كشف وGenogrouping من Noroviruses من براز الأطفال وذلك في خطوة واحدة Taqman RT-PCR

Summary

وخطوة واحدة RT-PCR فحص للكشف وتحديد genogroup من العزلات نوروفيروس من براز الأطفال، والتي تستخدم الاشعال وتحقيقات TaqMan محددة لإطار القراءة المفتوح 1 (ORF1)-ORF2 منطقة تقاطع، وهي المنطقة الأكثر حفظها من الجينوم نوروفيروس هو وصفها. وترد تفاصيل وغير التجاري، واستخراج الحمض النووي الريبي طريقة فعالة من حيث التكلفة.

Abstract

Noroviruses (NoVs) هي السبب الرئيسي لتفشي التهاب المعدة والأمعاء الحاد متفرقة في جميع أنحاء العالم في البشر من جميع الأعمار. فهي سبب مهم من المستشفيات في الأطفال الذين يعانون من تأثير على الصحة العامة مماثلة لتلك التي من الفيروس العجلي. NoVs هي فيروسات الحمض النووي الريبي من التنوع الجيني الكبير، وهناك مظهر المستمر للسلالات جديدة. يتم التعرف على خمسة genogroups؛ GI وGII مع المورثات الخاصة بهم العديد من الأنواع الفرعية وأهمها لعدوى الإنسان. ومع ذلك، فإن تشخيص هذه المورثات 2 لا تزال مشكلة، وتأخير التشخيص والعلاج. ^{1، 2، 3}

لاستخراج الحمض النووي الريبي من عينات البراز الأسلوب الأكثر استخداما هو QIAmp عدة RNA الفيروسي التجارية من QIAGEN. هذا الأسلوب يجمع بين خصائص ملزم من السيليكا غشاء هلام، المخازن المؤقتة التي RNases مراقبة وتوفير الربط الأمثل من الحمض النووي الريبي إلى العمود مع سرعة microspin. هذه طريقة بسيطة وسريعة وموثوق بها وغير كار العبوات الناسفة في بعض الخطوات التي ترد تفاصيلها في الوصف المقدم من قبل الشركة المصنعة.

نوروفيروس هو الثاني فقط لفيروس الروتا هو السبب الأكثر شيوعا للإسهال. وينبغي تشخيص نوروفيروس تكون متاحة في جميع الدراسات حول التسبب في الإسهال، وكذلك في تفشي حالات الإسهال أو الفردية. في الوقت الحاضر يقتصر التشخيص لكن نوروفيروس إلى مراكز قليلة فقط نظرا لعدم وجود طرق بسيطة للتشخيص. هذا التشخيص والعلاج التأخير ^{1، 2، 3.} وبالإضافة إلى ذلك، وذلك بسبب تكاليف النقل والتنظيم من مخازن للتآكل داخل البلدان وبينها استخدام هذه المجموعات المصنعة يطرح مشاكل لوجستية. ونتيجة لذلك، في هذا البروتوكول وصفنا 1، اقتصادية بديلة، في منزل أسلوب الذي يقوم على أساس الطفرة الأصلي وآخرون. طريقة ⁽⁴⁾ الذي يستخدم خصائص الحمض النووي ملزم من جسيمات السيليكا جنبا إلى جنب مع خصائص مضادة للnuclease من ثيوسيانات guanidinium .

وقد وضعت "jove_content"> لكشف وgenogrouping (GI وGII) من العزلات NoVs من عينات البراز، عدة RT-PCR البروتوكولات التي تستخدم أهداف مختلفة. الإجماع هو أن RT-PCR باستخدام TaqMan كيمياء سيكون أفضل تقنية جزيئية للتشخيص، لأنه يجمع بين حساسية عالية، والنوعية، وإعادة الإنتاج مع إنتاجية عالية وسهولة الاستخدام. هنا نحن تصف فحص استهداف المفتوحة القراءة إطار 1 (ORF1) منطقة تقاطع ORF2، المنطقة الأكثر حفظها من الجينوم نوفمبر، وبالتالي الأكثر ملاءمة لتشخيص المرض. لمزيد من التحليل الجيني التقليدي RT-PCR الذي يستهدف متغير بدرجة كبيرة N-محطة قذيفة من بروتين رئيسي من ⁵ قفيصة (المنطقة ج) استخدام الاشعال ووصف في الأصل من قبل كوجيما وآخرون. وترد تفاصيل. التسلسل للمنتج PCR من PCR التقليدية تمكن من التفريق بين الأنماط الجينية التابعة لمعهد جوته وgenogroups GII.

Protocol

1. عينات البراز

1. يجب أن يتم تخزين عينات البراز المجمدة للحفاظ على الحمض النووي الريبي. لجعل التعليق 10٪ برازي، وتأخذ ما يقرب من 0.1 غ من عينة البراز إذابة وإكمال إلى 1 مل مع برنامج تلفزيوني.
2. قسامة في 200 ميكروليتر إلى تجنب تكرار التجميد والذوبان. تخزين aliquots في درجة مئوية -70
3. ذوبان الجليد وأجهزة الطرد المركزي aliquots في 4000 ز لمدة 10 دقيقة قبل استخدامها في استخراج.

2. إعداد جزيئات السيليكا لاستخراج مع جوانيداين والسيليكا

1. في RT، بتعليق 30 غراما من ثاني أكسيد السيليكون، واستكمال مع DH ₂ O ما يصل الى 250 مل.
2. بعد 24 ساعة من الترسيب، وإزالة 215 مل من طاف بواسطة الشفط. إضافة درهم ₂ O ما يصل الى 250 مل، ووقف بيليه السيليكا عن طريق اهتزاز.
3. بعد آخر ساعة 24، إزالة طاف بواسطة الشفط، وضبط درجة الحموضة لتعليق السيليكا إلى 2.0 درجة الحموضة، وذلك باستخدام حمض الهيدروكلوريك (HCL). قسامة تعليق السيليكا في بوت زجاجعدوليس والتعقيم.

3. إعداد L6 الاحتياطي لاستخراج مع جوانيداين والسيليكا

1. على RT، وإعداد L6 عازلة عن طريق إذابة 60 جم ​​من ثيوسيانات guanidinium (GuSCN) و 1.3 غرام من تريتون X-100 في 50 مل من 0.1 هيدروكلوريد تريس م، ودرجة الحموضة 6.4، و 11 مل من EDTA M 0.2، 8.0 درجة الحموضة حل.

4. إعداد مخزن L2 لاستخراج مع جوانيداين والسيليكا

1. على RT، وإعداد L2 عازلة عن طريق تذويب 180 غ من ثيوسيانات guanidinium (GuSCN) في 150 مل من 0،1 هيدروكلوريد تريس م، ودرجة الحموضة 6.4.

5. استخراج الداخلي

1. في كل استخراج عينة نوفمبر البراز إيجابي، ومراقبة إيجابية، وDEPC المياه المعالجة، ومراقبة سلبية، ينبغي أن تدرج.
2. في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة خلط ما يلي: 1 مل من عازلة L6، 20 ميكرولتر من جزيئات السيليكا، وإضافة 200 ميكرولتر من وقف استخراج البراز 10٪. لفترة وجيزة وتترك في دوامة RT لمدة 15 ميلن.
3. منبذة وقف عند 6000 جرام لمدة 10 ق، ويغسل بيليه مع 1ml من L2 العازلة مرتين، تليها اثنين من يغسل مع الايثانول 70٪ ومرة ​​واحدة مع الأسيتون. تجفيف بيليه في كتلة والتدفئة الجافة في 56 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. هيدرات الحمض النووي الريبي في بيليه السيليكا بإضافة 50 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية درهم ₂ 0. إضافة 1 ميكرولتر من RNasin، مزيج من أنبوب للقلب واحتضانها عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
5. الطرد المركزي ل3 دقائق بأقصى سرعة، في جهاز للطرد المركزي الطاولة، وجمع 40 ميكرولتر من طاف التي تحتوي على الحمض النووي الريبي.
6. قياس عينات من الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام Nanodrop 2000 طيفي (الحرارية العلمية). ثم تخزين في -70 درجة مئوية حتى استخدامها، تصل إلى 6 أشهر. (ملاحظة: وهناك طريقة أفضل للحفاظ على الحمض النووي الريبي مجموع سليمة يتم تحويلها إلى [كدنا]).

6. البديل عن طريق استخراج التجاري RNA الفيروسي RNA QIAamp كيت

تم العثور على تعليمات كاملة في سفر الأمثال كتيبided مع عدة QIAGEN. لفترة وجيزة هذا الإجراء هو على النحو التالي:

1. الماصة ميكرولتر 560 من AVL العازلة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الناقل في أنبوب 1.5 مل، وإضافة 140 ميكرولتر من تعليق البراز 10٪. مزيج من قبل vortexing النبض لمدة 15 ثانية. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
2. إضافة 560 ميليلتر من الإيثانول (96-100٪) في عينة ومزيج من قبل vortexing النبض لمدة 15 ثانية، ثم أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
3. تطبيق 630 ميكرولتر من هذا الحل إلى عمود دوران وضعت في أنبوب جمع 2 مل. الطرد المركزي ل1 دقيقة على 6000 غرام؛ ثم ضع عمود الدوران في أنبوب نظيف 2 مل.
4. غسل العمود الذي يحتوي الحمض النووي الريبي منضم مع 500 ميكرولتر من AW1 العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 6000 ز ل 1 دقيقة. عمود في مكان نظيف 2 أنبوب جمع مل.
5. غسل العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة AW2 والطرد المركزي بأقصى سرعة (20،000 دورة في الدقيقة أو ز 14000) لمدة 3 دقائق.
6. مكان عمود الدوران في نظيفة 1.5 أنبوب الطرد المركزي الصغيرة مل، إضافة 40 ميكرولتر DEPC المعالجة المياه وأزل الحمض النووي الريبي بأقصى سرعة. كرر علىم لمدة 80 ميكرولتر النهائي من الحمض النووي الريبي مزال.
7. قياس عينات من الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام Nanodrop 2000 طيفي (الحرارية العلمية). ثم تخزين في -70 درجة مئوية حتى استخدامها، تصل إلى 6 أشهر. (ملاحظة: وهناك طريقة أفضل للحفاظ على الحمض النووي الريبي مجموع سليمة يتم تحويلها إلى [كدنا]).

7. الكشف عن نوروفيروس في الحمض النووي الريبي المستخرج من خطوة واحدة في الوقت الحقيقي RT-PCR مع تحقيقات Taqman محددة

صك StepOnePlus الوقت الحقيقي PCR الأنظمة (النظم البيولوجية التطبيقية).

منهجية

1. مسح وتنظيف جميع أسطح العمل، الماصات، وأجهزة الطرد المركزي مع ريبونوكلياز بعيدا لإزالة أي تلوث محتمل ريبونوكلياز.
2. الماصة للGI نوفمبر وGII سيد فحص يمزج وفق الجدول رقم 1. وترد الاشعال وTaqman تحقيقات في الجدول رقم 2.
3. قسامة 10 ميكرولتر من مزيج سيد المناسبة لكل أنبوب رد فعل.
4. إضافة 5 ميكرولتر من عينة غير معروف غير مخففالحمض النووي الريبي، DEPC المياه المعالجة على السيطرة السلبية، أو GI على التوالي GII إيجابي سيطرة الجيش الملكي النيبالي، إلى آبار رد فعل المقابلة. يجب تشغيل جميع العينات في نسختين. وقدمت عناصر إيجابية والمعايير مع تركيز من 300 ميكروغرام / ميكروليتر و 500 ميكروغرام / ميكروليتر على التوالي من قبل مختبر المركز الوطني الفيروسة الكأسية لمكافحة الامراض والوقاية منها (CDC).
5. أجهزة الطرد المركزي لوحة رد فعل في 6000 جرام لمدة 10 ثانية.
6. في التجربة خصائص الشاشة؛ تحديد واختيار نوع من التجربة على المدى. تأكد يتم عرض الكواشف TaqMan كنوع الكواشف، وذلك قبل قراءة-PCR والتضخيم ويتم اختيار.
7. تشغيل 15 ميكرولتر ردود الفعل باستخدام الملف الحراري في الجدول رقم 3.
8. تحليل النتائج.

8. التنميط الجيني من GI نوفمبر وقسم الإعلام التقليدية باستخدام RT-PCR وتسلسلها

(هذا لا يذكر في هذا الفيديو منذ انها طريقة شائعة وتستخدم على نطاق واسع.)

التطبيقية الصك. StepOne النظم البيولوجية وStepOnePlus أنظمة الوقت الحقيقي PCR مع القالب Quantitec.

منهجية

1. قبل التنميط الجيني، يتم تحديد genogroup (GI أو GII) من العينات من قبل فحص RT-PCR المذكورة أعلاه. GI نوفمبر الحمض النووي الريبي لابد من تضخيم مع سيد GI مزيج التنميط الجيني والحمض النووي الريبي نوفمبر GII مع المزيج GII سيد التنميط الجيني.
2. الماصة للGI نوفمبر وGII سيد التنميط الجيني يمزج وفقا للجدول رقم 4. وترد الاشعال GI SKF / SKR و G2 SKF / SKR في الجدول 5.
3. قسامة 45 ميكرولتر من مزيج سيد المناسبة إلى 0.2 مل أنابيب رد فعل.
4. إضافة 5 ميكرولتر من DEPC المياه المعالجة إلى كل أنبوب سيطرة سلبية، و 5 ميكرولتر من نوفمبر، بعد فرزهم (GI و / أو GII) RNA إيجابية في أنبوب رد فعل المقابلة.
5. تشغيل 50 ميكرولتر ردود الفعل باستخدام الملف الحراري في الجدول 6.
6. إرسال PCR المنتجات contaiنينغ لا يقل عن 100 نانوغرام / ميكروليتر في المنطقة قفيصة إلى تضخيم Macrogen شركة لتنقية وتسلسلها. (9700 العظمى سينيكا هوي. روكفيل، دكتوراه في الطب 20850 و 10 دولار لكل عينة في التسلسل).

9. ممثل النتائج

ويوضح الشكل 1 نتائج ممثل من Taqman من خطوة واحدة RT-PCR عندما تستخدم لفحص الحمض النووي الريبي المستخرج من عينات البراز من الأطفال الإسهال. تم تعيين دورة عتبة (CT) لعينة ايجابية في أقل أو يساوي 37 لGI ط م ط م و 39 لقسم الإعلام. تم العثور على قيم ط م لعناصر ايجابية لتكون أقل من 27 و 18 من تقاطع ORF1-ORF2 لGI وقسم الإعلام، على التوالي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2 تظهر المقارنة رأسا لرأس القيم ط م من السيليكا في طريقة guanidinium وQiAmp عدة RNA الفيروسي. بيانات من كل من اختبارات تقع قريبة جدا من خط المساواة (= 1 ميل والتقاطع = 0). هذا ما يؤكده تحليل الانحدار ومعامل الارتباط. وجرى تقييم جميع عناصر سلبية وجدت لتكون 0 من جانب كل من الأساليب.

سيد ميكس	نهائي اضرب	حجم (ميكرولتر)
H 2 0 PCR		2،875
Quantitect RT-PCR ماستر ميكس	1X	6،250
RT ميكس	1X	0،125
50 ميكرومتر التمهيدي الترس R	1 ميكرومتر	0،250
50 F الترس ميكرومتر التمهيدي	1ميكرومتر	0،250
مسبار 10 حلقة ميكرومتر	1 ميكرومتر	0.125/0.250 *
		10.00

وقد استخدم * 0،250 ميكرولتر من كل مسبار لاختبار الجهاز الهضمي، في حين تم استخدام 0،125 ميكرولتر من كل مسبار لاختبار GII.

الجدول رقم 1. QIAGEN مزيج سيد Quantitect لفحص الجهاز الهضمي وقسم الإعلام (تروخيو وآخرون، 2006). ⁷

اسم	التوالد مجموعة	استخدم	تسلسل (5 'إلى 3')
لعب دورا مهما 1R	GI	كتاب تمهيدي	CTT AGA CAT CAT CAT CGC TYA C
لعب دورا مهما 1F	GI	كتاب تمهيدي	CGY البوابة الخضراء ATG CGN TTY CAT GA
لعب دورا مهما 2R	GII	كتاب تمهيدي	TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA
لعب دورا مهما 2F	GII	كتاب تمهيدي	CAR GAR BCN ATG TTY AGR البوابة الخضراء ATG AG
حلقة 1A	GI	مسبار	FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1
حلقة 1B	GI	مسبار	FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1
Ring2-TP	GII	مسبار	FAM-البوابة الخضراء GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1

الجدول 2. التمهيدي و[أليغنوكليوتيد] التحقيق المستخدمة في الوقت الحقيقي RT-PCR الكمي لأني genogroups، والثاني (كاجياما وآخرون،2003). ⁸

خطوة	درجة الحرارة (درجة مئوية)	الوقت (دقيقة)
1	50	30:00	[كدنا] تجميع
2	95	15:00	HotStart تفعيل طق بوليميريز
3	95	00:15
	60	01:00	45X دورات

جدول3. الملف الحرارية لخطوة واحدة Taqman في الوقت الحقيقي RT-PCR (تروخيو وآخرون، 2006). ⁷

سيد ميكس	نهائي اضرب	حجم (ميكرولتر)
H 2 0 PCR		29.50
5X QIAGEN RT-PCR الواق	1X	10.00
10 ميكس ملي dNTP	0.4 ملم	2.00
انزيم ميكس		2.00
يو 40 / ميكرولتر RNAsin	يو 20 / ميكرولتر	0.50
10 ميكرومتر SKF	0.1 ميكرومتر	0.50
10 ميكرومتر SKR	0.1 ميكرومتر	0.50
		45.00

الجدول 4. QIAGEN من خطوة واحدة مزيج سيد RT-PCR لGI التنميط الجيني وقسم الإعلام.

اسم	التوالد مجموعة	استخدم	تسلسل (5 'إلى 3')
G1SKF	GI	كتاب تمهيدي	5'-CTG CCC غا TTY GTA AAT GA - 3
G1SKR	GI	كتاب تمهيدي	5'-CCA ACC الوسطى CCA TTR معاهدة الصداقة والتعاون أ - '3
G2SKF	GII	كتاب تمهيدي	5'-المركز الوطني للاستشعار GGG AGG GCG ATC GCA A - 3
G2SKR	GII	كتاب تمهيدي	5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3

الجدول 5. الاشعال المستخدمة في التضخيم من منطقة C من منطقة قفيصة (كوجيما وآخرون، 2002). ⁵

خطوة	درجة الحرارة (درجة مئوية)	الوقت (دقيقة)
1	60	30:00	[كدنا] تجميع
2	96	15:00	HotStart تفعيل طق بوليميريز
3	94	00:030
	52	01:00	40X دورات
	72	00:30
4	72	10:00	الصلب

الجدول 6. الملف الحرارية لTaqman من خطوة واحدة RT-PCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

باستخدام الاقتصادية في منزل طريقة لعزل الحمض النووي من عينات البراز، ونحن الحصول على نتائج متساوية كما هو الحال مع تجارية عدة QIAmp RNA الفيروسي من QIAGEN، وجنبا إلى جنب مع TaqMan RT-PCR وضعت في مختبر لدينا يمكننا الكشف عن مجموعة واسعة من نوفمبر المورثات تنتمي إلى الجهاز الهضمي و...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
جوانيداين الفصيلة	سيغما Adrich	G9277
تريس HCL	سيغما الدريخ	T5941
EDTA	سيغما الدريخ	E5134
السيليكا	سيغما الدريخ	S5631
تريتون X 100	كيماويات BDH	14530
Diethylpyrocarbonate	سيغما الدريخ	D-5758
QIAamp الفيروسي RNA البسيطة كيت (250)	QIAGEN	52906
Quantiالمجلس التنفيذي الانتقالي التحقيق RT-PCR عدة (200)	QIAGEN	204443
QIAGEN خطوة واحدة RT-PCR كيت (200)	QIAGEN	210212
ريبونوكلياز المانع 2000 وحدة	A.Biosystems	N808-0119	2000 unids / قارورة
غير عصا أنابيب Microfuge Rnae خالية	Ambion	AM12450
عالى النقاء الاغاروز 1000	إينفيتروجن	16550-100