئة هويشت الملون في 4 درجات مئوية أو على الجليد لمنع هروب رأس المال صباغة. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية ، وresuspend الخلايا في الجليد الباردة العازلة تلطيخ (PBS FBS +2 ٪).
2. Resuspend الخلايا بتركيز لا يزيد على ⁷ خلايا 1x10 / 300 باستخدام أنبوب من 600μl PBS تحتوي على 2 ٪FBS وHEPES 10MM.
3. إضافة tittered كاف CD45 الأجسام المضادة (عادة 1:200 التخفيف من APC - CD45 دينار بحريني (Pharmingen ، سان دييغو ، كاليفورنيا ؛ القط # 559864) إلى الرئة وعينات BM احتضان على الجليد لمدة 10-15 دقيقة بما في ذلك السيطرة غير ملوثين خلال. الإجراء التجريبي مفيد لضبط بوابات التحليل.
4. بيليه الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة. صب الخلايا وطاف resuspend في 500 ميكرولتر من تلطيخ عازلة مبردة (PBS FBS +2 ٪). نقل إلى prechilled أنابيب البولي بروبلين المفاجئة الغطاء (Fisherbrand ، شومبرغ ، IL ؛ القط # 14-956 - 1D).
5. إضافة يوديد propidium (PI ، 200μg/ml الأسهم في برنامج تلفزيوني) على عينات للتركيز النهائي من 2μg/ml استبعاد الخلايا الميتة. يجب أن تستخدم في تركيبة مع PI الصبغة 33342 هويشت لتحقيق الوضع الصحيح مضان على تحليل تدفق cytometric.
6. أنابيب تخزين على الجليد ، ومحمية من الضوء حتى تحليل التدفق الخلوي.

4. تحليل التدفق الخلوي لتحديد وعزلالخلية الجذعية الوسيطة الرئة (الرئة MSC) السكان الذين يستخدمون صبغ هويشت الدفق للكشف عن الجانب السكاني (SP)

1. هذا الاختبار لديه صك متطلبات التالية :
• 488 نانومتر أشعة الليزر والأشعة فوق البنفسجية (350-355 نانومتر)
• 2 كشف على طريق الليزر الأشعة فوق البنفسجية مع الأزرق (450/65) والمرشحات الحمراء (675/50).
• يجب أن يكون أحمر فوق البنفسجية للكشف عن حساسية عالية للإشارة الحمراء. هذا قد يكون مشكلة مع المسنين فارزات الخلية.
• وحدة التبريد للحفاظ على عينة في 50-10 درجة مئوية.
2. محاذاة الليزر وانشاء خلية للفرز بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
3. جمع الحمراء (محور س) والأزرق (المحور الصادي) إشارات هويشت باستخدام مقياس خطي.
4. ضبط الفولتية أنبوب مضخم لوضع G0/G1 الذروة في الجزء العلوي الأيمن من المركز على قطعة أرض للسماح للعرض كاف من السكان الجانب زائدة. قد يكون جزء من مرحلة - S و G2 الكاملة للدورة الخلية تكون خارج النطاق على اليمين العلوي من هذه المؤامرة. الأزرق سيجنال مشرق نسبيا في حين أن الإشارة الحمراء الخافتة. نموذجي MoFlo XDP (بيكمان كولتر ، ميامي ، فلوريدا) هي 425 فولت للزرقاء و 650 للأحمر.
5. الخلايا الميتة هي بوابات الخروج به PI. ويمكن استخدام المسار PI القياسية (488nm الإثارة ، والانبعاثات 630nm). بدلا من ذلك ، هو متحمس أيضا PI بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية والسكان خلية ميتة تقع قبالة النطاق على الجانب الأيمن من السكان الجانب (SP) المؤامرة. هذا يخفف من الحاجة إلى تعويض من أي إشارة PI fluorochromes أخرى مثل FITC وPE. يتبع الأسلوب Goodell الأصلي الإجراءات الأخيرة ^5-7.
6. الحفاظ على فارق الضغط المنخفض نسبيا خلال التحليل والفرز لضمان القرار مشددة من جانب السكان.
7. ليرة سورية كما يبدو ذراع الجانب بعيدا عن السكان الرئيسية للخلايا الرئة. ويطلق على هذه الفئة من السكان هويشت ^{منخفضة.}
8. ويتم تحليل ^انخفاض هويشت / ليرة سورية للفصل بين السكان CD45 الإيجابية والسلبية لاستعمال ^2،3 الرسم البياني (Figure 1).
9. قد التالية اختيار والمعزولة من السكان ^منخفضة هويشت ^NEG CD45 MSC الرئة يتم جمع الخلايا عن طريق الفرز السكاني وإما مختلطة في أنبوب واحد أو خلايا لعزل الحيوانات المستنسخة في لوحة 96 - ³ بشكل جيد.
10. ليتم ضبط لوحة فرز انحراف تيار الفرز إلى 25 ٪ لخلق تيار من النوع الرأسي من تلك المستخدمة عادة لفرز الأنبوب.
11. هدف تيار الفرز عن طريق إرسال نبضة تيار الاختبار على العلوية اليسرى ثم اليمنى السفلى جيدا لوحة 96 - جيدا.
12. تعيين لوحة خريطة البرمجيات فارز لإيداع العدد المطلوب من الخلايا في كل بئر.
13. لعزل الحيوانات المستنسخة خلية واحدة يتم فرز a MSC الرئة واحدة في البئر لوحة 96 - جيدا في وسائل الإعلام 150μl الثقافة (α - MEM تستكمل مع FBS 20 ٪). بعد الفرز يتم إضافة 100μl إضافية من المتوسط.

5. العزلة والثقافة وتوصيف للجنة السلامة البحرية الرئة والمستنسخون

1. الثقافةه وتوسيع الرئة المختلطة السكان MSC واستنساخ خلية واحدة بعد فرز مطابقة شروط استخدام الثقافة القياسية (37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO ₂ و> الرطوبة 95 ٪). ويسمح للخلايا التمسك العزلة التالية لمدة 16 ساعة. يتم استبدال وسائل الإعلام كل 48 ساعة (α - MEM تستكمل مع FBS 20 ٪). عندما تبدأ الخلايا تتكاثر بسرعة أكبر وتصل إلى ما بين 75-80 ٪ التقاء أنهم passaged (الشكل 2).
2. يتم شطف الخلايا مع HBSS prewarmed وحضنت مع 0.5 ٪ التربسين / EDTA (Cellgro ، ماناساس ، فرجينيا ؛ القط # 25-053 - CL) عند 37 درجة مئوية لمدة أقل من 2 دقيقة. ويتم رصد الخلايا باستخدام نطاق مقلوب لتأكيد ظهور التعليق الخلية.
3. ثم تنقسم الرئة جنة السلامة البحرية في نسب 01:02 أو 01:03 اعتمادا على معدل الانتشار الحالي للثقافة.
4. قدرة الرئة MSC للتمييز في الأنساب الوسيطة التقليدية لبناء العظم ، وخلية شحمية خلية غضروفية والتعبير عنها من علامات سطح الخلية الوسيطة قبوليق تقييمها لإعداد كل خلية. يتم أيضا تنفيذ التحليل الوراثي الخلوي النطاقات لتأكيد عدم وجود تشوهات صبغية ^2،3،8-11 الإجمالي.

6. تعداد MSC الرئة باستخدام الفحص تشكيل مستعمرة (كفو - F)

1. تمييع الخلايا في المتوسط ​​MesenCult متكاملة (تقنيات الخلايا الجذعية ، فانكوفر ، كولومبيا البريطانية) إلى تركيز النهائي من الخلايا 1x10 ⁶ / مل.
2. إجراء التخفيفات المتسلسلة لتحقيق تركيزات النهائي في طبق من الخلايا 100mm ⁴ 6x10 ، 3x10 ⁴ خلايا ، 1.5 X10 ⁴ الخلايا والخلايا 0.75 X10 ⁴ في 10ML وسائل الإعلام. وتجرى التحاليل في ثلاث نسخ مكررة أو لتركيز كل خلية ، ويمكن تحجيمها لمناطق أصغر السطح.
3. ثقافة الخلايا لمدة 10 أيام تحت الظروف القياسية. في يوم 10 من شطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني والثابتة باستخدام الميثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. كشف المستعمرات CFU - F التي تلطيخ مع ث / V 0.4 ٪ حل تلطيخ بالغيمزاالمخفف (سيغما كميكال ، وسانت لويس ، MO) 01:20 بماء منزوع الأيونات. تسمح عينات لتجف في الهواء وتحديد عدد المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 25 خلية لكل مستعمرة (الشكل 3).

7. تحليل خصائص المناعية للجنة السلامة البحرية في الرئة الخلايا التائية الانتشار وموت الخلايا المبرمج

1. ومطلي 6.25x10 MSC ⁴ خلايا الرئة لكل بئر في 96 - جيدا لوحات ، وسمح للوقوف ² بين عشية وضحاها.
2. CD4 ⁺ وتنقيتها من خلايا الطحال ر خلايا مستقبلات (TCR) الفئران المعدلة وراثيا ، OT - II مع خلايا تي التي تعترف 323-339 ovalbumin الببتيد ، من خلال استنفاد CD8 ⁺ ، CD19 ⁺ ، MHC - II ⁺ و ⁺ CD25 مع خلايا خلية AutoMACS Miltenyi فارز (Miltenyi ، صحراء ، كاليفورنيا). يتم عزل خلايا مقدمة للمستضد (APC) عن طريق الفرز إيجابيا MHC - II ^{+ 12} الخلايا.
3. يتم إصلاح APC في بارافورمالدهيد 4 ٪ ، وغسلها 3 مرات في برنامج تلفزيوني BSA/2mM EDTA / 5 ٪ ، ومحملة 0.5μg/ml أو 5μg / م ل OVA323 الببتيد.
4. وأضاف مقلد ، والنمو القبض APC لجنة السلامة البحرية في الرئة 96 - جيدا لوحات.
5. وصفت CD4 أكثر من 95 ٪ نقية + 1x10 ⁵ خلايا مع succinimidyl 5μM استر Carboxyfluorescein (CFSE ؛ سيغما ، St.Louis MO) في برنامج تلفزيوني والمحتضنة لمدة 5 دقائق في الظلام ، وغسلها مع جيش صرب البوسنة PBS - 5 ٪ ، وأضاف بعد ذلك إلى APC وخلايا الرئة في MSC FBS DMEM وسائل الإعلام 5 ٪. ثم يتم تحضين الخلايا لمدة 96 ساعة.
6. هي ملطخة ثم الخلايا التائية مع CD40 المناهضة للسامية (Cy5) ؛ CD4 (APC - Cy7) ؛ CD8 (ViolBlue) ؛ Vbeta 5 (PE) ويعاير باستخدام MacsQuant Miltenyi تدفق عداد الكريات قناة 7 (Miltenyi ، Aurburn ، كاليفورنيا) و FloJo تحليل البرمجيات (Treestar ، آشلاند ، أو). يقاس الانتشار والانخفاض في متوسط ​​كثافة الفلورسنت CFSE بالمقارنة مع الخلفية ، وخلايا T والمسمى مع CFSE لم يتعرضوا لآسيا والمحيط الهادئ (الشكل 4). يتم حساب الخلايا التائية في هذا الوقت والصلاحية المقررة مع استبعاد التريبان الأزرق.

8. ممثل النتائج :

"jove_content">
تحليل تدفق الرقم 1. cytometric وتعريف للجنة السلامة البحرية الرئة. هي ملطخة تعليق خلية واحدة من أنسجة الرئة هضم مع هويشت 33342 وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي للكشف عن الاختلافات في A. مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) و (ب). هويشت زرقاء وحمراء مضان. وجود مجموعة من السكان الجانب (SP) مرئيا في البوابة. ومن ثم تحليلها ^انخفاض هويشت SP لفصل C. CD45 السكان ^{السلبية} للجنة السلامة البحرية الرئة. وCD45 إيجابي على نسب السلبية ليرة سورية هي الرئة عادة 70:30 / 60:40.

الشكل 2. العزل والثقافة في لجنة السلامة البحرية الرئة. بعد جمع لجنة السلامة البحرية الرئة عن طريق الفرز الخلية ، ومطلي الخلايا في أطباق 30mm باستخدام α - MEM supplemented مع FBS 20 ٪. A. طازجة فرز الخلايا تبدو ضئيلة ، على مدار ومشرقة. باء. بعد حوالي 2-3 أسابيع المستعمرات مع النمط الظاهري الوسيطة تصبح واضحة والانتشار أكثر وضوحا.

الشكل 3. تعداد MSC بواسطة الفحص تشكيل مستعمرة - الليفية. ومطلي الموسع MSC الرئة في البروتوكول وصف للمقايسة CFU - F. ألف بعد 10 يوما ، والمستعمرات بالغيمزا صمة واضحة. المستعمرات باء كبيرة وتتكون من بضع مئات من الخلايا. جيم الخلايا عرض النمط الظاهري الوسيطة. A & B ، مقياس شريط = 0.5 سم ، C شريط مقياس = 0.14 سم.

الشكل 4. CFSE الخلايا التائية استنادا الفحص انتشار الأسلحة النووية. في غياب لجنة السلامة البحرية الرئة وجود antigeن تقديم الخلايا (APC) + / -- ovalbumin (OVA) CD40 ^{إيجابية} الخلايا التائية المستجيب يبرهن على وجود انخفاض في كثافة مما يدل على انتشار CFSE (دائرة حمراء). كثافة مضان CFSE للغشاء الخلية تي الانخفاضات stoichiometrically مع كل خلية من خلايا أي تقسيم. مع كل انقسام. في حضور لجنة السلامة البحرية الرئة ، APC + / -- OVA ، CD40 ^{إيجابية} الخلايا التائية المستجيب إثبات أي تغيير كبير في كثافة CFSE الذي يدل على عدم انتشار الأسلحة (دائرة حمراء).

Discussion

وقد تكيفت لدينا الطريقة التي استخدمت في البداية لتحديد الخلايا المكونة للدم BM لعزل السكان محددة للجنة السلامة البحرية الرئة المقيمين. نظرا لاستنساخ من العزلة ثم كانت تتميز هذه الخلايا وكذلك لجنة السلامة البحرية. وقد تم تحديد مصدرها والمقيمين في الرئة الماوس الكبار (في مقابل BM المشتقة) والتشكيل المظهري والجزيئي موثقة ^2. القدرة على عزل هذه الفئة من السكان مرارا تتميز يسمح للمزيد من الدراسة على أهمية بيولوجية ودور لجنة السلامة البحرية خلال توازن أنسجة الرئة والأمراض. تعريف الاخيرة من هذه الفئة من السكان في الجسم الحي في النسيج الرئوي والبشرية على حد سواء الفئران يسهل وضع استراتيجية علاجية تستهدف إنقاذ الخلايا الذاتية لتسهيل إصلاح الرئة خلال الاصابة والمرض.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	فهرس العدد	تعليق (اختياري)
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)	سيغما	P - 5368
مخزنة هانكس محلول ملحي (HBSS)	الحرارية العلمية	SH30588.01
0.2 ٪ من النوع 2 ورثينجتون كولاجيناز	الكيميائية الحيوية ورثينجتون	LS004202
خلايا الدم الحمراء تحلل العازلة	eBiosciences	00-4333-57
DMEM	Invitrogen Gibco	11965-092
هويشت 33342 صبغ	سيغما	B2261
CD45 - APC	Pharmingen دينار بحريني	559864
Propidium يوديد	سيغما	81845
A - MEM	الحرارية العلمية	SH30265.01	؛
FBS	Invitrogen	16000-069
0.5 ٪ التربسين / EDTA	Cellgro	25-053 - CL
إكمال MesenCult متوسطة	وقف سيل تكنولوجيز	05511
0.4 ٪ تلطيخ بالغيمزا ث / ت الحل	سيغما	GS1L
4 ٪ بارافورمالدهيد	خدمات الإلكترون المجهري	15710	غير المخفف paraformeldehyde 16 ٪ الى 4 ٪ باستخدام برنامج تلفزيوني
Carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE)	سيغما	21888