الجينوم على نطاق الشاشة لأهداف ميرنا باستخدام معرف الهدف المكتبة MISSION

Summary

مكتبة معرف الهدف هو البلازميد ومقرها الجينوم على نطاق جمع من [كدنا] المستنسخة يستخدم لتحديد أهداف ميرنا. هنا علينا أن نبرهن كيفية استخدامه وتطبيقه.

Abstract

تم تصميم المكتبة الرقم المستهدف للمساعدة في اكتشاف وتحديد الأهداف من microRNA (ميرنا). مكتبة معرف الهدف هو البلازميد ومقرها الجينوم على نطاق مكتبة [كدنا] المستنسخة في اتجاه مجرى النهر 3'UTR من انصهار بروتين ثنائي اختيار، ثيميدين كيناز-zeocin (TKzeo). الجولة الأولى من اختيار هو لtransformants مستقرة، تليها مع الأخذ ميرنا من الفائدة، وأخيرا، واختيار لcDNAs تحتوي على هدف وميرنا و. ويتم تحديد cDNAs مختارة من قبل التسلسل (انظر الشكل 1-3 لمعرف الهدف سير العمل المكتبات والمعلومات).

لضمان تغطية واسعة من transcriptome الإنسان، تم إنشاؤها الهدف رقم مكتبة cDNAs عبر بنسبة ضئيلة من DT فتيلة باستخدام مجموعة من الحمض النووي الريبي مجموع المحضرة من أنسجة بشرية متعددة وخطوط الخلية. مما أدى مجموعة [كدنا] 0،5-4 كيلو بايت، مع متوسط ​​حجم 1.2 كيلوبايت، وكانت مستنسخة في البلازميد المزدوج اختيار p3TKzeo (انظر الشكل 4 لخريطة البلازميد). الأهداف الجينات ممثلة في لىويمكن الاطلاع على الموقع الشبكي لbrary سيغما الدريخ. نتائج من التسلسل البورشيد (الجدول 3)، وتبين أن المكتبة تضم 16922 من 21518 جينات فريدة من نوعها في RefGene UCSC (79٪)، أو 14000 الجينات مع 10 أو أكثر يقرأ (66٪).

Protocol

1. ترنسفكأيشن مع مكتبة معرف الهدف واختيار للخطوط الخلية مستقرة

1. Zeocin اقتل المنحنى

ويستخدم لتحديد Zeocin للخلايا transfected ثابت. ومع ذلك، zeocin الزائد يسبب ردود المظهري غير مرغوب فيها في معظم أنواع الخلايا. لذا، لا بد من إجراء تحليل منحنى القتل للوصول إلى الجرعة المميتة الحد الأدنى.

1. لوحة 1.6 × 10 ⁴ خلايا في آبار من لوحة 96-جيدا في 120 ميكروليتر من وسائل الإعلام.
2. في اليوم التالي إضافة zeocin في زيادة تركيزات تتراوح بين 50 ميكروغرام / مل إلى 1 ملغ / مل إلى آبار المناسبة.
3. دراسة الجدوى كل أيام 2.
4. تحل محل وسائل الإعلام التي تحتوي على zeocin كل 3 أيام. وينبغي استخدام تركيز الحد الأدنى من كاشف اختيار الذي يسبب موت الخلية بعد اكتمال الوقت المطلوب لذلك نوع من الخلايا والتجربة. نتائجنا تظهر ان 500 ميكروغرام / مل zeocin هو الأمثل لA549، هيلا، وخلايا MCF7.

2.ترنسفكأيشن مكتبة عبر Nucleofection والاختيار

1. تحديد خط الخلية التي إما لا يعبر أو يعبر عن مستويات منخفضة من ميرنا اهتمامك. وسيتم عرض ميرنا في القسم B لاختيار الهدف بعد التعبير المستقرة للمكتبة الهدف رقم يتحقق.
2. ثقافة / توسيع الخلايا. لقد حصلنا على نتائج ممتازة مع 2 الخلايا × ⁷ 10 في ترنسفكأيشن مكتبة.
3. يعرض للتريبسين الخلايا التي هي في confluency 80٪>، ونقل 2 × 10 ⁷ خلايا لولبية أنابيب معقمة 15 مل تصدرت.
4. trypsinized بيليه الخلايا في 200 XG لمدة 5 دقائق.
5. إزالة المتوسطة وغسل الخلية بيليه مع HBSS أو برنامج تلفزيوني 1X.
6. الطرد المركزي في 200 XG لمدة 5 دقائق، ونضح غسيل.
7. تكرار غسل خطوة من بيليه الخلية.
8. قبل دافئ 6 لوحات جيدة مع 2 مل من المتوسط ​​كاملة عند 37 درجة مئوية.
9. إضافة 2 ميكروغرام من مكتبة معرف الهدف (لا تزيد عن 10 ميكرولتر) لكل أنبوب 0.5 مل لكل ترنسفكأيشن.
10. Resuspend الخلايا في أنبوب 15 مل من فوق مع 100 ميكرولتر من الحل Nucleofection Amaxa (خلية معينة) في الخلايا 2 × ⁶ 10. على سبيل المثال، لمدة 10 Nucleofections إضافة 1 مل من كاشف.
11. رد فعل واحد في وقت واحد، أضف 100 ميكروليتر من الخلايا إلى ميكروغرام 2 من البلازميد. خلط مع ماصة.
12. نقل الخليط إلى كوفيت Nucleofector.
13. إدراج كوفيت إلى صك Nucleofector وتشغيل برنامج الأمثل المناسب لخط الخلية (كفاءة عالية يفضل على بقاء الخلية).
14. شغل ماصة نقل مع مرحلة ما قبل حرارة متوسطة. يستغرق الخلايا في ماصة نفسه ونقل إلى لوحة 6 جيدا. كرر لكل Nucleofection، واحدة لكل بئر.
15. العودة إلى غرفة نمو لحضانة بين عشية وضحاها.
16. في اليوم التالي، تحل محل الخلايا المتوسطة، والسماح لاستعادة لمدة 3-5 أيام.
17. استبدال المتوسطة مع المتوسط ​​الكاملة التي تحتوي على مستوى مناسب من zeocin، كما هو محدد من تحليل منحنى القتل.
18. موخلايا nitor لاختيار zeocin (خلايا الموت).
19. استبدال المتوسطة مع zeocin كل 2-3 أيام.
20. متكدسة مرة في 6 جيدا لوحة، وتجمع، والمرور، وتوسيع الخلايا في جو من القوارير.
21. طول الفترة الزمنية للتوسع من الخلايا غير المستخدم وخط الخلية التابعة لها، ولكن ينصح بشدة لتوسيع خلايا مقاومة zeocin لتوليد البرد الأسهم للكشف عن المستقبل (~ 2-3 أسابيع؛ خط الخلية التابعة).

2. خلايا المكتبة Transfect مع ميرنا التعبير عن بناء، وحدد لخط خلية مستقرة، واختيار أهداف ميرنا

ملاحظة: لم يعد مطلوبا اختيار Zeocin أو المطلوب. قد تعرض الخلايا لzeocin خلال التعبير ميرنا و ganciclovir اختيار (الهدف) يؤدي الى فقدان أهداف ميرنا.

3. بوروميسين، G418، والمنحنيات اقتل Ganciclovir

1. إجراء منحنى القتل لganciclovir مع الخلايا تعبير ثابت مكتبة معرف الهدف ومع بوروميسين أو G418 لنوع البريةالخلايا.
2. لوحة 1.6 × 10 ⁴ خلايا في آبار من لوحة 96-بشكل جيد مع وسائل الإعلام 120 الطازجة ميكرولتر. في اليوم التالي اضافة 0،1 حتي 10 ميكروغرام / مل من puromycin/G418، أو 2-32 ميكرومتر ganciclovir إلى آبار مختارة.
3. دراسة الجدوى كل أيام 2. تحل محل وسائل الإعلام التي تحتوي على كاشف اختيار كل 3 أيام. تركيز الحد الأدنى من كاشف الاختيار الذي يسبب موت الخلية كاملة * بعد الوقت المطلوب، ينبغي أن تستخدم لهذا النوع من الخلايا والتجربة. نتائجنا تظهر ان ،25-1 ميكروغرام / مل بوروميسين هو الأمثل لA549، هيلا، وMCF7 الخلايا، 0.3 ميكروغرام / مل G418 لMCF7 الخلايا و8-16 ميكرومتر ganciclovir هي الأمثل لA549، هيلا، وخلايا MCF7.
   
   * ملاحظة: مع اختيار ganciclovir، قد تكون بطيئة أو أي نمو الخلية دون موت الخلايا كاملة. مراقبة الخلايا على علاج عدة أيام للتحقق من انهم لا تقسيم بنشاط. إذا كان هذا هو الحال بعد ذلك أحمر الفينول في المتوسط ​​لا تزال حمراء. قد يكون من الضروري أيضا إجراء كيtransfected ليرة لبنانية تحليل منحنى الهدف مكتبة معرف الخلايا إذا لاحظت تغييرا في حساسية. ومع ذلك، فإن هذا يجب أن يتم تحديدها على أساس خلية نوع محدد.

4. ترنسفكأيشن ميرنا عبر Nucleofection واختيار الهدف

1. تنمو / توسيع الخلايا المستهدفة مكتبة معرف لبلوغ 2 × 10 ⁷ الخلايا، ويعرض للتريبسين عندما الخلايا في confluency 80٪>.
2. نقل وتصدرت 2 X 10 ⁷ خلايا لولبية 15 مل أنبوب معقم وبيليه في 200 XG لمدة 5 دقائق.
3. إزالة المتوسطة وغسل الخلية بيليه مع HBSS أو برنامج تلفزيوني 1X.
4. الطرد المركزي في 200 XG لمدة 5 دقائق، ونضح غسيل.
5. تكرار غسل خطوة من بيليه الخلية.
6. قبل دافئ 6 لوحات جيدة مع 2 مل من المتوسط ​​الكاملة لكل بئر عند 37 درجة مئوية.
7. إضافة 2 ميكروغرام من التعبير ميرنا البلازميد (لا تزيد عن 10 ميكرولتر) لكل أنبوب 0.5 مل لكل ترنسفكأيشن. البلازميدات Origene التعبير MicroRNA (نيومايسين - Gوقد استخدمت Addgene) بنجاح؛ اختيار 418) أو الجينات ميرنا الذاتية المستنسخة في pBABE-بورو (البلازميد 1764. لهذا الأخير، وكان PCR استنساخ دبوس الشعر ميرنا مع بي بي 200 ~ على جانبي من الحمض النووي البشري.
8. Resuspend الخلايا في أنبوب 15 مل من فوق مع 100 ميكرولتر من الحل Nucleofection Amaxa (خلية معينة) في الخلايا 2 × ⁶ 10. على سبيل المثال: لمدة 10 Nucleofections، إضافة 1 مل من كاشف.
9. رد فعل واحد في وقت واحد، أضف 100 ميكروليتر من الخلايا إلى ميكروغرام 2 من البلازميد. خلط مع ماصة.
10. نقل الخليط إلى كوفيت Nucleofector.
11. إدراج كوفيت إلى صك Nucleofector وتشغيل برنامج الأمثل المناسب لخط الخلية (كفاءة عالية يفضل على بقاء الخلية).
12. شغل ماصة نقل مع مرحلة ما قبل حرارة متوسطة. يستغرق الخلايا في ماصة نفسه ونقل إلى لوحة 6 جيدا. كرر لكل Nucleofection، واحدة لكل بئر.
13. العودة إلى غرفة نمو لحضانة بين عشية وضحاها.
<لى> استبدال الخلايا المتوسطة والسماح لاستعادة لمدة 3-5 أيام.
14. استبدال المتوسطة مع المتوسط ​​الكاملة التي تحتوي على مستوى مناسب من بوروميسين أو G418 كما هو محدد من اختبار منحنى القتل التي أجريت قبل ترنسفكأيشن مع ميرنا بناء.
15. رصد الخلايا لبوروميسين / G418 اختيار (خلايا الموت).
16. استبدال المتوسطة مع بوروميسين / G418 2-3 أيام كل.
17. متكدسة مرة في 6 جيدا لوحة، وتجمع، والمرور، وتوسيع الخلايا في جو من القوارير.
18. طول الفترة الزمنية للتوسع من الخلايا غير المستخدم تعتمد، ولكن ينصح بشدة لتوسيع بوروميسين / G418 خلايا مقاومة لتوليد البرد الأسهم للكشف عن المستقبل (~ 2-3 أسابيع؛ خط الخلية التابعة).
19. استبدال المتوسطة مع المستويات الملائمة للganciclovir (GCV) وبوروميسين / G418، كما هو محدد من اختبار منحنى القتل التي أجريت قبل ترنسفكأيشن مع ميرنا بناء.
20. رصد الخلايا لاختيار (خلايا dyinز، ميرنا الاستهداف وضربة قاضية من TK-زيو).
21. توسيع الخلايا في وجود GCV وبوروميسين / G418.
22. تحضير الحمض النووي الجيني من الخلايا GCV المحدد.
23. PCR تضخيم يدرج مع الاشعال عدة (انظر PCR التضخيم).
24. استنساخ في ناقلات TOPOTA (إينفيتروجن) لتسلسل معيار أو تقديم منتج PCR لتسلسل عميق.

3. PCR-أسهب إدراجات مكتبة مختارة وتسلسل

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء إلى PCR-تضخيم أهداف المكتبة التي نجت من اختيار ganciclovir.

5. جمع ganciclovir الخلايا المحددة للتحضير الحمض النووي الصبغي باستخدام الحمض النووي الجيني GenElute الثدييات Miniprep كيت (رقم الكتالوج G1N10) أو ما يعادلها. نوصي بإعداد الحمض النووي من الأصل خط الخلية التي لا تحتوي على مكتبة الهدف رقم لاستخدامه كقاعدة سيطرة سلبية للمقارنة مع ال DNA من الخلايا المستهدفة المحددة في PCR.

1. PCR صباحاplify الحمض النووي الجيني التمهيدي مع التضخيم (1) والتمهيدي التضخيم 2. لقد تم الحصول على التضخيم الناجحة مع REDTaq في Jumpstart ميكس للخرسانة الجاهزة للرد - لPCR (كتالوج عدد P0982). قد تعظيم الاستفادة من الظروف يكون من الضروري إذا تم استخدام آخر البلمرة. الرجوع إلى الجدول رقم 1 لعينة PCR الإعداد والجدول رقم 2 للظروف الدراجات PCR.
2. حل 2-5 ميكرولتر من منتج PCR على هلام الاغاروز 1٪. وينبغي أن المنتج المتوقع أن تكون لطاخة مع بعض الحمض النووي مرئية النطاقات. مقارنة للسيطرة على PCR المنتج من الحمض النووي الجيني من الخلايا دون هدف المكتبة الهوية.
3. المضي قدما في استنساخ و / أو التسلسل عميق من الناتج PCR. إذا لاحظت أي منتج التضخيم أو غير مطابق للسيطرة على الحمض النووي، وتحسين ظروف تضخيم PCR (أي تركيز التمهيدي، ودرجة الحرارة الصلب، ودورات).

6. استنساخ وتسلسل

ملاحظة: ونحن نوصي بشدة استنساخ PCR المنتجق وأداء ثم تسلسل مستوى من ما لا يقل عن 96 من الحيوانات المستنسخة باستخدام الاشعال التضخيم المنصوص عليها في عدة. وقد تم تنفيذ هذا الإجراء بنجاح باستخدام 96-جيدا الثقافات بين عشية وضحاها وأنظمة تنقية البلازميد. حتى لو كان هو المطلوب تسلسل عميق، ويمكن استخدام النتائج الأولية من استنساخ وتسلسل القياسية باعتباره فحص الجودة لتحديد ما إذا كان هناك ما يبرر على حساب إضافي من تسلسل عميق.

1. تتبع بروتوكول TA استنساخ عدة تصنيع للمنتجات استنساخ التضخيم PCR (أعلاه).
2. تحول إلى استنساخ الخلايا البكتيرية المختصة وحدد بين عشية وضحاها في المتوسط ​​تحتوي على المضادات الحيوية.
3. عزل وتنمو المستعمرات الفردية في الثقافة السائلة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة.
4. تنقية البلازميد. 6.5. إجراء التفاعلات التسلسل مع مبادىء القراءة التضخيم.
5. تحديد الأهداف الجينات بواسطة محاذاة انفجار متواليات مع transcriptome الإنسان (من النصوص المعروفة)، والجينوم البشري (على رواية TRanscripts) *.

* الاستنساخ استكشاف الأخطاء وإصلاحها: إذا كان هناك عدد كبير من الملاحق من التسلسل والتتابع البلازميد، وتحسين ظروف استنساخ / التسلسل على هذا النحو:

• PCR التضخيم المنتج (إدراج) نوعية وكمية
• ربط رد فعل
• إعداد البلازميد (النوعية والكمية)
• تسلسل ظروف التفاعل

4. ممثل النتائج

شاشة مكتبة لمير-373 أهداف
لتقييم أداء المكتبة الهدف رقم البعثة، وقد تم اختيار مير-373 أهداف من خلايا MCF-7 مكتبة التعبير. وقد تم اختيار MCF-7 لأنه يعبر عن القليل او لا يمكن كشفها مير 373 (لا تظهر البيانات). وقد تم اختيار مير-373 لمصلحتها البيولوجية. مير 373 التعبير يعزز غزو الورم والانبثاث في MCF-7، وعادة خط خلية غير النقيلي [2]. وعلاوة على ذلك، مير-373 orthologues من الماوس ويشارك مير 290 العنقودية في فأر الجذعية الجنينيةصيانة الخلية [3]، ومير-373 من أفراد الأسرة، مير-372، ويشجع على إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها [4]. أخيرا، استخدمنا الاصبع الزنك nucleases لإدراج PGK المروج مير-373 التعبير بناء في موقع AAVS1 في خلايا MCF-7، وإنشاء قائمة من الاهداف المحتملة مير-373 بواسطة تحليل ميكروأري الحمض النووي الريبي (لا تظهر البيانات).

وكان transfected مكتبة معرف الهدف في خلايا MCF-7، و تم اختيار عدد ثابت من الخلايا وتضخيمها في zeocin المحتوية على المتوسط. وtransfected ستابلي الخلايا الناتجة (MCF-7 المكتبة) مع التركيبة مير-373 والتعبير عن اختيارها في ganciclovir المحتوية على المديين المتوسط ​​وإثراء للخلايا معربا عن مير-373 أهداف. لاحظنا أن سيطرة سلبية الخلايا مكتبة MCF-7 (بدون مير 373) لا فصل وتصبح تقريب كما هو متوقع عن الخلايا الميتة. غير أنها تتوقف عن النمو، والتي تم الكشف بسهولة لأن الفينول الحمراء التي تحتوي على المتوسط ​​لم يتحول البرتقالي والأصفر كما لوحظ FOخلايا ص معربا عن مير 373 (الشكل رقم 5). وجرى توسيع نطاق الخلايا في ganciclovir المحتوية على المتوسط، وكانت معزولة تسلسل الهدف بواسطة PCR مع الاشعال المرافقة يدرج المكتبة الهدف رقم [كدنا] والحمض النووي للخلايا المعدة من الباقين على قيد الحياة. وكانت منتجات PCR البورشيد التسلسل.

كما هو مبين في الجدول رقم 4، حصلنا على 17740719 القراءات [كدنا]، والتي تم تعيينها إلى 11076 جينات فريدة من نوعها. من هذه الجينات فريدة من نوعها، تم الكشف عن 2898 مع أكثر من 40 مرة، وبالتالي كانت تعتبر الفعالية يمكن الاعتماد عليها. وكان من المتوقع أن ناقلات 13106469 يقرأ لأن الاشعال PCR تستخدم لتضخيم إدراج [كدنا] ما بين 40 و 300 قواعد بعيدا عن موقع الإدراج. على هذا النحو، فمن المتوقع أن تسلسل معظم سيتمخض عن ذلك سيكون من ناقلات على عكس التسلسل أكثر تقليدية عميقة من المواد الجينية. لم يتم تعيين أربعة عشر في المئة إلى إما ناقلات أو [كدنا]، ولكن لم تتوافق مع قاعدة بيانات غير زائدة عن الحاجة NCBI في النوكليوتيدات (أي، مع ضرب تقرير وطني)، و 1٪ فقط لم يكن إدراج [كدنا].

والمقارنة الأولية وجدت أن 10 من الجينات التي تم تحديدها مع فريد الهدف المكتبة معرف هي أيضا في لائحة الأهداف مير-373 التي تم تحديدها سابقا في TarBase (الجدول 5). وقد سبق تحديد هذه مير 10-373 هدفا من قبل ميكروأري مع الحمض النووي الريبي من خلايا هيلا عابر مع الاصطناعية مير-373 تقليد [5]. وعلاوة على ذلك، اكتشفنا هذه الجينات نفسها 10 أسفل ينظم في خلايا MCF-7 معربا عن مير-373 من موقع AAVS1 (لا تظهر البيانات). لذلك، وهذه هي أهداف 10 صحيح على الأرجح مير-373. العمل جار لتحديد خصائص لائحة الاهداف المحتملة ومحاولة للتحقق من صحة يضرب اختيار تجريبيا بواسطة RT-qPCR، طخة غربية، وفحص luciferase المراسل الصحفي.

الشكل 1. سير العمل في المكتبة معرف الهدف. أقسام AC: إلى أقسام في إجراء ارجع. ويتضح كل خطوة وصفها بالتفصيل في التين 2 و 3.

الشكل 2. ترنسفكأيشن واختيار Zeocin. مكتبة معرف الهدف هو مجموعة من البلازميدات (A)، مع كل [كدنا] الإنسان إدراجها في UTR-3'بعد انصهار بروتين كيناز ثيميدين-zeocin (TKzeo؛ الشكل 4). وtransfected الخلايا مع الهدف رقم مكتبة (B)، وسمح لاستعادة لمدة 3-5 أيام. يمكن أن يبني على الاندماج في الجينوم خلال هذه الفترة الانتعاش (C)، والتعبير عن نص مرمز (D). بعد الانتعاش، وتتعرض الخلايا لzeocin (E). خلايا التعبير عن بروتين الانصهار TKzeo من ستابلي متكامل البنى معرف الهدف البقاء على قيد الحياة zeocin اختيار (F). خلايا Untransfected يموت (G). وبالإضافة إلى ذلك، أي الخلايا التي تحتوي على أكثر من غلاف هذا هو هدف لميرنا الذاتية أو أي أوراسكوم تليكوم القابضةإيه عامل وأعرب في الخلية الذي يمنع التعبير عن TKzeo من معرف الهدف التصور سوف يموت (H).

وtransfected الشكل 3. ترنسفكأيشن ميرنا واختيار ganciclovir. الخلايا التي تحتوي على الهدف رقم مكتبة (أي zeocin مختارة الخلايا) مع تعبير microRNA اختيارها بناء (A). خلال الانتعاش، ويمكن أن التصور التعبير ميرنا دمج (B)، وأعرب عن علامة اختيار المشفرة على ميرنا بناء. بعد اختيار لتحقيق التكامل مستقر (C) وتوسيع الخلية، ويتم التعامل مع الخلايا ganciclovir (D). والخلايا المنتجة ثيميدين كيناز (المعارف التقليدية) في حضور ganciclovir (أي الخلايا معربا عن يبني تكن مستهدفة من قبل TKzeo ميرنا) يموت (E) من جهة أخرى، الخلايا التي تحتوي على ثوابت المكتبة مع ما الهدف ميرنا وخائبي لا تنتج المعارف التقليدية، وبالتالي، فإن البقاء على قيد الحياة اختيار ganciclovir (F). يمكن زراعة الخلايا على قيد الحياة، gDNA معزولة، وكدنا] الهدف ميرنا التي تحتوي على مواقع PCR-تضخيم باستخدام بادئات تضخيم الهدف رقم. قد تكون متسلسلة منتجات PCR، وتتماشى مع الجينوم البشري لتحديد أهداف ميرنا.

الشكل 4. خريطة البلازميد والموقع من الاشعال التضخيم. SFI أنا هي المواقع من استنساخ [كدنا].

التمهيدي متواليات

بعثة تضخيم رقم التمهيدي الهدف 1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

بعثة تضخيم رقم التمهيدي الهدف 2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

ig5.jpg "ALT =" الشكل 5 "/>
الشكل 5. تأثير Ganciclovir في نمو الخلايا. وفازت المصنفة أربع وعشرين لوحات بشكل جيد مع 2-100000 MCF-7 أو خلايا MCF-7 الخلايا التي تحتوي على مكتبة معرف الهدف. أربع وعشرين ساعة في وقت لاحق، تم استبدال المتوسطة مع المتوسطة التي تحتوي على 0، 8، أو 16 ميكرومتر ganciclovir. بعد 15 يوما، تم تصويره في لوحة (6 آبار العليا)، ثم آبار غسلها مع HBSS والملون مع زرقة لامعة الحل تلطيخ R (B6529) (6 أدنى الآبار). لاحظ أن ganciclovir له أي تأثير على خلايا MCF-7 بدون المكتبة لأنها لا تعبر عن ثيميدين كيناز (المعارف التقليدية). من ناحية أخرى، وخلايا MCF-7 مكتبة فعل صريح المعارف التقليدية ولكنها ليست تماما من قبل ganciclovir قتل في 8 أو 16 ميكرون، كما يتضح من الخلايا الحية تناول Brillinat الأزرق. ومع ذلك، فإن الخلايا مكتبة لا تتوقف عن النمو في ganciclovir، كما يتضح من لون صبغ أحمر الفينول في المتوسطة الخاصة بهم. القبض على خلايا لا تحمض المتوسطة فيها، ويبقى اللون المحمر بدلا من تغيير أوأنجي أصفر.

الكاشف	حجم / رد الفعل
تحريك رد فعل للخرسانة الجاهزة REDTaq مزيج	10 ميكرولتر
التضخيم التمهيدي 1 (25 ميكرومتر)	0،2 ميكروليتر
برايمر التضخيم 2 (25 ميكرومتر)	0،2 ميكروليتر
الجينومية الحمض النووي	50-200 نانوغرام
المياه، ودرجة الجزيئي	إلى 20 ميكروليتر

الجدول رقم 1.

خطوة	درجة الحرارة.	مرة	دورات
الأولي تمسخ	95 درجة مئوية	5 دقائق.	1
تمسخ	95 درجة مئوية	30 ثانية.	مقلاة = "3"> 40 دورة
* الصلب	62 درجة مئوية	30 ثانية.
تمديد	68 درجة مئوية	2 دقيقة.
نهائي ملحق	68 درجة مئوية	5 دقائق.	1
عقد	4 درجات مئوية	عقد

الجدول 2.

* قد تختلف درجات حرارة التليين، ولكن لاحظنا على أفضل المنتجات والتضخيم مع درجات حرارة تتراوح ما بين الصلب 53 و 64 درجة مئوية.

جدول رقم الهدف 3. محتوى المكتبة من قبل التسلسل البورشيد.

الجدول 4. مير-373 أهداف مختارة من قبل التسلسل البورشيد.

les/ftp_upload/3303/3303table5.jpg "ALT =" الجدول رقم 5 "/>

الجدول 5. 10 الأهداف التي سبق تحديدها من قبل ميكروأري الحمض النووي الريبي.

Discussion

microRNAs هي 20-24 RNAs والنوكليوتيدات التي تنظم التعبير الجيني في مرحلة ما بعد transcriptionally التي تحول دون ترجمة مرنا، وبشكل متكرر، زعزعة استقرار مرنا المستهدفة (النظر في [6]). ويجوز للميرنا واحدة تنظم عدة مئات من mRNAs للسيطرة على استجابة الخلية لمؤشرات التنموية والبيئية. تحديد والتحقق من صحة mRNAs هدف أساسي في تحديد دور ميرنا وظيفة في هذه المسارات. ومع ذلك، وتحديد الهدف ليست مباشرة، لأنه في الحيوانات، miRNAs والمواقع المستهدفة ليست متكاملة تماما. في "البذور" المنطقة، والقواعد من 2 إلى 7 من نهاية 5'-من ميرنا، عادة ما تكون مكملة لأهدافها. ومع ذلك، هناك العديد من الاستثناءات لقاعدة البذور، والمصب قاعدة الاقتران يمكن أن تعوض عن مباراة البذور ناقص. وقد تم وضع عدد من خوارزميات الكمبيوتر للتنبؤ اهداف ميرنا على أساس مطابقة البذور والتعويض المصب، والبنية الهدف 1د موقف، والحفاظ على تسلسل، وغيرها من المعالم المختلفة التي لوحظت للأهداف التحقق تجريبيا (مراجعة في [7]). بينما في silico التنبؤات هي مريحة وتفعل الكثير من تحديد أهداف ميرنا ساري المفعول، وتوقع معظم الجينات فشل التحقق من صحة الاختبارات التجريبية، وعدم توقع الكثير من الأهداف الفعلية. وعلاوة على ذلك، منذ وتستند خوارزميات الكمبيوتر في ملامح الهدف التي سبق تحديدها، أنها لا تسمح باكتشاف الأهداف التي تحيد عن ما هو معروف بالفعل.

وقد تم استخدام عدد من النظم التجريبية بنجاح لتحديد أو اكتشاف الأهداف ميرنا وظيفية في الخلايا الحية. هذه الأساليب تشمل الفحص العالمية ميكروأرس الحمض النووي الريبي والتسلسل، RNA المشترك مناعي (RIP)، ومستقرة وصفها النظائر مع الأحماض الأمينية في ثقافة خلية (SILAC)، وهي طريقة البروتين (مراجعة في [7]). كل أسلوب له مزاياه وعيوبه. منذ ميرنا تستهدف زعزعة الاستقرار في كثير من الاحيان مرنا ويؤدي الى تدهورها، يا خسارةويمكن البحث في زيادة مستوى مرنا بعد إدخال ميرنا تقليد أو المانع، على التوالي، وتحديد الأهداف ميرنا. تم الكشف بسهولة هذه الخسارة أو الربح من مرنا من قبل ميكروأري أو تسلسل عميق. في حين طرق الكشف مرنا هي أبسط وأكثر حساسية من طرق الكشف البروتين، والكشف عن مرنا يغيب عن أي أهداف ميرنا التي ليست متدهورة. التقارير الأخيرة من مختبر Bartell مقارنة النتائج المستهدفة من الكشف عن الحمض النووي الريبي ميرنا مع هؤلاء من SILAC [8] أو التنميط الريبوسوم [9] إشارة إلى أن miRNAs الثدييات التصرف في الغالب عن طريق خفض مستويات مرنا الهدف. ومع ذلك، فقد اكتشفت مختبرات أخرى كثيرة تعمل مع الأهداف الفردية ميرنا تغير في البروتين ولكن أي تغيير في مستوى مرنا. تقارير ما يبدو أن تنظيم متعدية مع عدم فقدان مرنا للكشف ما يلي: مير 10B في HOXD10 [10]، miR221/222 على p27kip1 [11]، مير-21 على Pdcd4 [12]، مير 126 في p85β [13] مير-34 على SIRT1 [14]، مير-21 على PTEN [15]، مير 302d في Arid4b [16]، مير 200C على JAG1 [17]، 567 مير 299، 297، و، والثانية 609 في VEGFA [18]. وعلاوة على ذلك، كلانسي وآخرون [19] ذكرت مؤخرا ان تم الكشف عن تنظيم متعدية فقط بواسطة Let-7 عندما تم الكشف عن الأشكال الإسوية مرنا الفردية التي تحتوي على موقع دعونا-7 الهدف بشكل انتقائي. هذه الأخيرة تشير إلى أنه، على الأقل في بعض الحالات، يمكن التغاضي عن تنظيم متعدية في لمحة مركب - وهذا هو، عندما يتم الكشف عن جميع الأشكال الإسوية مرنا واحدة مرنا - التي تم الحصول عليها كما هو الحال مع العديد من ميكروأري والتحليلات تسلسل. وسوف يشارك في مناعي من ميرنا، مرنا المجمعات عبر argonaute (ago2 عادة) أو بروتين آخر يرتبط (الحمض النووي الريبي مناعي، أو RIP) عزل أهداف ميرنا بغض النظر عن آلية التنظيم. وبالإضافة إلى ذلك، RIP بالكشف عن الذاتية، ويفترض من الناحية البيولوجية ذات الصلة، وتفاعلات. ومع ذلك، وليس من المعروف ما إذا كانت جميع التفاعلات ميرنا، مرنا وظيفية، وRIP من شأنه أن يفوت أي أهداف مرنا أن أضم عابر فقط أو تتدهور بسرعة. وعلاوة على ذلك، لا بد من استنتاج محدد ميرنا-مرنا شركاء bioinformatiلأن ساتيا جميع أزواج ميرنا-مرنا شارك في عجل معا. أخيرا، SILAC يحدد مباشرة على المنتج النهائي للتنظيم ميرنا، وهو البروتين نفسه، ولكن غير حساس ويفتقد بالتالي البروتينات النادرة والتغييرات أضعاف صغيرة في مستويات البروتين.

في ضوء القيود الحالية مع الأساليب ميرنا تحديد الهدف، وشعرنا بان من الضروري ايجاد فحص إضافي العالمي لتحديد أهداف ميرنا الفنية من خلال آلية بديلة. لتلبية هذه الحاجة، مرخصة لدينا التكنولوجيا التي اخترعها Gaken يوب والعظيم Mohamedali من كينجز كوليدج بلندن. اختراعهم هو التحام اختيار مزدوج البروتين، وعلى وجه التحديد، وكيناز-zeocin ثيميدين الانصهار، والتي تنظمها مكتبة [كدنا] من احتمال تسلسل الهدف ميرنا في 3'UTR لها. ويمكن تحديد خلايا transfected ثابت مع والتعبير عن TKzeo، [كدنا] يبني مع zeocin، كما هو موضح في الشكل رقم 2. بعد تعبر عن ميرنا من مصلحة، يمكن تحديد الأهداف التي ميرنا ووايganciclovir عشر، كما هو موضح في الشكل رقم 3. Ganciclovir يقتل الخلايا معربا عن كيناز ثيميدين، وهذا هو، أي الخلايا معربا عن TKzeo، [كدنا] تفتقر هدفا لميرنا من الفائدة. ويمكن أن تكون معزولة استهدفت [كدنا] من التضخيم PCR من الحمض النووي من الخلايا التي البقاء على قيد الحياة باستخدام ganciclovir الاشعال التي يمكن أن تكون متسلسلة الجناح المنتجات [كدنا]، وPCR لتحديد الأهداف.

لقد قمنا بتطوير تكنولوجيا كلية الملك إلى وسيلة جديدة لتحديد الهوية العالمية، واكتشاف أهداف وظيفية ميرنا الإنسان - معرف الهدف المكتبة البعثة. مع الهدف المكتبة الهوية، ويمكن للمستخدمين عزل أهداف ميرنا من خلال سلسلة من الثدييات خلية ترنسفكأيشن الثقافة وخطوات اختيار الدواء. مكتبة شاملة، ويحتوي على 66-79٪ من الجينات البشرية. النتائج الأولية تشير إلى أن كلا اكتشف سابقا، وكذلك يمكن أن تكون معزولة أهداف جديدة من معرف المكتبة بعثة الهدف.

على الرغم من أن البروتوكول هو من بعض طول،استخدم هدف المكتبة رقم قياسي يتطلب تقنيات مختبر الجزيئية - زراعة الخلايا الثديية، ترنسفكأيشن، واختيار الدواء، PCR، والتسلسل - وبالتالي، ينبغي أن يكون جيدا في وسائل معظم علماء الأحياء. نقترح ان يتم إيلاء الاهتمام الكافي لتصميم التجارب المناسبة، وتحسين ظروف والثقافة، والأهم من ذلك، قبل اختبار كل نوع من الخلايا الجديدة لتحديد مستويات الدواء الأمثل للحصول على خطوات اختيار (قتل، منحنيات) لضمان نجاح مع الهدف المكتبة الهوية.

كما هو الحال مع جميع وسائل ميرنا تحديد الهدف، ومن المستحسن جدا أن يتم التحقق من صحة الأهداف التي تم تحديدها عن طريق فحص مكتبة معرف الهدف مع الأسلوب الثاني، مثل [ميكروأري، qRT PCR، مراسل فحص (أي luciferase المراسل)، أو تحليل الغربية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
في Jumpstart REDTaq للخرسانة الجاهزة	سيغما الدريخ	P0982
Ganciclovir	سيغما الدريخ	G2536
G418	سيغما الدريخ	G8168
بوروميسين	سيغما الدريخ	P9620
توبو TA	إينفيتروجن	KNM4500-01
GenElute الثدييات الجينوم الحمض النووي Miniprep كيت	سيغما الدريخ	G1N10
ك خلية Nucleofection محددةهذا	Lonza
Nucleofector	Lonza	AAD-1001
Zeocin	إينفيتروجن	R250-01
الهدف رقم المكتبة	سيغما الدريخ	MREH01