تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة

Summary

وصفت عملية التحضير الكامل من عينة المخ لتصوير المسلسل sectioning باستخدام مجهر المسح حد السكين ، لتصور وتحليل البيانات. ويجري حاليا استخدام هذه التقنية للحصول على بيانات مخ الفأر ، ولكنه ينطبق على الأجهزة الأخرى ، وأنواع أخرى.

Abstract

وقد مكنت الاكتشافات الكبيرة في الإنتاجية العالية ، وارتفاع القرار ، وتقنيات الفحص المجهري 3D اقتناء كميات كبيرة من البيانات في القرار submicrometer تشريحي عصبي. واحد من الصكوك الأولى من نوعها تنتج في الدماغ كله على نطاق البيانات هي مجهر مسح السكين الحافة (KESM) ^{7 ، 5 ، 9} ، المتقدمة واستضافت في مختبر المؤلفين. وقد استخدمت KESM إلى الباب والعقول كلها في صورة الفأر submicrometer القرار ، وكشف عن التفاصيل المعقدة للشبكات العصبية (غولجي) ^{1 ، 4 ، 8} ، وشبكات الأوعية الدموية (الهند الحبر) ^{1 و 4} و الخلية توزيع الجسم (نيسل) ³ . ولا يقتصر استخدام الفأرة لKESM ولا الدماغ. لقد نجحنا في تصوير الدماغ الأخطبوط ⁶ ، الرئة الماوس ، والدماغ الفئران. نحن نعمل حاليا على كامل أجنة أسماك الزرد. ويمكن مثل هذه البيانات تسهم إسهاما كبيرا في البحوث connectomics ¹⁰ ؛ لدوران الأوعية الدقيقة والبحوث الدورة الدموية ، والتجسيم للبحث عن طريق ال Øقرع ملف. الدقيق الأرضية الحقيقة

في هذه المقالة ، فإننا سوف تصف خط الأنابيب ، بما في ذلك إعداد العينات (إصلاح ، وتلطيخ ، وتضمينها) ، KESM التكوين والإعداد ، والتصوير sectioning مع KESM ، ومعالجة الصور ، وإعداد البيانات ، والبيانات والتصور والتحليل. وسوف يكون التركيز على إعداد العينات والتصور / تحليل البيانات التي تم الحصول عليها KESM. نتوقع بروتوكول المفصلة التي قدمت في هذه المقالة للمساعدة في توسيع فرص الحصول على KESM وزيادة الاستفادة منه.

Protocol

1. تحضير العينة : غولجي كوكس

1. هذا البروتوكول تتابع عن كثب بروتوكول Mayerich وآخرون. ^7.
2. الماوس C57BL/6J هو تخدير عميق باستخدام التخدير isoflurane نشوق ومقطوعة الرأس ثم.
3. تتم إزالة المخ وضعت في حل تثبيت غولجي كوكس (1 كرومات البوتاسيوم ٪ ، ثاني كرومات البوتاسيوم 1 ٪ ، وكلوريد الزئبق 1 ٪ في الماء منزوع الأيونات).
4. ويترك الدماغ في حل غولجي كوكس في الظلام ، في درجة حرارة الغرفة ، لمدة 10 إلى 16 أسبوعا.
5. وتشطف في ماء منزوع الأيونات أدمغة بين عشية وضحاها في الظلام.
6. غير منغمسين في الدماغ تشطف 5 ٪ محلول هيدروكسيد الأمونيوم في الماء منزوع الأيونات لمدة 7 إلى 10 أيام في الظلام في درجة حرارة الغرفة. وكان هذه المرة إعداد مطولة لضمان تسلل الدماغ بأكمله ، بحيث يعجل سوداء كانت لديه فرصة لتشكيل تماما في الأنسجة.
7. يتم شطف الدماغ مرة أخرى في الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات و t50 ٪ و 70 ٪ في الثلاجة (4 درجات مئوية) ، و 85 ٪ ، 95 ٪ (3 تغييرات) ، و 100 ٪ (4-5 تغييرات) في درجة حرارة الغرفة : المجففة من خلال سلسلة متدرجة من الكحول الإيثيلي الدجاجة. ويترك الدماغ في كل حل لمدة 24 ساعة.
8. ثم يتم وضع الدماغ المجففة في الاسيتون (3-4 التغييرات ، كل ليوم واحد) ، يليه خليط araldite - الأسيتون مع araldite إلى الأسيتون نسبة 1:2 ، 1:1 ، 2:1 ، وأخيرا في araldite 100 ٪ (3 تغييرات ، في كل مرة بين عشية وضحاها) ، في الثلاجة (4 درجات مئوية).
9. أخيرا ، تم تضمين المعالجة في الدماغ araldite 100 ٪ وتسخينها إلى 60 درجة مئوية لمدة 3 أيام (راجع بروتوكول التضمين في ابوت وسوتيلو ^2).
   إذا هي جزء لا يتجزأ العينات في وايت LR ثم يتم نقل العينات من الحل الأخير الإيثانول بنسبة 100 ٪ خلال ثلاثة تغييرات من حل الابيض LR التي يتم الاحتفاظ بها في كل الثلاجة بين عشية وضحاها ، وهو الإجراء القياسي قبل البلمرة. تتم ثلاثة تغييرات لضمان تسلل الكامل. العينة هو رالدجاجة تحويلها إلى الأبيض LR الطازجة التي يتم بلمرة في حاوية مغلقة عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، وهو المبلغ المطلوب من الوقت ودرجة الحرارة لالبلمرة المناسبة.
10. التين. 1 يظهر الدماغ غولجي كوكس ملطخة مضمن في Araldite.
11. ثم هي التي شنت كتلة العينة شفي على المعدن الدائري باستخدام عينة الايبوكسي ، وعلى جانبي كتلة قلص عند الضرورة (انظر الشكل 2).

2. تحضير العينة : نيسل

1. الفأر هو الخدر العميق باستخدام الكيتامين وزيلازين (1.7 ملغ الكيتامين / 0.26 ملغ زيلازين بنسبة 20 جرام من وزن الجسم) ثم حقن intraperitoneally perfused transcardially باستخدام 50 مل من درجة حرارة الغرفة الفوسفات مخزنة المالحة (7.4 درجة الحموضة) ، يليه 250 مل من الغرفة درجة الحرارة 10 ٪ مخزنة محايدة الفورمالين (7.4 درجة الحموضة). وأخيرا مع 3.0 سم مكعب من الحبر الهند مخفف.
2. كامل الجسم مع نضح المياه المالحة وتثبيتي ضروري لمسح الدم من القلب والأوعية الدموية والنظام لإصلاح منظمة الشفافية الدولية ssues. نضح مع الحبر الهند أمر ضروري لملء تماما لنظام الأوعية الدموية القلبية.
3. الدماغ الناتجة المجففة ثم من خلال سلسلة من الكحول الإيثيلي متدرج (25 ٪ -100 ٪) وجزءا لا يتجزأ من البلاستيك ثم في araldite بعد بروتوكول 1،8-1،9 في أعلاه. إذا LR الأبيض المتوسط ​​التضمين ثم تبعتها في ذلك البروتوكول و1.10 أعلاه.

4. تحضير العينة : الأنواع عامة وهيئات عامة

1. لحالة عامة ، يمكن القيام تثبيت إما مع 10 ٪ محايد مخزنة بارافورمالدهيد الفورمالين أو 4 ٪.
2. أحجام صغيرة للنسيج ، فمن المستحسن نشر بدلا من نضح لتثبيت وتلوين. في حالة الكائنات الحية الصغيرة أو الأجهزة ، يمكن أن يتم تلطيخ أيضا أثناء عملية الجفاف.
3. بروتوكول التضمين هو نفس أعلاه ، بالرغم من أنه يمكن خفض مرات لتسلل حل للأجهزة أو الكائنات الحية التي هي أصغر بكثير من دماغ الفأر كله.

jove_title "KESM> 5. الإعداد والتصوير

1. إيقاف المضخة ، بدوره على خشبة المسرح ، بدوره على الكاميرا ، بدوره على منار.
2. رفع السكين وموضوعية.
3. تثبيت حلقة العينة.
4. قياس البعد عينة وإنشاء ملف تكوين لتطبيق المرحلة KESM Controller2.
5. بدء المرحلة KESM Controller2 وتهيئة المسرح.
6. انخفاض سكين / الهدف ، تشغيل المضخة.
7. تركز الهدف والكاميرا ، التي تحول مقبض التركيز على تدريب وضبط الحقل البصري للكاميرا وجهة نظر بالنسبة الى حافة السكين.
8. اضغط على [الذهاب] لبدء التصوير.
9. انظر التين. 3-8. انظر ^{9 ، 7} للحصول على التفاصيل التقنية.

6. معالجة الصور وإعداد البيانات

1. نسخ المعالج القابل للتنفيذ KESM المكدس في مجلد البيانات ضمن المجلد ملف التكوين (00000 ، 00001 ، الخ).
2. تشغيل المعالج المكدس KESM لإزالة قطعة أثرية الإضاءة وتطبيع كثافة الخلفية في جميعالصور. أكرر لجميع المجلدات الفرعية البيانات.
3. إعداد البلاط متعددة النطاقات من مجموعة البيانات وتحميلها وإعداد الملفات في الدماغ خادم الويب KESM أطلس.
4. انظر الشكل. 9.

7. بيانات التصور والتحليل

1. التصور باستخدام أطلس الدماغ KESM. انتقل إلى http://kesm.cs.tamu.edu وحدد الأطلس المناسبة.
   1. التنقل كما هو الحال في خرائط جوجل.
   2. التكبير والتصغير كما هو الحال في خرائط جوجل.
   3. للذهاب الى عمق مختلفة ، وتحديد كيفية العميق لتذهب في كل خطوة من القائمة المنسدلة ، ثم انقر على [+] أو بإحدى هاتين العقوبتين -- لزيادة أو نقصان عمق ض [].
   4. ضبط عدد تراكب باستخدام القائمة المنسدلة.
   5. ضبط الفاصل الزمني تراكب باستخدام القائمة المنسدلة.
   6. انظر الشكل. 11.
2. التصور MeVisLab به.
   1. إطلاق MeVisLab.
   2. إنشاء مشروع جديد.
   3. في ما يلي ، يمكن أن يكون إنشاء وحدات جديدة من قبل تايping في اسم الوحدة النمطية في مربع الأوامر.
   4. إنشاء وحدة نمطية [Compose3Dfrom2DFiles] ، وانتقل إلى المجلد المطلوب. أدخل سلسلة الملف وانقر في [GetFileList]. تأكد من أن الصور التي اخترتها يمكن وضعها في الذاكرة. فوق [Create3D] لإنشاء وحدة التخزين.
   5. إنشاء وحدة نمطية [SetWorldMatrix] ، وتعيين "جدول" تحت عنوان "التحويلات الابتدائية" س ، ص ، ض لحجم فوكسل المناسب (0.6 ، 0.7 ، 1.0 لهدف 0.45NA 10X). الرابط [Compose3Dfrom2DFiles] إلى [SetWorldMatrix].
   6. مجموعة مصفوفة والتحويلات تحت عنوان "تكوين مصفوفة" إلى "تجاهل" ، "تجاهل" ، "إلى الأمام".
   7. إنشاء وحدة نمطية [Arithmetic1] ، وتعيين "الفعل" إلى "عكس (IMG ماكس)".
      الرابط [SetWorldMatrix] إلى [Arithmetic1].
   8. إنشاء وحدة نمطية [View3D] وربط [Arithmetic1].
   9. في View3D ، في حين يتم الضغط على زر الفأرة الأيمن ، قم بتحريك الماوس لضبط العتبة. يمكنك المحاصيل المناطق ، وتغيير التوجه (الماوس تتحرك في حين ضغط زر الماوس الأيسر) ، والإضاءة تغيير (حجم renderinز أو MIP) ، تشغيل / إيقاف الخلفية ، الخ.
   10. انظر الشكل. 10.

8. ممثل النتائج :

هنا ، نقدم كامل الدماغ البيانات والتفاصيل. التين. 12-15 تظهر كلها في الدماغ الهند الحبر ، غولجي والبيانات نيسل مجموعات ^{1 و 4 و 3.}

الشكل 1. الثابتة ، الملون ، وجزءا لا يتجزأ من مخ الفأر

الشكل 2. شنت المضمنة عينة مخ ​​الفأر على الحلقة العينة.

الشكل 3 ، والمسح الضوئي حافة السكين مجهر (KESM). وترد صورة للKESM مع مكوناته الرئيسية ملحوظة : (1) سكين الماس عالية السرعة خط تفحص الكاميرا ، (2) الهدف المجهر ، (3) والتجمع ، وميزاء الخفيفة ، (4) جمعية مهندسي البترولcimen دبابات (التصوير غمر المياه) ، (5) ثلاثة محاور الدقة الجوية الحاملة للمرحلة ، (6) منار مجهر الضوء الأبيض ، (7) مضخة المياه (في الظهر) لإزالة الأنسجة مقطوع ، (8) خادم الكمبيوتر لمراقبة المرحلة والحصول على الصور ، (9) قاعدة من الجرانيت ، و (10) جسر الجرانيت.

الشكل 4. مبادئ التصوير من KESM. ويتجلى مبدأ تشغيل KESM. الهدف هو عقد والسكين في مكان ، في حين أن العينات الموضوعة على التحركات مرحلة تحديد المواقع (السهم مع خط الصلبة) في قرار من 20 نانومتر وسرعة سفر 1-5 ، ويحصل على كشط ضد السكين الماس (5 ملم واسعة عن الهدف 10X) ، وتوليد مقطع رقيقة تتدفق على سكين (السهم مع خط الصلبة). ويتم فحص الخط والتصوير القريب جدا من طرف السكين.

الشكل 5. KESM الكاميرا والهدف ضوابط التركيز.

الشكل 6. KESM التجمع سكين والضوابط.

الرقم 7. الأولية التي تركز من خلال منفذ المراقبة.

الرقم 8. KESM المراقب تطبيق المرحلة 2 (الصورة).

الرقم 9. KESM تطبيق المعالج المكدس (الصورة).

الرقم 10. MeVisLab التطبيق (الصورة).

الرقم 11 KESM أطلس الدماغ : واجهة ويب (الصورة).

الرقم 12. KESM الحبر الهند بأكملها في الدماغ البيانات. وتظهر حجم كدسات أميبا KESM البيانات لمجموعة البيانات الأوعية الدموية. (أ) عن قرب من البيانات الأوعية الدموية. عرض ~ 100 ميكرون. (BD) ثلاثة آراء مستوى الأوعية الدموية في الدماغ كله الماوس (subsampled من بيانات عالية الوضوح). ~ 10MM العرض.

الرقم 13. KESM كامل البيانات غولجي مخ الفأر.

الرقم 14. KESM غولجي تفاصيل البيانات.

الرقم 15. KESM كامل البيانات نيسل الدماغ. (أ) عن قرب من Nissl البيانات. ~ 300 ام ^3. (BD) ثلاثة آراء القياسية للمجلس بكامل هيئته دماغ الفأر البيانات نيسل (subsampled من بيانات عالية الوضوح). مقطع عرضي لعرض رؤية واضحة للهياكل الداخلية.

Discussion

وKESM يسمح لمسح submicrometer المستوى من كميات كبيرة من العينات البيولوجية (~ 1 سم ^3). اخذت الخ هذا النوع من حجم كاف لعقد كامل الأجهزة الحيوانات الصغيرة ، مثل العقل والرئتين والقلب والكلى ، وصور من هذه الأجهزة يمكن أن توفر معلومات كمية لم يسبق لها مثيل حول التنظيم الهيكلي لهذه الأجهزة ، وتمكن من النمذجة الحاسوبية الفنية المختلفة جوانب من هذه الأجهزة ، بما في ذلك ديناميات الدوائر والشبكة ، والخصائص الكهربائية ، وديناميات السوائل وتدفق الهواء ، وديناميكية العضلات.

ومن المتوقع أن بروتوكول إعداد العينات وبروتوكول ما بعد تحليل مفصل في هذه المقالة لمساعدة المجموعات البحثية خارج لسهولة الوصول إلى KESM والبيانات الناتجة عن ذلك. فإن بروتوكول العملية KESM مساعدة هؤلاء الباحثين الخارجيين لتقدير الفوائد والقيود المفروضة على هذه الطريقة تصوير فريدة من نوعها.